Marcadores moleculares

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Universidade Federal de Pelotas
Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel
Departamento de Fitotecnia
Centro de Genômica e Fitomelhoramento
Biotecnologia aplicada ao 
melhoramento de plantas – PARTE I
Marcadores Moleculares
Prof. Antônio Costa de Oliveira
Colaboradora: Karine Janner
Marcadores moleculares Biotecnologia Genética e melhoramento 
Até a obtenção das 
técnicas dos marcadores 
moleculares, a 
biotecnologia passou por 
uma série de avanços.
O	homem	fazia	a	seleção	das	sementes	das	
melhores	plantas	para	o	cultivo
Primeira seleção de 
plantas realizada baseada 
nos caracteres 
morfológicos.
Organizou o combate a peste bubônica com o uso de soro.
1 2
Seleção	indireta
Indivíduo com fenótipo resistente
Individuo com fenótipo suscetível
Ø Alelo posicionado
nesse local do perfil;
Ø Dizemos que esse
marcador esta ligado a
um gene que determina
o fenótipo resistente.
O marcador e o
gene sempre vão
ser herdados
juntos.
Princípio	da	análise	de	co-segregação de	marcadores	moleculares	e	
características	de	interesse	econômico.
ØMarcadores	morfológicos
ØBioquímicos
• Isoenzimas
ØDNA
• RFLP
• RAPD
• SSR
• AFLP
• SNP
Gel	de	agarose:	
polissacarídeo
Cuba	eletroforética
Fonte:	aplicação	de	uma	
corrente	elétrica
Eletrodo	negativoEletrodo	positivo
Onde	utilizamos?	RFLP	e	AFLP
Diferenciação	de	individuos:
1)	enzima	corta	nos	mesmos	pontos,	teremos	fragmentos	iguais;
2)Enzima	corta	em	pontos	diferentes	teremos	fragmentos	diferentes;
Por exemplo:
• Plantas 1 e 4 são iguais genotipicamente
• Plantas 2 e 3 são iguais genotipicamente
1						2					3					4						5					
DNA
Clivagem 
com EcoRI
Eletroforese
1						2					3					4						5					
É	a	criação	de	múltiplas	cópias	de	um	fragmento	de	DNA.
Análogo	a	um	evento	de	replicação
Primer ou	iniciador:	Indicam	qual	o	local	do	DNA	que	deve	ser	amplificado	(geração	de	milhões	de	clones).
Termociclador
Fontes	hidrotermais
ü No começo, as reações de PCR eram realizadas
com a enzima DNA polimerase;
üPorém a altas temperaturas, a enzima era
inativada (degradada);
üDescobriu-se uma bactéria que habitava fontes
hidrotermais;
üDNA polimerase que resistia a temperaturas
altas (desenvolve-se a 70°C, mas suporte T°
superiores);
ü Taq polimerase
Conceito: refere-se a uma sequência de oligonucleotidos que marca as extremidades da
sequência do DNA alvo que se pretende sintetizar.
A sequencia do gene
pode-se obter em banco
de dados
Foi	criado	um	primer que	amplifica		um	
gene	especifico.	
Esse	primer foi	utilizado	em	uma	reação	
de	PCR	para	o	DNA	de	cada	uma	dessas	
10	plantas.
Pergunta:	Qual	das	plantas	em	que	
houve	uma	deleção	na	sequencia	do	
gene?
Exemplo: Em qual das plantas houve uma deleção na região do gene ?
M		1			2			3			4			5			6			7			8			9			10
2000 pb
100 pb
Perfil	eletroforetico baseado	em	um	gene
/
Até meados da década de 1960, os marcadores utilizados em estudos de
genética e melhoramento eram baseados em caracteres morfológicos.
Por exemplo: cor amarela do milho × teor de vitamina (o mesmo alelo para 
ambas características: mais fácil selecionar pela cor).
E ocasionalmente é que marcadores morfológicos ligados a genes de importância
econômica eram identificados.
Alguns caracteres de interesse estão associados a outros caracteres 
morfológicos facilmente observáveis :
ØMelhoramento	de	plantas	– caracterização	de	cultivares	
Embora	essa	classe	de	marcadores	seja	de	fácil	monitoramento,	esse	marcador	é	influenciado	por:
Podemos	ter	um	caractere	
bom	mas	outro	ruim.
Base genética: cor amarela do grão de milho (morfológico) × alto teor de vitamina
(interesse) = um gene determina duas características (Pleiotropia) ou dois genes ligados,
características herdadas juntas (Genes ligados).
Mas se no genótipo ocorrer a presença de dois caracteres juntos (planta alta e 
espiga pequena), como saber se tenho um caso de PLEIOTROPIA ou se são 
GENES LIGADOS ?
Mas se no genótipo ocorrer a presença de dois caracteres juntos (planta alta e 
espiga pequena), como saber se tenho um caso de PLEIOTROPIA ou se são 
GENES LIGADOS ?
• Cruzar o indivíduo com outro individuo contrastante.
• Quando houver recombinação, se houver permuta genética
• A ligação dos genes pode ser quebrada
Ø Se for Genes Ligados: pelo menos um indivíduo vai apresentar
recombinação para a característica.
Ø Se for Pleiotropia: todos os indivíduos vão possuir as duas características
juntas (ausência de recombinantes).
Forma	da	semente
Cor	da	semente
Cor	da	flor
Forma	da	vagem
Cor	da	vagem
Posição	da	flor
Altura	do	caule
Pois	a	maioria	dos	alelos	mutantes	são	deletérios
- Isoenzimas são formas múltiplas de uma mesma proteína;
- Mas desempenham a mesma função biológica no organismo;
- Porém possuem mudanças na estrutura da sequencia de aminoácidos;
- Essas mudanças estruturais geram migrações diferentes no gel (alelos diferentes);
- Dessa maneira podemos visualizar o polimorfismo entre os indivíduos.
Isoenzimas
- O efeito de uma modificação alélica é detectado pela diferença na migração
eletroforética devido a variação no ponto isoelétrico ou peso molecular de cada
isoforma;.
• Etapas:
- Extração	de	proteínas	totais	;
- Separação	de	proteínas	por	eletroforese	(peso	molecular	e	PI);
- Coloração	histoquímica	:		
Seletividade	da	técnica:	 Utilização	de	apenas	uma	enzima	(proteína	com	função	catalítica)
para	análise.
Utilização	de	um	substrato		para	a	enzima	específica	degradar
A	reação	de	catálise	emite	uma	coloração.
Substrato	amido:	somente	amilases		vão	
degradar	o	amido.
Exemplo: Diferenciação e seleção de indivíduos de um genótipo
Os	dois	alelos	são	iguais	e	são	selvagens	porque	não	
apresentaram	mutações.	Individuo	homozigoto.
Duas isoformas normais (homozigoto)
Exemplo:	Diferenciação	e	seleção	de	indivíduos	de	um	genótipo
Os	dois	alelos	são	iguais	mas	possuem	uma	
mutação.	Individuo	homozigoto	mutante.
Duas isoformas mutantes (homozigoto)
Duas	isoformas	diferentes	para	a	mesma	proteína
Indivíduos	heterozigotos
Um	alelo	mutante	e	outro	alelo	selvagem.	
Utilização:
- Diferenciação	de	
indivíduos;
- Seleção	de	
indivíduos;
- Caracterização	de	
uma	progênie,	e	muito	
mais.
Duas isoformas diferentes (heterozigoto).
• Vantagens:
- Seleção indireta: se a proteína estiver associada a um fenótipo
- Custo reduzido;
• Limitações
- São influenciadas pelo ambiente: pode não expressar a proteína devido a influencia 
do ambiente;
- Influenciadas pelo estádio de desenvolvimento: a planta necessita de diferentes
proteínas para seu desenvolvimento;
Fragmentos	de	DNA	associados/ligados	ou	responsáveis	por	uma	característica	
genética:
- São	herdados	segundo	a	herança	mendeliana
- Apresentam	polimorfismo	entre	os	indivíduos
Um	marcador	deve	ser	capaz	de:
1) Diferenciar	indivíduos	de	uma	população;
2) Estar	ligado/associado	a	um	gene	de	interesse	(resistência),	a	partir	dai	podemos	
fazer	a	seleção	dos	indivíduos;
Mas	como	saber	se	o	marcador	esta	
ligado/associado	a	um	gene	de	interesse???
Para	saber	isso,	é	necessário	fazer	uma	genotipagem associada	
com	uma	fenotipagem (mapeamento):
Associar	um	perfil	a	um	fenótipo	ou	característica	de	resistência
R S
Polimorfismo: Uma inserção ou
deleção no loco desse gene pode
alterar a função do gene.250pb
Deleção na sequencia que alterou a 
função do gene
O marcador esta ligado a um gene 
de resistência
- Caracteres difíceis de serem avaliados: quando o caractere de interesse não é sempre 
visível na progênie, e além disso quando o caractere tem baixa herdabilidade.
- Seleção precoce: conseguir selecionar as plantas com o alelo de interesse ainda 
quando estão em estágio de desenvolvimento.
- Piramidação de genes: combinação de dois ou mais transgenes ou dois ou mais genes 
nativos em um organismo. O alelos desta combinação podem ser identificados ou 
assistidos por marcadores moleculares na progênie.
- Aumento da eficiência de retrocruzamentos: aumento da probabilidadede conversão 
de indivíduos, elevando o nível de homozigose.
- Caracterização de genótipo: impressão digital
- Seleção de genitores: máxima variabilidade genética
Utilização	dos	marcadores	de	DNA	no	melhoramento	genético
O	principio	dessa	técnica	é	a	diferença	dos	indivíduos	com	base	nos	
cortes	que	a	enzima	de	restrição	realiza.
Exemplo: se eu tenho indivíduos exatamente iguais, a enzima vai cortar nos mesmos
lugares, logo eu terei fragmentos de DNA do mesmo tamanho, e o perfil obtido da
eletroforese será exatamente igual.
O	que	é:
Quando	o	polimorfismo	ocorre:
As sondas serão hibridizadas contra o DNA 
clivado e emitirão fluorescência. Somente as 
sondas homólogas a sequencia de DNA serão 
visualizadas.
Somente alguns fragmentos de DNA serão 
observados.
Auto 
radiografia
1) Diferenciação	de	indivíduos	em	uma	população;
2)	Se	conseguirmos	associar	o	perfil	obtido	a	uma	característica	de	interesse	(resistência)	nos	
podemos	utilizar	para	seleção	de	indivíduos;
DNA 
genômico
Digestão com 
enzima de restrição Eletroforese
Hibridização com 
sondas marcadas
Visualização 
do gel por 
auto 
radiografia
Random Amplified Polimorfism DNA – Polimorfismo de DNA amplificados ao acaso 
DNA dupla fita
Até 4000 pb
Primer
Amplificação pela DNA polimerase
Primer complementar	a	sequencia
Marcadores	
dominantes	são	
utilizados	em	
estudos	de	
diversidade	genética,	
diferenciação	de	
indivíduos	e,	
caracterização	de	
indivíduos	
(fingerprint).
Se	um	dos	alelos	possui	uma	inserção	ou	
mutação,	o	marcador	não	vai	indicar.
Random Amplified Polimorfism DNA – Polimorfismo de DNA amplificados ao acaso 
Random Amplified Polimorfism DNA – Polimorfismo de DNA amplificados ao acaso 
Random Amplified Polimorfism DNA – Polimorfismo de DNA amplificados ao acaso 
• Vantagens:
- Simplicidade	e	rapidez:	criação	de	um	primer sem	precisar	conhecer	a	sequencia	
do	genoma	da	espécie;
• Desvantagens:
- Baixo	conteúdo	de	informação	por	loco:	só	se	identifica	um	do	alelos;
- Indivíduos	heterozigotos	não	consegue	identificar;
Random Amplified Polimorfism DNA – Polimorfismo de DNA amplificados ao acaso 
A técnica:
Baseada em PCR
Como ocorre o polimorfismo:
O	polimorfismo	é	observado
através	da	diferença	no	
tamanho	da	sequencia	
repetida.
19	repetições
12	repetições
19	repetições
12	repetições
Resistência a determinada doença
causada por patógeno:
SSR associado a gene que
determina resistência a doença.
-Genitor	NB4D2	é	suscetível
-Genitor	Nilstari é	resistente	
-F1	heterozigotos
-F2:	podemos	fazer	a	seleção	dos	
resistentes	
Uma inserção ou deleção no loco desse gene pode
alterar a função do gene.
O alelo SSR de Nilstari esta associado ao gene
de resistência.
Formação de uma sequencia microssatélite muito
maior do que seria inicialmente, por isso acontece o
polimorfismo.
DNA	polimerase pode	deslizar	e	
formar	uma	alça	de	repetições.	
O	mecanismo	reparo	irá	apenas	
estender	a	alça.
Fita	molde
Combina	a	técnica	de	digestão	enzimática	com	a	detecção	de	polimorfismo	por	PCR
O	primer é	complementar	a	
sequencia	do	adaptador,	mas	os	
nucleotídeos	seletivos	incluídos	no	
primer permitem	que	apenas	
certos	fragmentos	sejam	
amplificados.
• Vantagens:
- Alto	polimorfismo	gerado
- Grande	poder	de	detecção	de	variabilidade	genética
- Não	requer	informação	prévia	da	sequencia
• Limitações:
- Baixo	conteúdo	de	informação	genética	por	loco	(marcador	dominante)
- Mais	trabalhoso
• Para identificação de um SNP é necessário sequenciamento e comparação
entre os genomas sequenciados
AATGCATTGCGCGA
AATGCATCGCGCGA
• A técnica se baseia no uso de primers que amplificam o fragmento de
sequencia onde esta localizado o SNP, aliado ao uso de fluoróforos:
-quando possui a substituição nucleotídica = cor verde
-quando não possui a substituição nucleotídica = cor amarela
- PCR em tempo real
Proporciona	uma	análise/seleção	mais	rápida	e	confiável
Cruzamento	entre	progenitor	
Susceptível	× Resistente
Cruzamento	da	F1	com	P1:	para	
recuperação	maior	%	do	
genoma	de	P1a	característica	
de	interesse	em	F2.	
F1:	presença	do	alelo,	mas	alta	
%	genoma	P2.
A	partir	daí,	podemos	fazer	o	
monitoramento	do	alelo	de	
interesse	na	progênie
Maior	%	
genoma
Somente	o	alelo,	
menor	%	de	
genoma
Seleção	das	plantas	
resistentes	através	
do	fenótipo
Plantas	cultivadas	
espaçadamente	em	
linhas	para	seleção	
individual
Somente	plantas	desejáveis	
cultivadas	em	linhas	no	campo
Seleção	das	plantas	
resistentes	através	do	uso	
de	marcadores
Alta	probabilidade	de	
levar	as	plantas	com	o	
alelo	resistente	para	o	
campo
Alta	probabilidade	de	
levar	plantas	sem	o	
alelo	resistente	para	o	
campo
Priorizando	um	
nº	menor	de	
indivíduos	nas	
gerações	
subsequentes
Seleção	dos	indivíduos	na	geração	precoce
Menos	tempo	
despendido	para	a	
avaliação
Combinação	de	dois	ou	mais	genes	de	
resistência	em	um	individuo.	
Seleção	apenas	dos	indivíduos	que	são	
resistentes	a	espécie	1	e	a	espécie	2	
Fungo	1
Fungo	2	
Apenas	indivíduos	
homozigotos	devem	ser	
selecionados
- Nesse	caso	o	uso	de	marcadores	tem	grande	impacto.
- Caracteres	quantitativos:		quando	vários	genes	contribuem	para	o	fenótipo	de	
interesse.
- Na seleção realizada através do fenótipo, não é possível garantir a presença de
todos os genes que levam a característica de interesse.
- Grande	vantagem	na	utilização	dos	Marcadores:	análise	rápida	e	precisa	dos	alelos	
para	todos	os	genes	envolvidos	na	característica	de	interesse.
Gene	3 Gene	7 Fenótipo	de	interesseGene	1
Dúvidas?
Karinejanner@gmail.com