Isolamento e observação de cloroplastos

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Aulas práticas de Biologia Celular | 1 /3 
 
Aula P5: ISOLAMENTO DE CLOROPLASTOS A PARTIR DE FOLHAS DE 
ESPINAFRE 
 
OBJETIVOS 
• Observação e isolamento de cloroplastos em células de folhas de espinafre. 
INTRODUÇÃO 
 
O fracionamento celular é um conjunto de procedimentos que levam ao isolamento de organitos 
celulares. O isolamento de um organito celular permite o seu estudo aprofundado como por ex. 
determinar as proteínas que o caracterizam. Para expor os organitos celulares de uma célula vegetal 
é necessário romper a parede celular e a membrana plasmática, o que ocorre quando se maceram as 
células do tecido vegetal num almofariz, na presença de uma solução de homogeneização. Os vários 
constituintes da célula são depois separados por fracionamento. 
 
As técnicas de fracionamento são várias e podem incluir o uso de filtros, a sedimentação por 
gravidade e a centrifugação diferencial. Na centrifugação diferencial, a separação é baseada no 
tamanho e densidade dos organitos celulares. Os organitos mais largos e densos sedimentam com 
uma força centrífuga baixa. Aos organitos mais pequenos e menos densos que ficam no 
sobrenadante é necessário aplicar uma maior força centrífuga durante mais tempo para os obter no 
sedimento. 
 
Figura 1 – Cloroplastos em células vegetais. 
 
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MATERIAL E REAGENTES 
 
• Folhas frescas de espinafres 
• Solução de homogeneização 
o 0.33 M sorbitol 
o 10 mM pirofosfato de sódio (Na4P2O7) 
o 4 mM MgCl2 
o 2 mM ácido ascórbico 
o Ajustar o pH a 6.5 com HCl 
• Solução de suspensão: 
o 0.33 M sorbitol 
o 2 mM EDTA 
o 1 mM MgCl2 
o 50 mM HEPES 
o Ajustar o pH a 7.6 com NaOH 
• almofariz e pilão 
• funil 
• tubos de falcon de 50 ml 
• gaze 
• gelo 
• centrífuga refrigerada 
• microscópio ótico 
 
 
MÉTODO 
 
Parte I 
 
1. Coloque numa caixa com gelo as soluções que vai usar, o almofariz e pilão. 
2. Corte as folhas de espinafre mais frescas e retire as nervuras. 
3. Pese 4 gramas de folhas sem nervuras. 
4. Corte as folhas em pequenas porções. Coloque no almofariz que está na caixa de gelo. 
Adicione 7.5 ml de solução de homogeneização e macere o tecido até obter uma pasta 
homogénea. 
5. Filtre a solução através de uma camada dupla de gaze para um tubo de Falcon de 50 ml com 
a ajuda de um funil. Esprema a gaze para aproveitar toda a solução. 
6. Centrifugue a 1100 rpm durante 1 minuto a 4° C. 
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7. Decante o sobrenadante para um tubo de Falcon de 50 ml e volte a centrifugar a 3000 rpm 
durante 7 minutos a 4º C. 
8. O pellet formado durante esta centrifugação contém cloroplastos. Decante o sobrenadante e 
deite fora. 
9. Ressuspenda o pellet de cloroplastos em 5 ml da solução de suspensão. 
10. Mantenha o tubo com a suspensão de cloroplastos em gelo. 
11. Faça duas preparações, nomeadamente do sobrenadante obtido após a primeira 
centrifugação (passo 7) e da suspensão final obtida no passo 10 e observe ao microscópio 
ótico. 
12. Observe ainda o sobrenadante obtido depois da 2ª centrifugação (passo 9). 
 
Parte II 
 
13. Com a ajuda de um bisturi, faça um corte na página inferior da folha fresca de espinafre e 
retire uma porção de epiderme. 
14. Faça uma montagem em água e observe ao microscópio os cloroplastos. 
15. Desenhe as células observadas. 
 
Tópicos de discussão 
A. Desenhe e compare as observações resultantes das suas preparações. 
B. Faça um pequeno resumo do que aprendeu na aula. 
C. Identificar a finalidade de cada um dos componentes da solução de homogeneização. 
D. Porque não é usado o choque osmótico neste protocolo 
E. Que organelos espera obter nas suspensões obtidas após os passos 5 e 7 e final.