PCR em tempo real

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PCR em tempo real 
Polimerase Chain reaction (PCR) 
• Tenha conhecimentos básicos sobre PCR convencional 
• Tenha conhecimentos básicos sobre a estrutura da molécula 
de DNA 
• Saiba o que são SNPs 
• Saiba o que é e como funciona uma eletroforese 
Conceitos básicos 
• PCR é a mãe de todas as técnicas: praticamente todas as ou-
tras técnicas de biologia molecular utilizaram PCR ao longo de 
seu protocolo 
• Resolve dois problemas: quantidade e especificidade 
• É a capacidade de amplificar (fazer copias) de um ou mais 
fragmentos específicos de DNA milhões de vezes 
Reação de PCR: 
• Os ingredientes (reagentes) são necessários para que uma ou 
mãos moléculas alvo sirvam como molde para o processo de 
amplificação 
• Fatores que favorecem a manutenção da dinâmica da reação: 
variação de temperatura, pH e concentração de sais 
Ingredientes: 
a) DNA molde: é o DNA alvo que será copiado, replicado e ampli-
ficado 
b) DNA polimerase: é a enzima capaz de utilizar uma fita molde 
de DNA para sintetizar (gerar) uma nova fita complementar 
c) Nucleotídeos: são unidades utilizadas pela DNA polimerase no 
processo de síntese das novas fitas 
d) Primers: pequenos fragmentos de DNA de fita simples comple-
mentares e específicos às extremidades do fragmento alvo de 
DNA 
e) Íon bivalente (Mg2+): cofator da enzima DNA polimerase 
 
Passo a passo: 
a) Desnaturação: Aquece a reação a 94°C por 5 minutos para se-
parar, ou desnaturar, as fitas de DNA, ou seja, quebrar as pon-
tes de hidrogênio entre as duas cadeias. Isso proporciona um 
molde de fita simples para a próxima etapa. 
b) Anelamento: Resfria a reação a 55 – 65°C por 30 segundos a 
fim de que os primers possam se ligar às suas sequências 
complementares no DNA molde de fita simples. 
c) Extensão: Eleva-se a temperatura da reação a 72°C por 2 – 5 
minutos para que a Taq polimerase estenda os primers, sinte-
tizando novas fitas de DNA. 
 
 
 
 
Escolha dos primers: 
• Os primers devem ser suficientemente longos para garantir um 
anelamento estável na sequência única do DNA que está 
sendo amplificado 
• Um primer não deve anelar-se como outro, nem fornecer es-
truturas secundárias estáveis 
• A temperatura de anelamento é muito importante, pois per-
mite que o primer se ligue exatamente a sequência de inte-
resse. 
− A temperatura ideal depende da composição de bases e 
do comprimento da sequência 
− Quanto mais Guaninas e Citosinas na sequência, maior a 
temperatura ideal de anelamento, uma vez que o parea-
mento G – C possui 3 pontes de hidrogênio, enquanto o 
A – T possui 2 pontes de hidrogênio. 
 
Aplicações 
• Genotipagem 
• Detecção de patógenos 
• Clonagem 
• Sequenciamento 
Limitações em relação a qPCR 
• Sensibilidade e resolução → o tipo de análise de um produto 
de PCR limita sua sensibilidade e resolução 
• Resultados não quantitativos → é muito difícil quantificar o 
alvo amplificado 
• Processamento após a reação → o produto da PCR precisa ser 
processado a fim de ser analisado 
• Processo manual → de modo geral, todo o processo relacio-
nado à PCR é manual e não pré-otimizado 
Quantitative PCR (qPCR) 
• Utiliza os mesmos “ingredientes” de uma PCR convencional, 
mas adiciona-se um agente fluorescente, o qual permite o 
monitoramento da PCR em tempo real 
− O nível de fluorescência aumenta de maneira proporcio-
nal ao aumento do número de cópias do alvo na reação. 
 
Sondas TaqMan 
• Oligonucleotídeo de sequência específica ao fragmento alvo, 
associada a extremidade 5’, possui uma molécula, chamada 
de Reporter, que se configura como um agente fluorescente 
que será utilizado para detectar a amplificação do alvo. O Re-
porter pode ser de diferentes cores (comprimentos de ondas 
diferentes) 
• Na extremidade 3’, encontra-se uma outra molécula denomi-
nada Quencher, a qual inibe a fluorescência do reporter. Essa 
molécula pode ser fluorescente ou não fluorescente 
• Quando as moléculas Reporter e Quencher estão geografica-
mente próximas uma da outra, acontece uma troca de energia 
entre elas, assim, quando a sonda TaqMan está intacta, a flu-
orescência do Reporter não vai para o meio. 
• A DNA polimerase é capaz de quebrar uma estrutura 5’ e que-
brá-la. Isso ocorre com a sonda TaqMan, de modo que distan-
cia das moléculas Reporter e Quencher aumenta e a troca de 
energia para de ocorrer. Desse modo, o Reporter emite a flu-
orescência. 
 
Note que essa fluorescência só ocorre porque uma molé-
cula de DNA foi formada. 
 
 
Amplificação do DNA durante a qPCR 
• Fase exponencial: a quantidade de DNA alvo duplica a cada 
ciclo, visto que a PCR está funcionando em seu potencial 
máximo. Essa fase da reação é utilizada para análises 
quantitativas 
• Fase platô: quase não há amplificação de DNA alvo, visto a 
escassez de reagentes e acúmulo de subprodutos. Essa fase 
da reação é utilizada para análises qualitativas. 
 
Análises qualitativas 
• Apenas me interessa o produto final, ou seja, se o meu alvo 
amplificou ou não. 
• Exemplos de aplicações de análises qualitativas: 
− Detecção de patógenos 
− Genotipagem de SNPs 
− Identificação de espécies e organismos 
− Detecção de mutações 
Análises quantitativas 
• Interessa saber quanto eu tinha do meu alvo antes da ampli-
ficação acontecer 
• Exemplos de aplicações de análises quantitativas: 
− Análise de expressão gênica 
− Quantificação de carga viral 
− Quantificação de microRNA 
 
• Corrida = qPCR 
• Corredores = amostras 
• Linha de chegada = Threshold 
• Ordem de chegada = ciclo threshold (Ct ou Cq) 
• Velocidade dos corredores = eficiência de reação 
• Quantos ciclos de PCR foram necessários para que a fluores-
cência de cada amostra atingisse o threshold? Quanto MENOR 
o ciclo de PCR MAIOR a quantidade inicial de alvo.