ESTUDO DE CASO- replicação do material genético

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Caso problema: replicação do material genético
 
Nós analisamos o caso e percebemos que a situação apresentada revela falhas na condução da técnica PCR no laboratório por parte do estagiário. Diante disso, Caio se depara com os seguintes problemas: carência de informações sobre a técnica PCR; ausência de fluxo/checklist claro sobre a condução do procedimento; estagiário sem conhecimento pleno sobre a técnica PCR; e comunicação insuficiente entre os membros da equipe.
Essas falhas são corrigíveis e para isso fizemos uma análise do que poderia ajudar na resolução desses problemas, e construímos os objetivos o colega vai listar
 
Lista de objetivos: 1) Identificar as deficiências e limitações do estagiário;
 2) Listar as dificuldades sobre a realização da técnica PCR;
 	 3) Recordar procedimentos e materiais da técnica PCR;
 4) Produzir manual de aplicação do PCR descrevendo o passo a passo;
 	 5) Aplicar o passo a passo da técnica em laboratório virtual (gameficação).
 
QUESTIONÁRIO PARA NIVELAMENTO 
Para identificação das deficiências e limitações do estagiário, será feito um questionário e a partir deste resultado serão listadas as dificuldades sobre a realização da técnica.
1. Classifique como verdadeiras ou falsas as seguintes afirmações:
a) Na técnica de PCR, a etapa de emparelhamento é essencialmente uma hibridação. (V)
b) Em geral, as experiências de PCR, requerem um único primer. (F)
c) A técnica de PCR é constituída por diversas etapas que se repetem por 3 ciclos. (F)
d) Na reação de PCR, durante o processo de polimerização, o DNA neo-sintetizado pode sofrer mutações. (V)
e) Existem diferentes tipos de DNAs polimerases termoestáveis, que podem ser utilizadas indiscriminadamente nas reações de PCR. (F)
 
2. Pretende amplificar por PCR a região reguladora de um gene de B. subtilis, contida na sequência abaixo indicada:
5’ ACTGATGCTAGTGACACCCAG … (150 pb) … ACTTACATTAGGAAATTCAAA 3’
Que primers permitem amplificar a referida região?
 
 i.5’ ACTGATGCTAGTGAC 3’ e 5’ ATTAGGAAATTCAAA 3’
 ii.5’ TGACTACGATCACTG 3’ e 5’ TAATCCTTTAAGTTT 3’
 iii.5’ ACTGATGCTAGTGAC 3’ e 5’ TTTGAATTTCCTAAT 3’
 iv.5’ GTCACTAGCATCAGT 3’ e 5’ TAATCCTTTAAGTTT 3’
 v.5’ GTCACTAGCATCAGT 3’ e 5’ ATTAGGAAATTCAAA 3’
 
3. As DNAs polimerases utilizadas no PCR: 
i. apresentam todas a mesma processividade;
 ii. funcionam todas a temperaturas elevadas;
 iii. têm todas atividade de revisão de provas; 
iv. têm todas atividade polimerásica 3’-5’;
 v. podem apresentar ou não atividade de transferase terminal. 
4. Descreva as etapas principais da amplificação gênica por PCR. Em que medida é que as bactérias termófilas simplificaram a técnica de PCR? _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
5. Escolha a(s) resposta(s) correta(s):
A) Qual das seguintes alíneas é falsa relativamente aos requisitos da reação de PCR?
i. o PCR é uma reação de polimerização em cadeia;
ii. o PCR utiliza curtos primers sintéticos;
iii. o PCR usa uma DNA polimerase para sintetizar o DNA;
iv. o PCR pode ser utilizado para obter grandes quantidades de uma sequência particular de DNA;
v. o PCR não requer conhecimento das sequências de DNA nas regiões que ladeiam a sequência a ser amplificada.
 
b) As DNAs polimerases utilizadas no PCR:
i. apresentam todas a mesma processividade;
ii. funcionam todas a temperaturas elevadas;
iii. têm todas as atividades de revisão de provas;
iv. têm todas as atividades polimerásica 3’-5’;
v. podem apresentar ou não atividade de transferase terminal.
 c) O PCR permite:
 i. amplificar fragmentos de DNA específicos;
 ii. detectar a presença e localizar um fragmento gênico num perfil de restrição de DNA gnômico;
iii. detectar a presença de DNA de um agente patogénico numa amostra clínica aquosa (ex. fluido cérebro-espinal);
iv. detectar a presença e localizar DNA de um agente patogénico dentro de uma célula;
v. detectar mutações específicas.
6. Sobre a utilização da técnica de PCR com a finalidade de diagnóstico molecular, analise as afirmativas a seguir.
I. Uma vez que na reação de PCR se utiliza uma DNA Polimerase dependente de DNA, somente os vírus cujo genoma é constituído por DNA podem ser detectados pela técnica de PCR.
II. É possível detectar microorganismos diferentes em uma mesma reação de PCR, desde que se utilize na reação pares de iniciadores específicos para cada microorganismo que se queira detectar.
III. A utilização da técnica de PCR para diagnóstico molecular terá sempre e somente caráter qualitativo.
Assinale: 
Alternativas
A - se somente a afirmativa I estiver correta.
B - se somente a afirmativa II estiver correta. 
C - se somente a afirmativa III estiver correta.
D - se somente as afirmativas I e II estiverem corretas.
E - se todas as afirmativas estiverem corretas.
7. A tecnologia de reação de polimerase em cadeia (PCR) causou uma verdadeira revolução na biologia, tanto na pesquisa visando o entendimento de processos biológicos fundamentais, como nas áreas aplicadas envolvendo diagnóstico de doenças, melhoramento genético de plantas e biotecnologia aplicada à agricultura. PCR é uma cópia poderosa, que envolve a síntese enzimática in vitro de milhões de cópias de um segmento específico de DNA na presença da enzima polimerase. Um ciclo de PCR envolve três etapas, assinale a alternativa correta.
Alternativas:
A - Desnaturação, anelamento e extensão.
B - Amplificação, anelamento e extensão.
C - Desnaturação, anelamento e enzimática.
D - Desnaturação, estreitamento e extensão.
E - Desestruturação, anelamento e extensão.
8. A reação em cadeia de polimerase (PCR) é utilizada para a amplificação de DNA.
Em relação à técnica de PCR, assinale a alternativa correta.
A - Na etapa de anelamento, ocorre a desnaturação da dupla fita de DNA.
B - Mg + é um cofator necessário para a atividade da DNA polimerase.
C - Os primers são estruturas à base de RNA.
D - A etapa de amplificação envolve a ação da DNA ligase.
MANUAL DE APLICAÇÃO - TÉCNICA PCR
Com intuito de orientar os estagiários para possíveis dúvidas durante a prática da técnica, foi elaborado um manual de aplicação do PCR descrevendo o passo a passo. 
1 Reagentes necessários para reação:
 DNA molde refinado;
Nucleotídeos- desoxinucleotídeos;
Iniciadores (primers sintéticos específicos);
DNA polimerase (Taq); 
Solução Tampão:
Mg2+ (cofator essencial para a atividade da Taq polimerase), água
2 O processo:
Extração
O primeiro passo é pegar o material genético a ser utilizado, que no caso é o DNA. Ele não pode ser alterado e nem contaminado por algum outro reagente que cause um resultado diferente do que se espera da combinação final. Essa extração vai ser aquecida a ponto de ser desnaturada juntamente com a região que precisa ser amplificada.
 
Desnaturação
A desnaturação é dividida em duas partes. Para que essa etapa da técnica de PCR funcione, o manipulador deve adicionar uma base nitrogenada composta por um três fosfato, os oligonucleotídeos (conhecidos como primers, que são as fitas do DNA A,T, C e G) e a polimerase que será usada para promover a reação. A mistura deve ser feita para que o DNA consiga se adequar à consistência e absorva adequadamente as informações genéticas dos outros três materiais.
Em seguida, o manipulador deve pôr a mistura em um aparelho chamado termociclador. Esse aparelho vai promover variações de temperatura específicas na solução tampão em que se encontra o DNA e a mistura. Essa instabilidade na temperatura ajuda a transformar as fitas de DNA em uma única estrutura, em caráter desnaturado. O aquecimento vem primeiro, com temperatura máxima de 95° para que as fitas se separem. Depois vem o resfriamento, com o termociclador apresentandouma temperatura de 50°. E aí entra a fase de anelamento.
 
Anelamento
Das etapas da PCR, o anelamento é a que vai ocorrer a união das fitas de DNA (primers) em cada lado complementar. A partir daí, o trabalho de amplificação começa, uma vez que o molde da nova molécula cresce por conta da combinação dessas complementações. O anelamento ocorre durante o resfriamento no termociclador e, após esse período, o aparelho volta a se aquecer para que a polimerase atue na composição.
 
Polimerização
É a extensão definitiva do DNA. Na técnica de PCR, essa fase já apresenta a polimerase adicionando as bases nitrogenadas. Para que essa extensão ganhe força e consiga reproduzir uma nova molécula, a mistura precisa estar aquecida a uma temperatura de no máximo 72°.
Para se chegar a uma amplificação com nível considerável, são necessárias várias repetições desse processo, com até 30 ciclos refeitos para que a nova molécula se estruture corretamente.
TÉCNICA EM LABORATÓRIO VIRTUAL (GAMEFICAÇÃO)
Para a prática de gameficação da técnica, será utilizado o simulador on-line de PCR desenvolvido em linguagem Python por Fellerman, Shirt-Ediss, Kozyra, Linsley e Lendrem (2018) presente no sítio eletrônico http://virtual-pcr.ico2s.org/pcr/.
O simulador foi especificamente desenhado para introduzir conceitos de experimentos multifatoriais e apoiar o ensino da reação de polimerase em cadeia (PCR). Os treinandos selecionam padrões experimentais e recebem os resultados da simulação com rapidez, permitindo tempestiva interação entre os dados gerados e a análise.
Os treinandos podem selecionar 12 padrões experimentais (ciclo de temperatura, volumes de reagentes e escolhas de polimerase) com o objetivo de maximizar os resultados e a pureza do DNA.
Os passos do simulador de PCR são os seguintes:
1 - Implementação: O simulador recebe os dados do treinando e o “servidor”, após as requisições, executa o experimento virtualmente e retorna os resultados ao treinando.
2 - Modelagem e amplificação do DNA por PCR: A simulação é realizada com base em equações diferenciais e integrais da reação, que são reguladas pelo ciclo de temperatura e as concentrações dos reagentes iniciais selecionados pelo treinando. A concentração dos reagentes é determinada pelas pipetas virtuais com base em valores aleatórios dentro dos limites das pipetas mais comuns. Dessa maneira, o modelo captura as “espécies” de DNA que foram fundidas e processadas, as ligações e desacoplamento da polimerase, a extensão do primer e a consequente degradação da polimerase. As taxas dessas reações são dependentes da temperatura previamente estabelecida. O modelo, assim, captura os parâmetros de respostas do PCR de acordo com os padrões previamente estabelecidos e retorna resultados numéricos em poucos segundos.
3 - Análise e interpretação dos resultados: Os dados coletados são analisados eletronicamente a partir de combinações dos padrões experimentais (inputs) e de um “lab book” que congrega dados de todos os experimentos previamente realizados e armazenados. O retorno para análise pelo treinando é uma imagem simulada de eletroforese e uma tabela paramétrica a partir da qual a interpretação pode ser feita. Um resumo dos experimentos (fatores e respostas) podem ser salvos e baixadas em computador no formato csv para eventual análise off-line e planejamento experimental.
	
Figura 1: Interface do usuário - início
	
Figura 2: Interface do usuário - resultado