PCR Convencional x qPCR

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A reação em cadeia da polimerase (PCR
– Polymerase Chain Reaction) é uma
técnica de biologia molecular
revolucionária, pois permitiu o rápido
desenvolvimento do estudo de
sequências de ácidos nucléicos,
proporcionando grandes avanços em
diversas áreas do conhecimento. O
diagnóstico de doenças infecciosas dos
animais é realizado, historicamente, com
técnicas que avaliam características
fenotípicas do patógeno. No entanto, o
estado da arte do diagnóstico de doenças
infecciosas sofreu mudanças significativas
nessas últimas décadas após o
adventoda PCR. Possui capacidade de
detectar agentes infecciosos com alta
sensibilidade e especificidade, sem
necessidade de encontrar microrganismos
viáveis na amostra biológica.
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A técnica de PCR promove, por meio de
etapas de variação de temperatura, a
duplicação de cadeias de DNA in vitro. A
reação de amplificação de DNA por PCR
envolve o emprego dos quatro
nucleotídeos (dNTP’s) do DNA,
sequências iniciadoras (primers) e uma
DNA polimerase termoestável. Assim, é
possível a obtenção de muitas cópias de
uma sequência específica de ácido
nucléico, a partir de uma fita molde.
Desde a introdução da técnica de PCR,
rápidos avanços nas técnicas de genética
molecular tem revolucionado a prática da
patologia, anatomia e análises clínicas. As
técnicas moleculares são agora aplicáveis
a todas as áreas do laboratório clínico.
Existem 3 etapas que compreendem a
reação de PCR:
1. Desnaturação – O DNA gnômico
contendo a sequência a ser amplificada é
desnaturado. Ou seja, ocorre a separação
da dupla fita de DNA.
● A temperatura de anelamento
usada na PCR depende do
comprimento e composição
(citosina/guanina) dos primers;
● Idealmente, a temperatura de
anelamento deve ser 1 a 5 ºC
abaixo da temperatura de melting
(Tm - Temperature melting) , que é
a temperatura na qual 50% das
moléculas do conjunto primer/DNA
estão separadas e as outras 50%
estão ainda hibridizadas;
● temperatura de anelamento baixa
demais produz pouca
adstringência, resultando em
amplificação de fragmentos
inespecíficos;
● uma temperatura de anelamento
muito acima da Tm, pode impedir
o anelamento dos primers,
resultando em pouco ou nenhum
produto amplificado;
2. Anelamento ou Hibridização – os
iniciadores ou primers se ligam a fita de
DNA que se pretende amplificar. Um deles
é complementar à sequência em uma fita
da dupla-hélice de DNA e o outro é
complementar à sequência na outra fita.
São eles que irão identificar/marcar qual
trecho de interesse do DNA deverá ser
copiado.
3. Extensão ou polimerização – com o
ponto de partida já identificado, a Taq
polimerase liga-se a fita sinalizada pelo
primer, complementando-a. Inicia-se
então a extensão do novo fragmento de
DNA, formando novamente uma fita dupla
de DNA.
● A reação de amplificação é
catalizada pela TaqDNA
polimerase (enzima termoestável
extraída da bactéria extremófila
Thermus aquaticus que é
encontrada em fontes
hidrotermais), a qual alonga um
pequeno fragmento de DNA de fita
simples, chamado de
oligonucleotídeo iniciador ou
primer, quando este, por sua vez,
encontra-se ligado a uma fita
molde de DNA.
● Por ser uma enzima termoestável,
a Taq DNA polimerase permite a
realização de múltiplos ciclos de
reação, com uma única adição de
enzima, o que possibilitou a
automatização da reação e
consequentemente a
generalização de seu uso. A Taq
DNA polimerase suporta
temperaturas de 95ºC e é mais
ativa entre 70ºC e 75ºC,
temperatura em que o pareamento
entre os iniciadores e o DNA é
mais específico
● O alongamento é feito pela adição
na extremidade 3’ do iniciador, do
nucleotídeo complementar ao
nucleotídeo correspondente na fita
molde. O fragmento amplificado
pela PCR é aquele compreendido
entre as duas extremidades 3’ de
um segmento duplex,
complementares aos dois
iniciadores utilizados na reação.
● Os iniciadores ou primers são fitas
de DNA geralmente com 18-22
nucleotídeos (A, T, C, G)
sintetizados in vitro, tendo como
base uma sequência de
nucleotídeos complementares às
sequências que delimitam o
fragmento de ácido nucléico a ser
amplificado.
Esse ciclo é realizado inúmeras vezes até
atingir milhões de cópias. Na PCR
convencional, a detecção do produto de
amplificação normalmente é feita em
eletroforese em gel de agarose. Após a
coloração, ocorre a visualização do DNA
pesquisado.
A tecnologia de PCR em Tempo Real
(qPCR) é uma evolução do método de
PCR (Polymerase Chain Reaction ou
Reação em Cadeia da Polimerase). Seu
princípio se baseia na duplicação de
cadeias de DNA “in vitro” que pode ser
repetida diversas vezes, gerando
quantidade de DNA suficiente para
realizar diversas análises. Com apenas
um único fragmento de DNA é possível
reproduzir milhões de cópias.
A PCR foi desenvolvida no final dos anos
80 por Kary Mullis que posteriormente
ganhou o Prêmio Nobel de Química pelo
feito. Além de revolucionar as técnicas de
genética molecular, sua aplicação
compreende várias áreas como
identificação genética, medicina forense,
análises clínicas, diagnóstico de doenças,
controle de qualidade industrial, entre
outros.
Os ensaios de PCR em Tempo Real são
muito mais sensíveis, específicos e
rápidos, principalmente quando
comparados aos testes convencionais,
levando de 2 a 3 horas para emitir o
resultado.
Para diagnósticos, são amplamente
utilizados na infectologia clínica para a
detecção de patógenos, identificando
infecções virais e bacterianas, em que a
cultura dos agentes causadores pode ser
muito difícil ou até mesmo impossível.
Este método não depende do isolamento
ou crescimento do patógeno ou da
detecção de uma resposta imune contra o
agente.
Em vez disso, o que é detectado nos
ensaios são as sequências de ácidos
nucleicos dos patógenos. Alguns
exemplos de sua aplicação consistem no
diagnóstico de dengue, infecções
respiratórias, ISTs, anteriormente
chamada de DSTs, e meningites.
É utilizada também no diagnóstico de
doenças genéticas, identificando
mutações e pré-disposição genética para
determinadas doenças, como é o caso da
trombose.
Essa técnica molecular também é
utilizada na oncologia para identificação
do cromossomo Philadeplhia, uma
alteração citogenética que está associada
a algumas formas de leucemia.
Como é realizada a técnica de PCR em
tempo real (qPCR)?
A sigla qPCR significa PCR quantitativa
em Tempo Real, traduzido do inglês Real
Time quantitative PCR ou ainda RT-qPCR.
Isto porque a metodologia permite realizar
a quantificação do alvo durante o
processo de amplificação do DNA.
Para entender completamente o que é a
qPCR precisamos entender primeiro qual
é o processo da PCR.
Atualmente, as técnicas de amplificação e
detecção de ácidos nucleicos estão entre as
ferramentas mais valiosas na pesquisa
biológica.
Cientistas em todas as áreas da ciência da
vida - pesquisa básica, biotecnologia,
medicina, ciência forense, diagnósticos e
muito mais - utilizam esses métodos em uma
ampla gama de aplicações.
A PCR ou Reação em Cadeia da Polimerase
se tornou a pedra angular da biologia
molecular moderna em todo o mundo. A PCR
Real Time (qPCR ou PCR em Tempo Real) é
uma forma avançada da Reação em Cadeia
da Polimerase que maximiza o potencial da
técnica.
Como o nome sugere, a PCR Real Time é
uma técnica usada para monitorar o progresso
de uma reação de PCR em tempo real.
Ao mesmo tempo, uma quantidade
relativamente pequena de produto de PCR
(DNA, cDNA ou RNA) pode ser quantificada.
A PCR Real Time baseia-se na detecção da
fluorescência emitida por uma molécula
repórter que aumenta à medida que a reação
avança.
O aumento da fluorescência ocorre devido ao
acúmulo do produto de PCR (fragmento alvo)
a cada ciclo de amplificação.
A PCR Real Time facilita o monitoramento da
reação à medida que ela progride.
Pode-se detectar quantidades extremamente
mínimas de ácido nucleico do patógeno
investigado e quantificar o produto final com
precisão.
Além disso, não há necessidade do
processamento pós-PCR, como ocorre no
PCR convencional, fator esse que evita
contaminação e economizarecursos e tempo.
Estas vantagens da técnica de PCR Real Time
baseada em fluorescência revolucionaram
completamente a abordagem da quantificação
do DNA e RNA baseada em PCR.
Os testes de PCR Real Time são fáceis de
executar, apresentam sensibilidade e
especificidade bastante elevadas, e fornecem
escopo para automação.
A PCR Real Time é também referida como
RT-qPCR quando é inserido ciclo adicional de
transcrição reversa, que leva à formação de
uma molécula de DNA a partir de uma
molécula de RNA.
Isso é feito porque o RNA é menos estável em
comparação ao DNA.
De forma geral, a PCR Real Time representa
uma valiosa ferramenta diagnóstica de alto
fator tecnológico agregado.
Além de permitir detecção precoce de agentes
infecciosos em animais doentes, o teste exibe
grande precisão diagnóstica e viabiliza
detecção múltipla de patógenos relacionados a
um problema comum.
Na qPCR, o resultado é visualizado
imediatamente, dispensando a
eletroforese. Isto é possível pela adição
de sondas fluorescentes às reações de
PCR. A amplificação do DNA-alvo é
monitorada durante o processo de qPCR.
A medida que o DNA é amplificado, o
nível de fluorescência cresce
proporcionalmente.
O equipamento é capaz de detectar a
fluorescência eventualmente produzida
pela amostra e assim a técnica permite
acompanhar a reação e a apresentação
dos resultados em tempo real.
Além disso, por meio do monitoramento
da taxa de aumento da fluorescência na
reação de PCR, é possível determinar
com precisão a quantidade de DNA-alvo
presente na amostra original. A qPCR pode
ser utilizada para se avaliar a presença de
um patógeno em uma amostra, podendo ser
um teste qualitativo ou quantitativo.
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A Reação em Cadeia da Polimerase
convencional (PCR ou cPCR) foi
desenvolvida em 1983 por Kary Banks
Mullis.
A técnica produz um grande número de
cópias de uma determinada sequência de
DNA alvo para diversas análises.
O método revolucionou a biologia
molecular, mas foi apenas um ponto de
partida para inúmeros outros
aprimoramentos que atualmente
substituem a PCR convencional com
inúmeras vantagens.
Algumas limitações da técnica cPCR
podem afetar sua aplicabilidade
diagnóstica.
A classificação como detecção end-point
significa que a cPCR demanda uma etapa
extra após a amplificação que
corresponde à eletroforese em gel de
agarose.
O resultado é apenas qualitativo (não
permite quantificação).
O positivo é constatado positivo mediante
visualização de banda no gel com o
tamanho correspondente ao fragmento
amplificado.
Ocorre que, a resolução do gel de
agarose é muito pobre e soma-se a isso,
o fato de haver baixa precisão na
discriminação de tamanho dos fragmentos
amplificados.
Além disso, o processo demanda muito
tempo, o que inviabiliza prazos curtos de
liberação de resultados.
Em adição à baixa precisão e resolução, a
cPCR é bem menos sensível que as
técnicas mais modernas para diagnóstico
molecular.
Outros limitantes correspondem ao
processamento pós-PCR e ausência de
automação, fatores que aumentam muito
a chance de contaminação.
Em contrapartida, a PCR Real Time
(qPCR), considerada uma variação da
técnica convencional, representa a melhor
ferramenta para diagnóstico molecular.
O método é vinculado a um sistema de
monitoramento que quantifica emissão de
fluorescência produzida durante os ciclos
de amplificação.
A qPCR viabiliza amplificação, detecção e
quantificação simultaneamente, agilizando
a obtenção de resultados e minimizando o
risco decorrente de possíveis
contaminações.
O processo é rápido e permite inclusive a
detecção múltipla de sequências-alvo em
uma mesma amostra (qPCR Multiplex).
Comparado à cPCR, a PCR Real time
apresenta maior reprodutibilidade,
especificidade, sensibilidade, precisão e
acurácia diagnóstica, além de também
reproduzir resultados quantitativos, que
são importantes para acompanhamento
de evolução clínica e infecciosa, avaliação
de eficácia terapêutica e inferência para
interferência vacinal a partir de cepas
atenuadas
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Links uteis:
http://www.liaaq.ccb.ufsc.br/files/2013/
10/Aula-1-A-t%C3%A9cnica-de-PCR.p
df
http://www.liaaq.ccb.ufsc.br/files/2013/10/Aula-1-A-t%C3%A9cnica-de-PCR.pdf
http://www.liaaq.ccb.ufsc.br/files/2013/10/Aula-1-A-t%C3%A9cnica-de-PCR.pdf
http://www.liaaq.ccb.ufsc.br/files/2013/10/Aula-1-A-t%C3%A9cnica-de-PCR.pdf
http://www.imt.usp.br/wp-content/uploa
ds/proto/protocolos/aula1.pdf
https://kasvi.com.br/papel-consumiveis
-qpcr/
ghente.org/ciencia/genetica/index.htm
#
Referências:
HAAS, Dionei Joaquim; TORRES, Ana
Caroline Doyle. Aplicações das técnicas
de PCR no diagnóstico de doenças
infecciosas dos animais. Rev Científica
de Medicina Veterinária, v. 14, n. 26,
2016.
Kasvi. PCR em Tempo Real
(qPCR):Aplicação no diagnóstico de
Doenças. Disponivel
em:>https://kasvi.com.br/pcr-em-tempo-re
al-qpcr-diagnostico-doencas/<
Tcsa. O que é PCR Real Time. Disponível
em:
<http://www.tecsa.com.br/posts/artigo/pcr-
real-time>
http://www.imt.usp.br/wp-content/uploads/proto/protocolos/aula1.pdf
http://www.imt.usp.br/wp-content/uploads/proto/protocolos/aula1.pdf
https://kasvi.com.br/papel-consumiveis-qpcr/
https://kasvi.com.br/papel-consumiveis-qpcr/
https://kasvi.com.br/pcr-em-tempo-real-qpcr-diagnostico-doencas/
https://kasvi.com.br/pcr-em-tempo-real-qpcr-diagnostico-doencas/
http://www.tecsa.com.br/posts/artigo/pcr-real-time
http://www.tecsa.com.br/posts/artigo/pcr-real-time