Prova: Extração de DNA, PCR (convencional e tempo real) e Eletroforese em gel.

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2º CHAMADA DE BIOLOGIA MOLECULAR
Curso: Ciências Biológicas – DBIO
Assuntos: Extração de DNA, PCR (convencional e tempo real) e Eletroforese em
gel.
NOME DO ALUNO: Helen Susany Melo da Silva
1. Sobre a PCR convencional descreva: Definição, finalidade e aplicações práticas
da técnica.
PCR é uma técnica usada para amplificar um pedaço de DNA, com o objetivo de gerar
várias cópias de uma determinada sequência. A PCR convencional é uma das formas de
aplicação da técnica e consiste na utilização de: equipamentos termocicladores,
amostras de material genético, primers, nucleotídeos e DNA-polimerase ( taq
polimerase).
O processo acontece, basicamente em 3 fases:
I. DESNATURAÇÃO: Acontece a quebra das pontes de hidrogênio por causa da alta
temperatura ( varia entre 94 °C e 96 °C).
II. ANELAMENTO: Fase em que os primers se ligam as extremidades do segmento de DNA
de onde se pretende fazer a amplificação ( temperatura varia entre 55 °C e 57 °C)
III. EXTENSÃO: Ação da TAQ polimerase preenchendo , com nucleotídeos, a nova fita de
DNA (temperatura 72 °C).
A PCR é usada em muitos laboratórios de pesquisa e também tem aplicações práticas em
diversos segmentos em que se pretende amplificar o DNA, como por exemplo: nas ciências
forenses, em testes genéticos e etc.
2. A qPCR (tempo real) é uma variação da técnica convencional. Em que aspectos ela
difere da cPCR (convencional) e em quais situações o seu uso é indicado? Justifique a
sua resposta com um exemplo prático.
Na PCR convencional, a detecção é feita em eletroforese em gel e só depois o DNA
pode ser observado. A PCR em tempo real, por outro lado, é muito mais sensível que a
convencional, o que permite certa rapidez para a emissão do resultado. Isso porque, o
resultado é visualizado imediatamente, graças à adição e detecção de sondas
fluorescentes durante as reações .
Um exemplo prático da utilização da PCR em tempo real é na sexagem fetal. O
diagnóstico do sexo do feto pode ser feito, analisando se no plasma materno há copias
do cromossomo Y. Esse processo pode ser feito a partir da 8 semana de gestação, o
que necessita de grande sensibilidade da PCR e rapidez ( se a mãe tem interesse em
saber o sexo do bebe a partir da 8 semana, supõe-se que ela anseia pelos resultado o
mais rápido possivel) por isso a utilzação da qPCR é o método mais indicado.
3. Para obtenção do DNA a partir de uma amostra biológica, são realizados diversos
processos laboratoriais. Quais processos são estes? Discorra sobre as etapas que
compõem cada processo.
De forma resumida a extração do DNA pode ser dividida em duas fases:
I. ROMPIMENTO DAS MEMBRANAS;
II. PURIFICAÇÃO DO DNA;
Primeiro há o rompimento dos envoltórios celulares ( lise celular); é necessário, também,
utilizar a proteinase para destruir as enzimas capazes de hidrolisar o DNA; Eliminar os ácidos
nucleicos em que não há interesse ( RNA, por exemplo); remoção dos contaminantes, toda
substância que não for de interesse, que não pretende-se amplificar e a precipitação e
purificação de DNA ( lavagem).
4. Após a realização da PCR, é realizada a etapa de eletroforese em gel. Qual a sua
finalidade? Qual é o princípio físico-químico envolvido neste processo?
A eletroforese tem papel importante na análise laboratorial e também em pesquisas
científicas. Ela permite realizar a separação de macromoléculas como DNA, RNA,
proteínas e enzimas com tamanhos diferentes. A técnica consiste na migração de
moléculas em função de um campo elétrico, quanto maior a molécula, mais lento é
este processo, assim, moléculas de diferentes tamanhos realizam o trajeto de um pólo
a outro em tempo e velocidades diferentes.
5. Cite os cuidados necessários para a obtenção de uma amostra biológica (DNA e RNA)
de qualidade (coleta, transporte, armazenamento etc)
Como na coleta de qualquer amostra biológica, é necessário tomar precauções de
biossegurança. Igualmente, é essencial manter o cuidado ao manusear as amostras, sempre
usando luvas, de maneira a evitar a contaminação de amostras; transportar sempre em
recipiente fechado e garantir a refrigeração durante o seu armazenamento.
6. Um ciclo de amplificação é composto por diversas etapas. Fazendo um paralelo ao
que ocorre 'in vivo', comente sobre cada etapa e sua importância para o êxito da
PCR.
O processo acontece, basicamente em 3 fases:
IV. DESNATURAÇÃO: Acontece a quebra das pontes de hidrogênio por causa da alta
temperatura ( varia entre 94 °C e 96 °C).
V. ANELAMENTO: Fase em que os primers se ligam as extremidades do segmento de DNA
de onde se pretende fazer a amplificação ( temperatura varia entre 55 °C e 57 °C)
VI. EXTENSÃO: Ação da TAQ polimerase preenchendo com, nucleotídeos, a nova fita de
DNA (temperatura 72 °C).
7. Sobre os reagentes necessários para realização da PCR (mix), cite-os e discorre a
finalidade de cada um.
Os principais ingredientes de uma reação PCR são a Taq polimerase, primers, DNA
molde e nucleotídeos . Os ingredientes são reunidos em um tubo, e passam por
repetidos ciclos de aquecimento e resfriamento, o que permite a síntese do DNA.
8. Sobre a qPCR sabemos que o uso do SYBR Green e Sondas são amplamente utilizados
nessa técnica, discorra sobre elas e suas principais diferenças.
Ambos os sistemas podem ser utilizados para detecção e quantificação da PCR. A
TaqMan, ela aumenta a especificidade da reação, mas apresenta um maior custo pela
por utilizar um oligonucleotídeo modificado, já o Sybr Green é um agente inespecífico
e revela qualquer dupla fita durante a reação de amplificação, por isso os ensaios que
utilizam esse agente deve ter um cuidado maior para evitar-se possíveis “erros”
durante o processo.