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Núcleo Lâmina Nuclear (MI) -Filamentos proteícos de lâminas -Espessas fibras M.E. externa do envoltório nuclear tem continuidade com o R.E. Complexo de Poro -Local que ocorre associação da M.E. e M.Interna -Não há massa de cromatina compactada nesses locais - Transporta substâncias (reconhece importina e exportinas) -Formado por milhares de nucleoporinas, dispostas de uma simetria octagonal -Várias dessa nucleoporinas tem a função de ancorar o complexo de poro nas membranas do envoltório (proteínas transmembranas) -Outras nucleoporinas tem um posicionamento mais externo, formando um arcabolso -Outras nucleoporinas formam fibrilas do poro ao citosol, outra para o núcleo formando uma “cesta” -Outras formam um canal central do poro (~60KDa= água passa) Transporte através do complexo do poro = Importação -Algumas proteínas passam (para realizar transcrição,etc) -Proteínas nucleares (exemplo histonas) apresentam sinal de localização nuclear (NLS): (Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val)->Aminoácidos básicos importantes para o reconhecimento -Receptores de importação (importinas) reconhecem NLS -Ran-GTPase participa do transporte Como ocorre: -Proteínas com NLS são reconhecidas por receptores (importinas) formando um complexo, reconhecida pelas nucleoporinas (poro), migrando o complexo (NLS+importina) para o interior do núcleo. - Lá no núcleo a importina se associa com Ran-GTP liberando a proteína com NLS no interior do núcleo - A importina + Ran-GTP se associa novamente ao complexo de poro exportando para o citosol - No citosol ocorre a hidrólise do GTP se transformando em Ran- GDP+Pi, assim a Importina abandona a Ran-GTP ficando livre para recomeçar um novo ciclo Transporte através do complexo do poro = Exportação -Proteínas nucleares apresentam sinal de exportação nuclear (NES): → ( -Met–Glu-Glu-Leu-Ser-Gln-Ala-Leu-Ala-Ser-Ser-Phe-) → presença de aminoácidos hidrofóbicos são importantes para sinais de exportação -Receptores de exportação (exportinas) reconhecem NES -Ran-GTPase participa do transporte, sofrendo hidrólise quando for ao citoplasma (virando Ran-GDP+Pi) liberando a proteína ao citosol -Obs*: todas as proteínas são produzidas fora do núcleo DNAs nucleares: fitas duplas e lineares Estão altamente compactadas com o auxílio de duas proteínas: Histonas (proteínas ricas em aminoácidos básicos Proteínas não-histonica Histonas: H1,H2A,H2B,H3,H4 Histonas+DNA: core nucleossômico Composição : Octâmero de histonas (2 H2A, 2 H2B, 2H3 e 2 H4) DNA: 1 volta e ¾ no octâmero de histonas(147pb) Fibra de 10-11nm As vezes os nucleossomos acabam interagindo formando fibras mais espessas - Associação das caudas(N-terminais) de histonas de cores nucleossômicos adjacentes + Interação com Histonas H1 = Fibra de 30 nm ou solenoide Fibras de 30nm associadas lateralmente: atinge um maior nível de compactação -Alças desses solenoides, se associando, promovida por proteínas não histonicas -Essas regiões mais complexas são chamadas de regiões de heterocromatina +DNA = CROMATINA Várias moléculas de RNA e proteínas não histonicas também compõem o núcleo. Sobre isso, pq o nucléolo é tão evidente? - Não são regiões de heterocromatina -Apresenta vários formatos de pinheiro(NOR), que se refere aos genes transcre- vendo moléculas de RNA r45S -Vários corpúsculos eletrodenso que são complexos enzimáticos que carregam RNA polimerase I -Uma NOR tem dezenas de unidades repetitivas do gene que transcreve RNAr45S -Processamento pós-transcricional inicia antes mesmo de acabar a transcrição -Fibrilas associadas com várias proteínas que estão fazendo o processamento do RNAr, que envolve 3 etapas: 1- Modificação de nucleotídeos e clivagem de segmentos -Metilação em resíduos de pentose -Formação de pseudolidinas -Essas marcações fazem a célula sofrer a clivagem resultando na degradação liberando 3 moléculas de RNAr 2- Associação com proteínas ribossomais (das moléculas de RNA) -Constituindo uma subunidade ribossômica menor -Além da associação de uma RNAr transcrito fora do núcleo se associando formando a subunidade maior do ribossomo -Saem para o citoplasma fazendo a tradução (3etapa) Acúmulo de RNP (RNA associado com proteínas): visível em diversos preparados -Não há membrana delimitando nucléolo -NOR ativa promove a produção de partículas ribossomais (nucléolo é formado) -NORs podem se aproximar (fusão do nucleossomo) Essas regiões não são espalhadas naturalmente, só estão assim pois o nucléolo sofreu um impacto Ciclo Celular (Visão geral e controle) Interfase G1 (GAP 1, mais longo): intensa atividade metabólica, crescimento celular G0: Caso a célula não entre em divisão ela desvia do ciclo entrando em G0, ou seja, é quando ela não recebe sinal para entrar na fase S. Estado quiescente: “não está dividindo, não está se preparando para a divisão -Neurônio está nessa situação (superferenciado e não se divide) S (síntese, mais curto): Replicação do DNA, Síntese de Histonas, Duplicação do centrossomo -Duplicação do DNA: cada molécula de DNA tem regiões: ‘’origem de replicação’’ (diversas) -Encaixa complexo de duplicação G2 (GAP 2): atividade metabólica voltada para a divisão celular. Maior volume do núcleolo. Mitose: cariocinese e citocinese Quanto tempo dura o processo? Totalmente Variável, por meio da citometria de fluxo (mede e quantifica a célula – nesse caso DNA) Como é o controle do ciclo celular? Sistema de interruptores: -Binário(liga/desliga) – eventos complexos -Robusto e confiável – Mecanismo de feedback -Altamente adaptável – respostas específicas em diferentes células Controle do ciclo celular – Pontos de verificação: PARE ou SIGA G1: maiorias das células estão em G1, conclui-se que é a fase mais longa Sistema de controle do ciclo celular Proteínas-chaves (os interruptores) -Ciclina -Sintetizada e destruída ao longo do ciclo celular -Proteína Quinase que fosforila substrato -Quinase dependente de Ciclina (CdK) -Fosforila diferentes substratos A transição entre as fases do ciclo é regulada por diferentes complexos ciclina/CdK De três maneiras pode inativar o complexo ciclina-CdK: 1. Fosforilação: 2. Síntese de Inibidores - CKi: proteína inibidora de CdK quando ligado ao complexo, inativa - Exemplo de CKi: p27 3. Degradação da Ciclina Com o P-inibidor na Cdk torna o complexo inativo Ciclina G1/S – CdK – Fase G1: Prepara a célula para a Fase S, Estimula por fosforilação as moléculas que estão envolvidas na duplicação do centrossomo(microtúbulos), Estimula produção da ciclina S Ciclina S-CdK – Fase S: ativa proteínas que desenrolam o DNA e iniciam sua replicação (sítios de iniciação), na conclusão não ocorre novamente replicação por causa dos complexos de ativação de fosforilados A inibição da G1/S – CdK e S – CdK: previne a célula de iniciar a fase S e de replicar o DNA danificado - P53(guardião do genoma): proteína que quando o DNA está OK ela é degradada nos proteossomas e produzida o tempo todo. -Qualquer dano no DNA, proteínas-cinases fosforilam a p53 (ativa) impedindo que a célula continue (duplicação e fase M) -A p53 ativa se liga à região reguladora do gene p21 induzindo a transcrição do RNA para proteína p21 Proteína p21: inibidora de CdK(interrompendo o ciclo G1), segurando essa célula até que todos os danos sejam corrigidos -Mutação no gene p53 resulta em Câncer -Ocorre principalmente na Metafáse/Anáfase -APC/C (complexo promotor de anafase) fica ativo com uma subunidade ativadora (Cdc20) -Quando ativo recruta enzimas que marcam com ubiquitina a ciclina para ser degradada. Controle da entrada no ciclo em células animais (membrana extracelular) Mitógeno: sinalizador que desencadeia a fosforilação, começando com a proteína Ras -Que ativa proteínasreguladoras gênicas, penetra no núcleo induzindo a produção de proteínas (como ciclinas) -Por sua vez as ciclinas vão progredir a célula no ciclo -Permite a ativação da Proteína E2F que estimulará a transcrição de Genes que atuarão na fase S Ciclo Celular – Fase M Por que o nucléolo desaparece na pro-metafase? Não tem mais transcrição (não tem DNA transcrevendo), portanto não terá rRNA, assim não terá nucléolo Prófase Como acontece a fragmentação do envoltório nuclear? - Complexo ciclina/CdK-M: fosforila diversos substratos (proteínas do citoesqueleto envoltório nuclear) -Isto é: fosforilação de lâminas (A, B e C), desagregando (despolimerização) formando dímeros. -Assim perde-se a sustentação do envoltório nuclear (2 membranas) fragmentando o envoltório nuclear Como acontece o desaparecimento do nucléolo? -Nucleolo é onde se aglomeram as subunidades ribossômicas que estão sendo montadas(esparramar) - Se há condensação das moléculas de DNA não transcreve, se não transcreve não tem rRNA, não tendo ribossomo Condensação dos cromossomos como ocorre? -complexo G1-M;CdK vai fosforilar dois conjuntos de proteínas, responsáveis pela formação dos cromossomos: Coesina: forma um anel em torno das duas cromátides quando na fase S o DNA está se duplicando. Junta as duas cromátides, principalmente, na região do centrômero Condensina: Condensa o DNA para formar cromossomos. Ativada por fosforilação. Grandes hélices de DNA (superhélices) Coesina Condensina Metáfase: fuso mitótico (mucrotubulos) vão carregar os cromossomos até o meio 3 Tipos de microtúbulos: -Astrais: Periferia -Interpolares: saem do centrossomo e encontram os microtúbulos postos no interior da célula, não encontram os cromossomos -Cinetocoro: microtúbulos se ligam aos cromossomos, ligados ao cinetócoro Como os cromossomos param no meio da célula? -Nos microtúbulos as tubulinas vão se afastando ao longo do tempo e novos vão surgindo -Um microtúbulo que está ligado ao cromossomo durante a metáfase não está estável (crescendo e diminuindo de tamanho constantemente) -Mesma distância dos microtúbulos, pois senão microtúbulos de um lado teriam maior probabilidade de aumentar de tamanho -Estabilizados, as cromátides irmãs irão se separar Anáfase Separação das cromátides -Complexo promotor da Anáfase (APC), inicialmente está inativa. A ciclina/CdK-M fosforila uma proteína: cdc20. A cdc20 fosforilada é a responsável por ativar o APC -Complexo Securina/Separase inativa. O APC ativo destroí a securina (por ubiquitinação). Assim a Separase fica ativa. -A Separase destroí a Coesina, assim as cromátides irão se separar Anáfase A: Migração das Cromátides irmãs -Encurtamento dos microtúbulos do cinetócoro, movimento de cromossomos- filhos aos polos, forças geradas principalmente nos cinetócoros -Como continua ligado ao cinetócoro? As proteínas do cinetócoro formam um anel ao redor do microtúbulo (aumento da afinidade) Como se organizam dessa forma? Proteínas- motoras: Dineínas e Cinesina organizam o fuso mitótico e ajudam a carregar os cromossomos para o meio da célula Como o microtúbulo se liga ao cromossomo? Pelo Cinetocoro: estrutura proteíca Anáfase B: ocorre ao mesmo tempo que a anáfase A, afasta ainda mais os polos: -Os microtúbulos astrais estão diminuindo de tamanho, os interpolares estão aumentando de tamanho empurrando os polos mais para longe -Uma força de tração age para separar nas extremidades, favorecendo um maior crescimento Telófase Como acontece a Reconstrução do envoltório nuclear, Reaparecimento do nucléolo, Descondensação dos cromossomos? -Deve ocorrer desfosforilação por FOSFATASES: - Complexo ciclina/CdK-M deve ser inativado -Quem inativa é o APC/C ativo adicionando ubiquitinas ciclina-M, levando a degradação no proteossomo -O Complexo APC/C é um mecanismo de feedback negativo para a própria atuação da ciclina/CdK-M -Desfosforilação das lâminas: reconstituição do envoltório nuclear -Desfosforilação de condensina: descompactação do DNA, permitindo que seja lido novamente ocorrendo a transcrição (reaparecimento do nucléolo). -Como ocorre a recomposição do envoltório nuclear exatamente nos cromossomos? Partes do envoltório migram juntos, sendo um arcabolso para formado Citocinese Ocorre com filamentos de actina e miosina do anel contrátil -Como sabe o lugar de estrangulamento? A posição do centrossomo determina onde irá formar o anel contrátil (experimento pérola de vidro) Núcleo e Atividade Celular Eucromatina: descondensada e distribuída por todo o núcleo (mais clara). Abundante em células interfase ou células com alta atividade biossíntetica proteíca (30nm) Heterocromatina: permanece altamente condensada e é transcricionalmente inativa. Células de Schwan tem bastante já que sintetiza, principalmente, lipídeos de membrana para o axônio (300nm) Heterocromatina Constitutiva: contem sequências de DNA que nunca são transcritas, tais como sequências satélites presentes nos centrômeros, telômeros. Presentem em todas as células (extremidade) Heterocromatina Facultativa: contem sequências que não são transcritas nas células examinadas, mas são em outros tipos celulares. Podem ou não estar inativas, Exemplo: em algumas células como as células musculares não ocorre a síntese de queratina, portanto o gene dessas células para produção de queratina vão estar condensadas, não permitindo o acesso da RNA polimerase Nucléolo (fábrica de ribossomos) Local de transcrição e processamento de rRNA e da produção dos ribossomos. Há alças de diferentes cromossomos que carregam genes para rRNA. Em conjunto com proteínas que são importadas do citoplasma forma as subunidades ribossomais dentro do núcleo (isso faz com que a aparência fique eletrodensa, ou seja, visível) Em células com bastante eucromatina há alta síntese proteíca (+ativa) Morte Celular Por que as células precisam morrer? Processo de fisiologia normal, para manter a harmonia dos tecidos e sistemas. Exemplos: - Provocada pelo Sistema Imune: anticorpos ligam se a patógenos e são fagocitados por outras células do sistema imune - Quando células sofrem injúrias: células que sofreram danos em seu DNA (UV, agrotox) - Alguns tecidos precisam de células mortas para desempenhar sua função: - A epiderme possui células mortas formando uma barreira de proteção (queratina) - O tecido ósseo é formado com base num molde de base hialina num processo de ossificação endocondral. Durante o processo os CONDRÓCITOS do tecido cartilaginoso morrem durante o processo de ossificação endocondral dando lugar aos OSTEOCITOS. - Etapas de desenvolvimento da mão: caso não ocorra a morte celular pode surgir anomalias (polidactilia...) - CÂNCER pode surgir caso as células não morram. ➤ Células cancerígenas podem burlar o mecanismo de apoptose e se replicar, gerando o câncer. Tipos de morte celular: Necrose: morte não programada, causada quando se machuca ou se queima - Células que sofrem estímulos físicos-quimicos e mecânicos extremos. Injurias essas que causam danos na M.P.. Não pode ser prevenidas ou moduladas - Células necróticas incham rapidamente (como consequência da perda da integridade da M.P.) e arrebentam liberando seu conteúdo no espaço extracelular. A necrose provoca uma resposta inflamatória. Apoptose: morte celular programada - Ativadas quando respostas adaptativas à mudanças externas ou internas falham. Correspondem aos pontos de checagem do ciclo celular (como G1, S, G2...) -Envolve uma maquinaria molecular, não gera resposta inflamatória (sem rompimento de membrana). -Perda da aderência (despolimerização e degradação de componentes do citoesqueleto). -Formação de blebs (bolhas) na membrana (resultantes na soltura formando corpos apoptodicos). -Cromatina se solta da lâminanuclear e ocorre clivagem do DNA (endonucleases). - Exposição da fosfatidilserina na face externa da Membrana Plasmática: Em células normais fosfatidilserina está na face citosólica. Os fosfolipídeos fazem os movimentos de flip-flop, que expõem a fosfatidilserina (através da flipase de fosfatidilserina) na membrana externa, quando normalmente fica na face citosólica. Os fagócitos reconhecem a fosfatidilserina e fagocitam a célula (retiram os restos da célula). -Remoção das células mortas e corpos apoptóticos por fagócitos sem gerar compostos inflamatórios. Mecanismos Apoptóticos - Caspases: biossinalização intracelular (proteases) -Transdução de sinal e de clivagem proteolítica celular -Enzimas que clivam as ligações peptídicas presentes entre dois aminoácidos específicos (cisteína-aspatico) Caspases (proteases) - Pró-caspases inativas são ativadas por clivagem em resposta a sinais APOPTÓTICOS - Caspase ativa é enzima capaz de hidrolisar ligações peptídicas entre cisteína e ácido aspático - A primeira caspase ativa é responsável por ativar outras caspases que ativam outras (cascata amplificadora de caspases) -Essas caspases são capazes de clivar filamentos intermediários (lâmina nuclear) e proteínas citosólicas (citoesqueletos) Como a primeira caspase (INICIADORA) é ativada: Há duas vias que são ativadas: -Via Extrínseca -Depende de um ligante (receptor de membrana) presente em uma célula do sistema imunológico (linfócito) que se liga a receptores da célula alvo - A ligação do ligante no receptor recruta uma proteína chamada de adaptadora que por sua vez se liga a uma procaspase iniciadora, sofrendo auto-hidrolise formando dímeros ativos no interior do citoplasma (caspases iniciadora que ativará as caspases executoras) - Essa caspases executoras hidrolisará proteínas citosólicas -Via Intrínseca - Desencadeado pela liberação de citocromo C pela mitocôndria. Sendo ativada quando há danos no DNA, ausência de O2, ausência de sinais de sobrevivência - Citocromo C: conhecida por ser um carreador de elétron na cadeia transportadora de elétron mitocondrial, mas quando é liberada ao citosol atua como um sinalizador de morte celular por apoptose - O citocromo C com a proteína adaptadora (Aparf 1) recruta a procaspase iniciadora que quando ativa as caspases executoras Síntese de Endomembranas Síntese, endereçamento e secreção de macromoléculas Retículo Endoplasmático Liso / Aparelho de Golgi - Permite entender como: células presentes na epiderme conseguem, por exemplo, sintetizar e secretar a melanina para os queratinócitos, síntese e secreção de colágeno (fibroblastos), glicoproteínas secretadas por células calciformes (Intestino delgado), glicoproteínas em glândulas sudoríparas... -Entender o Pâncreas: órgão secretor de hormônios e enzimas digestivas (endócrino e exócrino) Exócrino: hidrolases (enzimas digestivas) / Endócrino: Insulina e glucagon (liberando para a corrente sanguínea) Sistema de Endomembranas 1. Retículo Endoplasmático R.E.L: mais afastado do núcleo e com aspecto tabular fundido e ramificados R.E.R: com ribossomos aderidos e com aspectos achatados e alongados Dependendo do tipo celular o RER ou o REL são mais ou menos desenvolvidos e são locais de produção de diferentes macromoléculas: RER mais desenvolvido: -Fibroblastos: células do tecido conjuntivo que produzem cadeias de protocolágeno, glicoproteínas e proteoglicanos -Células escuras das glândulas sudoríparas: produzem glicoproteínas - Células calciformes: muco - Células exócrinas do pâncreas: produzem enzimas digestivas REL mais desenvolvido: com alta síntese de macromoléculas lipídicas - Glândulas sebáceas: sebo - Células da adrenal: hormônios esteroídes (colesterol é derivado) Retículo Endoplasmático Liso Ocorrência: região apical das células do epitélio intestinal → absorção de ácidos graxos da dieta e formação de TAG e quilomícrons Ácido Graxo → Capturado pelo REL (empacota em partícula lipoproteíca chamada de quilomicrom) → exocitados na região basal → absorvidos nos vasos linfáticos Funções: a) síntese de lipídeos: - Das secreções: hormônios sexuais - Da Membrana Plasmática: Fosfolipideos, Colesterol, Ceramida ÁCIDOS GRAXOS (INCORPORADOS NA BICAMADA DO REL) → TRANSFERASES → ACILTRANSFERASES → FOSFATASES → COLINA TRANSFERASES → FORMANDO A FOSFOATIDILCOLINA Por que não é gerado muito fosfolipídio causando engrossamento do R.E.? - Flipases misturam fosfolipídeos que são sintetizados na lâmina externa colocando de maneira simétrica na Membrana Interna - Flipases fazem com que haja a assimetria da Membrana (fundamental para sobreviver) REL → extenso distribuído em todo o citoplasma → células das glândulas produtoras de lipídeos e derivados (glândulas suprarrenal e sebáceas) b) Síntese de hormônios esteroídes -Grande quantidade de REL em células produtoras -Exemplo: células do testículo e ovário (células da adrenal) -Hormônios esteroídes: são sintetizados a partir do colesterol no REL c) Detoxificação - Reações de hidroxilação que transformam drogas insolúveis em substâncias hidrossolúveis e substâncias tóxicas em substancias inócuas ou de fácil excreção - Ocorre no REL: fígado, rins, pele e pulmões d) Reservatório de Ca2+ -Músculo esquelético (contração muscular) -Neurônio motor no potencial de ação na célula musculas: a resposta intracelular é o aumento de cálcio Retículo Endoplasmático Rugoso RER – PARTE1 Como ocorre a síntese e modificação de proteínas pelo RER Histonas podem estar no citosol para organizarem as proteínas Como ocorre a síntese proteíca? Splicing (retirada dos íntrons), Capeamento (adição de um nucleotídeos modificado na 5’) e Poliadenilação do 3’: Processos importantes para que o RNA possa ser reconhecidos por exportinas e ser enviados para fora do núcleo O mRNA é transportado do núcleo para o citosol através do poro nuclear: Transporte mediado por proteínas de ligação ao quepe 5’, a cauda poli-A e às junções dos éxons (EJC) Exportinas – reconhecidas pelo complexo poro Destino das proteínas: Organelas importam as suas proteínas por diferentes mecanismos. No núcleo é transportado pelos poros nucleares (importinas). Na mitocôndrias, cloroplasto, RE e peroxissomos há um transporte de proteínas pelas membranas. No lisossomo e golgi há um transporte de proteínas por vesículas Golgi: responsável por enderação ou para o lisossomo ou para a MP por transporte vesicular Como as proteínas sabem para onde ir? Há um código químico das macromoléculas - O mRNA é transportado do núcleo para o citosol através do poro nuclear somente após ser corretamente processado Transcrito primário: há vários introns que precisam ser retirados, pois senão é formado uma proteína não funcional No citosol ocorre troca de proteínas (no Cap 5’ e poli A), que estão no citosol que são importantes para a tradução A síntese de muitas proteínas é completada no RER, como é o caso de: Proteínas secretadas, proteínas de membranas, proteínas lisossomais, proteínas do lúmen do RE e do GOLGI Todas começam a ser sintetizadas em polirribossomos livres no citosol e suas sínteses continuam no RER → Processo mediado pelo reconhecimento de sequência sinal por SRPs (partícula reconhecedora de sinal) Proteínas destinadas ao RER: -Possuem uma sequência sinal, com aminoácidos com características APOLAR (leu, val, ala, phe...) -A SRP reconhece a sequência sinal presente na proteína que está sendo sintetizada, ligando-se -Assim a SRP direciona o complexo macromolecular, composto de ribossomos, proteína nascente e mRNA, para o RER -No RER haverá receptores que direciona a proteína que está sendo sintetizada ao canal sintetizador (ou de translocação) -Assim, a SRP se desliga da sequência sinal e a proteína fica interagindo com o canal de translocação -A sequência sinal mantem o canal aberto enquanto a síntese (traduçãodo mRNA) é novamente ativada e a proteína nascente é inserida no LUMEN do RER - Após terminar a síntese, a sequencia sinal é clivada pela peptidase-sinal e a proteína é liberada para o LUMEN do RER - Peptídeo sinal é ejetado do canal e posteriormente clivado -Processo represente a síntese de enzimas e glicoproteínas secretadas no ambiente extracelular Síntese de proteínas Transmembranas -Além da sequência sinal, a proteína tem uma sequência de parada de transferência (aa. Hidrofóbicos) -A sequência sinal reconhecida pela SRP é inserida no canal de translocação, mantendo-o aberto -Quando a sequência de parada (mais hidrofóbica) de transferência entra no canal de translocação, peptidase cliva a sequência sinal, a proteína nascente é ejetada do canal e fica inserida na bicamada lipídica -A sequência sinal é removida e a síntese da proteína (tradução do RNAm) é finalizada na face citosólica (só na síntese de proteínas Transmembranas) -Esse é o caso de síntese de proteínas que vão fazer parte da MP como as moléculas de adesão (caderinas, ocludinas, integrinas..) e proteínas formadoras de canais de membrana (transportadores e receptores) Formas de Tradução -RNAm é ligado por poliribossomos -Ribossomos ligados à membrana (RER) -Uma proteína (plug) se liga a partir do R.E. para fechar o canal inativo Glicosilação de proteínas em resíduos de ASPARAGINA (N-Glicosilação) - a N-glicosilação acontece de maneira catalisada por um enzima presente na membrana no RER chamada de oligossacaril-Tranferase (ausente no citoplasma) -Transfere polissacarídeos de uma molécula de Dolicol Fosfato para resíduos de ASPARAGINA presente na proteína que está sendo sintetizada no Retículo -Processo ocorre no Lúmen Enovelamento e estrutura terciária de proteínas - o que ocorre no RER? Formações de pontes dissulfeto devido ao ambiente oxidante do reticulo - Há também CHAPERONAS, proteínas que auxiliam o encontro de determinados grupamentos para que se interajam (eletrostática, ligação de hidrogênio...) Proteínas (RER) e Lipídeos (REL) sintetizadas no RE podem ser: -Residentes (continuam no RE) -Enviadas para o Aparelho de golgi através de vesículas: processamento e endereçamento Aparelho de Golgi Rodeados por pequenas e grandes vesículas Estrutura: Sacos membranosos achatados e empilhados chamados de cisterna (4 a 6 em cada pilha, podendo variar) -Polos mais estreitos por conta das vesículas -Face Cis: é a extremidade onde chegam vesículas que vem do RE -Face Trans: face por onde sai as vesículas para os destinos finais: lisossomos e membranas -Rede cis do Golgi (CGN), cisternas (cis, medial, trans), rede trans do Golgi Localização: Próximos ao núcleo (Perinuclear) Funções: -Processamento: modificações estruturais de lipídeos e proteínas sintetizadas no RE -Endereçamento: das macromoléculas para lisossomos, membrana, secreção -Separação das pilhas do Golgi: relacionada à função das diferentes cisternas e regiões (conteúdos enzimáticos diferentes em cada região) Modificações estruturais nos Oligossacarídeos N-ligados (inseridos no RER) -Ainda no RER acontece retiradas de unidades de glucose do oligossacarídeo inserido na proteína e depois do correto enovelamento por chaperonas (impede agregação) essa proteína é enviada ao golgi -No golgi ocorre novos processamentos no oligossacarídeo (retirada de manoses): -Adição de N-acetilglicosamida, retirada de manose -Conjunto de reações adicionando unidades de galactose e ácido N- acetilneuroaminico (–) (NANA) O-Glicosilação de proteínas -ocorre em resíduos de serina ou treorina das proteínas -Grupamento OH (hidroxila) -Monossacarídeos inseridos são diferentes do de N-Glicosilação -Também sofrem ação no Golgi de enzimas chamadas de sulfotransferases (sulfatação) -Gerando proteoglicanos compostos glicosaminoglicanos sulfatados -Presentes, portanto, nos proteoglicanos e mucinas Síntese esfingomielina e Glicolipídeos - a partir da ceramida (no retículo) Processamento das hidrolases Lisossômicas -Nos lisossomos há mais enzimas proteolíticas (sintetizadas pelo sistema de endomembranas) -No golgi elas são selecionadas para irem no destino final que é o lisossomo através de uma modificação química -Hidrolases lisossômica=Hidrolases ácidas no Golgi recebem uma etiqueta, fazendo com que sejam reconhecidas na rede trans do Golgi para ir ao lisossomo - Fosforilação de manose em hidrolases lisossômicas (carbono 6 da manose) Endereçamento Endereçamento e distribuição das macromoléculas na rede trans do golgi Exocitose – Secreção -Processo que as vesículas do Golgi se fundem a MP (ambas compartilham propriedades semelhantes) -Autosselagem= agregação da vesícula a MP com os fosfolipídeos -Célula repõe proteínas e lipídeos de membrana e também secreta materiais no exterior Secreção pode ser de dois tipos: a) Secreção Constituitiva - Ocorre de maneira contínua - Ocorre para repor lipídios recém sintetizados, porque, além da exocitose (reposição de lipídeos) a endocitose (consome essa membrana de fosfolipídeos) -Fenômeno explica a não variação de tamanho da célula (membrana) - Lembrando que os lipídeos de membrana são sintetizados no RE liso transportados ao Golgi que sofrem processamento e são empacotados (formam vesículas) - Proteínas de membrana também são levadas (RE rugoso → Golgi → vesículas) - Exemplos de casos de Secreção constitutiva: muco (não precisa de um sinal intra/extra para elicitar a secreção) b) Secreção Regulada - Vesículas só vão se fusionar a MP com algum sinal (hormônio, proteína de adesão, neurotransmissores, etc) - Sinal se liga a um receptor na célula promovendo uma via de transdução de sinal culminando na fusão (EX= Ca2+ no Axônio) Endereçamento e distribuição das hidrolases ácidas aos lisossomos -De que forma as enzimas que vão compor o interior dos lisossomos chegam aos lisossomos -Enquanto a hidrolase atravessa as diferentes cisternas do Golgi ocorre a fosforilação do resíduo de manose específica na hidroxila do carbono 6 da unidade de manose -Quando o fosfato é exposto na região trans golgi consegue se ligar num receptor de manose-6-P (apenas na região trans) -Quando ocorrer a ligação ocorre o brotamento de vesículas que transporta aos lisossomos com fusão No lisossomo: -Quando o complexo é exposto ao pH ácido dos lisossomos ocorre uma dissociação -Hidrolase ácida faz parte dos lisossomos e o fosfato é removido -reciclagem do receptor de Man-6P ao trans golgi a partir de um revestimento (processo cíclico) Processo de Endocitose e Digestão Celular Endocitose: Transporte de compostos bem grandes, como macromoléculas e tembém outras células Transporte em Quantidade: Endocitose/Exocitose ENDOCITOSE Casos: Endocitose de LDL Endocitose de transferrina Endossomo 1ario Endossomo de reciclagem Endossomo tardio Corpos Multivesiculares Lisossomos →EXOCITOSE -Secreção Constitutiva -Secreção Controlada (mediada por sinal) →ENDOCITOSE: captação/internalização -Macromoléculas, substâncias particuladas, outras células (processo é realizado por fagócitos profissionais) -O material a ser ingerido é progressivamente incluído por uma pequena porção da membrana → forma uma vesícula endocítica →Fagocitose: projeção da membrana Plasmática (evagina) →Pinocitose: afundamento de uma porção da Membrana Plasmática (fossa) →Tipos de Endocitose -Fagocitose → Endocitose de partículas grandes, Diâmetro >250nm -Pinocitose (fase fluída) → Endocitose de fluídos e pequenos Solutos, Diâmetro vesicular 100nm - Pinocitose endocitose mediada por receptores → Endocitose de moléculas específicas por vesículas revestidas (clatrina) 100-150nm Diâmetro dos fagossomos é determinada pelo tamanho da partícula ingerida → FAGOCITOSE -Grandes vesículas endocíticas = fagossomos (tamanho da partícula) -Protozoários → Alimentação -Seresmulticelulares → poucas células realizam → Ex: intestinos dos produtos da hidrólise das moléculas da alimentação é que são internalizados -FAGOCITOS PROFISSIONAIS: macrófagos e neutrófilos (células sanguíneas brancas) →Função: defesa do organismo Fagocitose Pinocitose •Pinocitose constitutiva / fase fluída •Pinocitose mediado por vesículas revestidas de clatrina •Pinocitose mediada por cavéolos •Macropinocitose -Fagocitose é um processo mediado por receptores de membrana que se ligam a proteína, glicoproteínas ou carboidratos constituintes da membrana de outra célula, bactéria ou vírus 1ª Etapa: Reconhecimento e Adesão (ex: anticorpos, oligossacarídeos, moléculas específicas – fosfatidilserina) - Adesão - Anticorpos marcam a partícula invasora para fagocitose - A adesão ativa receptores que desencadeiam a montagem de actina (polimerização) do citoplasma, para fazer a projeção da M.P. para englobar o material 2ª Etapa: ativação e emissão dos pseudópodes - Englobam a partícula e se fundem nas extremidades - Polimerização localizada de actina Dentro da Célula -Fusão do Fagossomo com lisossomo no citoplasma, assim o material internalizado é degradado -Muitas moléculas degradadas podem ser reutilizadas -Já os materiais que não podem ser digeridos permanecem nos lisossomos e formam corpos residuais que poder ser exocitados pela célula -Muitos dos componentes de membrana não chegam aos lisossomos pois são recuperados antes por vesículas de transporte que os devolvem a MP Estratégias de Sobrevivência para patógenos fagocitados 1ª Eles fogem da fagocitose pois secretam toxinas que rompem a membrana do fagossomo libertando o parasita da vesícula -Shigella flexneri: causa diarreia Flechas rosas são Pseudopódes (projeções da membrana plasmática) -Listeria monocytogeneses: listeriose (septicemia, meningite, encefalite) -Rickettsia rickettsill: febre maculosa -T. cruzi: Chagas 2ª Inibição da fusão fagossomo-vesícula/enzima. Micro-organismos dentro do fagocito e as enzimas digestivas não conseguem se unir ao fagossomo, matando a célula e liberando o microrganismo -Salmonella Typhimurim: diarreia -Mycob tuberculosis: tuberculose 3ª Inibição da acidificação do fagossomo. O pH ótimo para ação das enzimas do lisossomo é o ácido, caso seja alterado não afeta o patógeno -Bombas do tipo* -Mycobacterium – hanseníase e tuberculose 4ª Replicação dependente de baixo pH -Coxiella burnett – pneumonia, febre Q Pinocitose Maneiras que pode ocorrer: Pinocitose de fase fluída, clatrina, caveolos e macropinocitose →Endocitose – Pinocitose de fase fluída Processo constitutivo (ocorre continuamente, indiferente às necessidades da célula) Independente de clatrina e caveolina →Fossa e vesícula formada sem revestimento, proteínas que fazem a curvatura Parece depender das actinas Formação de vesículas constitutivas e ocorre em altas taxas →Permite que a célula faça o monitoramento da matriz Extracelular e da MP →Turn-over de membrana (quantidade imutável) Processo rápido (macrófago 25% volume/hora ou 3% da membrana/minuto) Entra mais o fluído que está mais presente no meio exterior (aleatoriamente a entrada) → Endocitose – Pinocitose mediada por Receptor Fossa e vesículas formadas tem revestimento por proteínas Presença de receptores que liga-se a molécula/carga específica que deseja que seja internalizada Vesícula (mais estudada) é a revestida por Clatrina →Induz uma curvatura na membrana →Há uma concentração de moléculas cargas na região extracelular próxima a região da membrana curvada, algo que se deve aos receptores da área Bordas da fosse se aproximam (+/- 1 min) Fossas com clatrina: 2% da membrana de uma célula Endocitose – Pinocitose: Clatrina: proteína intracelular -Formato: trisquelion/Tríscele - Vários trisquelion forma uma curvatura e o conjunto fica com aspecto de cesta - Cadeias leves e pesadas Cadeia leves: interagem com filamentos de actina contribuindo para uma tensão que vai auxiliar no brotamento da M.P. e movimentos da vesícula no citoplasma Moléculas Importantes para que o processo ocorra: Quando o receptor se liga na carga a porção interna é alterada (conformação) Passa a interagir com a proteína chapada adaptina (proteína adaptadora), de um lado liga-se a um receptor com uma carga e do outro a clatrina Acúmulo de Clatrina: força uma curvatura na área de membrana, cadeias leves ligam-se a actina Quando a fossa é quase uma vesícula a proteína dinamina atua (enforcando) catalisa a fusão da área da MP destacando a vesícula Perde o revestimento (clatrina + adaptadora) e segue o caminho no citoplasma Endocitose – Pinocitose Cavéolos Forma de garrafa (repolho) O diâmetro da fossa revestida por clatrina é maior que a média da cavéolas Exemplo de célula com bastante Cavéolos: Células Endoteliais →Ocorre processo de Transcitose (quando um material é endocitado de um lado da célula e a vesícula chega de um lado sem sofrer degradação, sem se fundir com organelas com enzimas) → Ocorrendo em células polarizadas (como a endotelial) →Célula que separa tecido conjuntivo de vaso sanguíneo (interior) →Formação dos cavéolos a partir de microdomínios da MP Caveolos contumam ser estáticos →Ficam paradas até que a dinamina destaca ela tornando-se uma vesícula Desse jeito que a célula internaliza →Vírus SV40 e papilomavírus →Região das caveiolas que a toxina cólera acaba se ligando Composição bioquímica (proteína que reveste): Caveolina (proteína integral de membrana) →Ela é auxiliada por um outro tipo de proteína: a cavina (citosólica) As caveólas sempre estão em regiões de Lipid Rafts Funções: Endocitose, Regulação do metabolismo de lipídios, Compartimentalização de cascata de sinalização celular, sinalização de cálcio, Previne ruptura de membrana Previne ruptura de membrana: Quando a célula sofre uma tensão de cisalhamento (estica) as cavéolas que são em sua maioria estáticas perde parte da curvatura quando as cavinas se desligam, assim a área de membrana aumenta, evitando a lise da célula Endocitose – Macropinocitose →Ativação em receptor de membrana (não se liga a molécula que será internalizada, ao contrário da clatrina, e não está na região que se tornará vesícula →Após a ativação do receptor haverá um rearranjo de actina e formação de protrusão (ruffles) que são tipo ondas →Protrusão se funde novamente com a M.P formando uma vesícula com fluídos e solutos extracelulares que são internalizados (macropinossomos) →Todo o conteúdo digerido, sem reciclagem Normalmente o que é internalizado: → Fatores de crescimento, ligantes de integrinas, remanescentes de células apoptóticas, alguns vírus Digestão Celular Dentro das células os fagossomos se fundem com os lisossomos, degradando o material digerido Destino possível da pinocitose → Formação de endossomos iniciais, endossomos tardios e depois a fusão com os lisossomos → Os materiais que não podem ser digeridos, permanecem nos lisossomos e formam os corpos residuais que são exocitados na célula Autofagia →Organela digerida →A membrana que envolve a organela é uma dupla membrana, já que se origina de partes do R.E. que se destacam para formar o autofagossomo →Encaminhados aos lisossomos →Relação da autofagia com o fenótipo de malignidade de algumas células tumorais Casos Específicos de Endocitose: O caso do LDL: Pinocitose → Colesterol – endocitado mediado por receptor → Como o colesterol é muito hidrofóbico não pode ser transportado sozinho no sangue, já que o plasma é um ambiente aquoso →Assim é transportado por partículas lipoproteícas (LDL) na forma de colesteril-ésteres →Quando a célula necessita de colesterol para formação de membranas a célula produz receptores para LDL e os inserem na M.P O processo de endocitose é mediado por clatrinas + adaptina →Após a saída do revestimento (libera os receptores + adaptina) a vesícula vaiacabar se fundindo com os lisossomos →As enzimas, assim, transformam os colesteril-ésteres hidrolisados em colesterol livre (pronto para ser utilizado para síntese da membrana) → Antes de chegar aos lisossomos vão ao endossomo (menor o pH), assim os receptores LDL liberam a carga, esses receptores são reciclados a MP por vesículas do endossomo Dislipidemia familiar Altos níveis séricos de colesterol Receptores de LDL defeituosos ou ausentes → Muitas vezes o domínio intra ou extracelular do receptor estão defeituosos → Não consegue se ligar a proteínas adaptadoras Assim o LDL permanece em altas concentrações no sangue predispondo à aterosclerose prematura (derrames e ataques cardiácos) Mutações no receptor de LDL leva a um aumento de 320% risco de doença coronária (CAD) Tratamento: Fármacos que diminuem os níveis de colesterol no sangue Como ocorre: A estrutura com LDL+receptor funde-se ao endossomo inicial (pH=6) →pH mais baixo essa estrutura muda, liberando LDL →receptor reciclado: parte da membrana do endossomo inicial forma uma vesícula, direcionada a M.P →LDL vai para o endossomo tardio, funde-se ao lisossomo, degradando o LDL pelas proteases e lipases lisossomais liberando o colesterol Muitas moléculas dos Endossomos Iniciais vão para os Endossomos de Reciclagem (recuperação de moléculas para MP) → Alguma digestão pode ocorrer no Endossomo Inicial, muitas das hidrolases são sintetizadas como pró-enzimas e precisam de ativação →O pH dos endossomos iniciais não é ácido o suficiente para ativar as proenzimas, recuperando moléculas para a MP Endolisossomo →Essas hidrolases são ativadas quando o lisossomo tardio se torna um endolisossomo (organela resultante da fusão do endossomo tardio com outras vesículas do golgi com enzimas ativas →A Membrana de endossomos possui uma bomba de Prótons (H+ ATPAase) mantendo o lúmen dos compartimentos endossomicos ácidos (pH~6). O interior do compartimento endossômico é mantido ácido (pH 5 a 6) por uma bomba de H+ (prótons) ativada por ATP na membrana endossômica que bombeia H+ do citosol para o lúmen do endossomo Endossomo inicial →Estrutura amorfa, porque está o tempo todo se fundindo com outras vesículas e brotando o tempo todo Resumindo, o material endossitado tem três destinos 1. Reciclados (endossomo de reciclagem) 2. Permanecer na vesícula (transcitase) e ir para outro domínio da célula 3. Lisossomos (degradação) Transcritose Obtenção de anticorpos via leite materno em recém-natos 1. Anticorpo vai para o endossomo inicial, não ocorrendo digestão 2. Sai por uma vesícula a um endossomo de reciclagem 3. Dele brota uma vesícula com um anticorpo ainda ligado ao receptor sendo direcionada ao domínio basal da célula intestinal 4. Liberando no tecido conjuntivo e captado por hemácias se dirigindo ao bebe O destino das proteínas receptoras após a endocitose depende do tipo de receptor Caso da Transferrina Transferrina carrega ferro no sangue Liga-se aos receptores de Transferrina (TfR) →Carregam aos Endossomos Iniciais →Lá por causa do pH faz a transferrina liberar os átomos de ferro, mas a transferrina fica ligada ao receptor Complexo receptor/Transferrina volta a M.P. (endossomo de reciclagem) e a transferrina em pH neutro do meio extracelular ela se dissocia do seu receptor O caso dos Receptores de Opioides Vão para endossomos tardios, para a rota de degradação Regulação negativa de Receptores →O receptor não é recuperado para membrana, segue a via endocítica sendo encaminhado para os lisossomos onde será degradado Ex: receptor de opioides e Receptor de EGF Como é essa rota de degradação? 1ª Na transição do endossomo inicial e tardio forma: corpo multivesícular 2ª Eles carregam receptores que irão para degradação 3ª Ocorre invaginação da membrana do endossomo para formação de vesículas internas no corpo multivesicular 4ª Dessa maneiras as proteínas contidas no corpo multivesicular (antes da membrana) vão ficar acessíveis a enzimas lisossomais para degradação 5ª Ai o endossomo tardio: pH mais ácido (5,5), com enzimas ativas 6ª O endossomo tardio quando se funde com vesículas/lisossomo, torna-se um endolisossomo (degradação intensa) 7ª pH baixo, a partir de bombas do tipo V a mantem (pH: 5,5) Enzimas que podem estar (ativas somente em pH ácido) presentes nos lisossomos: Modelos de maturação dos lisossomos Os endossomos tardios se fundem com os lisossomos preexistentes ou endolisossomos preexistentes. Por fim os endolisossomos amadurem em lisossomos à medida que as hidrolases completam a digestão de seus conteúdos, que pode incluir vesículas intraluminais Lisossomos: coleção de organelas distintas, cuja características em comum é um alto conteúdo de enzimas hidrolíticas
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