Toxicologia e Análises Toxicológicas 15-04

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Toxicologia e Análises Toxicológicas
Técnica Geral
Escolha da fase estacionária;
Preparação das placas cromatográficas;
Seleção da fase móvel;
Aplicação das amostras nas cromatoplacas;
Preparação da cuba cromatográfica e desenvolvimento do cromatograma;
Revelação dos cromatogramas;
Calculo do fator de retenção Rf;
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Na cromatografia em camada delgada CCD, uma superfície sólida (por exemplo,
vidro ou polímero inerte) suportando um sólido ou um líquido aderido a um sólido
(FE), e um líquido (FM), que a percorre por capilaridade, arrastando os solutos,
numa migração diferencial, por conta da diferença de propriedades dos solutos em
relação à FE (fase estacionária).
Cuidados na execução da análise por CCD
As amostras a serem analisadas em CCD devem ser previamente
dissolvidas em um solvente volátil.
A aplicação pode ser realizada utilizando um tubo capilar, cuja
extremidade inferior esteja uniformemente seccionada.
Para aplicação de mais de uma amostra deve-se tomar cuidado
com a distância entre os pontos.
Cuidados na execução da análise por CCD
Após a aplicação da(s) amostra(s), a CCD deve ser introduzida em uma cuba de vidro
contendo o solvente apropriado (eluente ou fase móvel).
A altura do solvente na cuba não pode ultrapassar a linha de aplicação da(s) amostra(s).
O eluente deve arrastar a(s) amostra(s).
Para que se obtenha melhores resultados na CCD, é necessário que a cuba fique saturada
com vapores de mesma constituição da fase móvel.
Para isto, as paredes laterais internas da cuba são, geralmente, recobertas com papel
filtro.
Este papel ficará, em contato com o eluente, ficando umedecido com o mesmo. Uma vez
introduzida a placa na cuba, o solvente ascenderá, por fenômeno de capilaridade, até a
extremidade superior.
Cuidados na execução da análise por CCD
Ao ascender, a fase móvel arrastará mais os compostos menos
adsorvidos na fase estacionária, separando-os dos compostos mais
adsorvidos.
A placa deve ser retirada da cuba quando a frente do solvente estiver a
aproximadamente 0,5 cm da extremidade superior da placa.
Em seguida, seca-se a placa por simples exposição ao ar, ou com ajuda
de um secador de ar quente.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Fases estacionárias (adsorventes)
Sílica – É o adsorvente mais amplamente utilizado na CCD.
É um adsorvente amorfo e poroso.
As substâncias são adsorvidas pela sílica via ligação de hidrogênio e interação dipolo-dipolo.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Alumina – Depois da sílica, é o adsorvente mais utilizado.
As propriedades físicas da alumina são similares às da sílica em termos de tamanho de
partícula, diâmetro médio do poro e superfície.
São disponíveis comercialmente alumina ácida (pH 4,0 - 4,5), neutra (7,0 - 8,0) e básica
(9,0 - 10,0).
Assim como a sílica, a alumina separa os componentes das amostras por polaridade, por
meio de ligações de hidrogênio, interação ácido-base de Lewis ou interações dipolo-
dipolo.
A seletividade da alumina na CCD de adsorção é similar à sílica-gel, sendo a alumina um
adsorvente melhor que a sílica para a separação de substâncias ácidas lipofílicas.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
A alumina de caráter ácido atrai fortemente substâncias básicas,
enquanto a alumina de caráter básico atrai mais fortemente substâncias
ácidas.
A alumina retém substâncias aromáticas mais fortemente que a sílica-
gel.
É empregada na separação de vitaminas lipossolúveis, alcaloides, certos
antibióticos e hidrocarbonetos policíclicos.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Celulose -A celulose é adequada para a separação de substâncias hidrofílicas, tais
como carboidratos e aminoácidos.
Poliamida - são utilizadas para a separação de compostos polares que são capazes
de interagir com o grupo amida por ligações de hidrogênio devido à sua estrutura
molecular.
Dentre elas estão aminoácidos e derivados, benzodiazepínicos, ácidos carboxílicos,
ciclodextrinas, ácidos graxos, flavonoides, conservantes e praguicidas.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Reveladores e métodos de detecção
Após o desenvolvimento da cromatografia e a evaporação dos solventes, passa-se
ao método de revelação das manchas que pode ser físico ou químico.
Como método físico, a luz ultravioleta (lâmpadas com emissão de radiação entre
254 e 366 nm) é comumente empregada no caso de substâncias que se tornam
fluorescentes quando excitadas por luz UV ou visível.
Os métodos químicos compreendem a utilização de reagentes cromógenos.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Identificação;
A posição final de cada mancha é designada pelo Rf (fator de retenção).
Após a revelação da cromatoplaca, mede-se a distância atingida por cada mancha a
partir da origem.
Essa distância é uma fração da distância total percorrida pelo solvente na fase
estacionária.
Rf = (distância atingida pela mancha a partir da origem) / (distância percorrida
pelo solvente desde a origem)
Cromatografia em camada delgada (CCD)
A CCD é de fácil compreensão e execução, permite separações em breve espaço de tempo,
reprodutibilidade e baixo custo.
Trata-se de um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada
através da distribuição desses componentes entre duas, ou mais, fases que estão em contato
umas com as outras.
Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra move-se através da primeira.
Sob condições bem estabelecidas, um dado composto percorre sempre uma distância fixa em
relação à distância percorrida pelo solvente.
Essa relação é chamada de fator de retenção (Rf) e é expressa como:
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Os valores de Rf devem ser menores do que 1.
Quando este for igual à zero, conclui-se que a substância não se
deslocou, quando for igual à unidade, conclui-se que a mesma
se moveu junto com o solvente.
Para ambos os casos, a escolha do eluente não foi apropriada,
devendo-se procurar então um novo eluente.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Muitas das substâncias separadas por esse processo não são coloridas, a
cor pode ser desenvolvida momentaneamente (para determinados
compostos) por exposição do sistema à luz ultravioleta (fluorescência),
pode-se também converter tais substâncias incolores a derivados
coloridos quando o sistema é pulverizado com um reagente apropriado
(sulfato cérico, ninidrina, cloreto férrico, entre outros) ou expondo a
atmosfera saturada com I2.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Princípio da cromatografia em camada delgada:
Partição de um soluto entre duas fases (como na extração) sendo uma
estacionária e uma móvel; o equilíbrio é constantemente deslocado
pela fase móvel e os solutos são separados pelas diferenças de
mobilidade impregnada em placa de vidro ou alumínio.
fase móvel (solvente) movido pelo efeito capilar pela placa
Exemplos:
Metanol, etanol, clorofórmio.
Preparo da Placa:
1.Linha horizontal cerca 1 cm da borda com LÁPIS
2.Preparo da câmera de revelação:
escolher béquer adequado com tampa de vidro de relógio;
colocar o solvente (altura ~0,5 cm), tampar o béquer e deixar equilibrar (15 min).
Cromatografia em camada delgada (CCD)
3. Aplicar amostra dissolvida na linha da placa usando-se capilar: tocar rapidamente o
capilar com amostra (evitar manchas grandes); se for o caso fazer várias aplicações no 
mesmo ponto;
identificar as manchas com LÁPIS;
4.Efetuar o desenvolvimento (revelação) da placa na câmera:
colocar a placa (pinça) na câmera de desenvolvimento (sem tocar com dedo); solvente deve
ficar abaixo da linha da aplicação;
deixar solvente subir até 0,5 cm abaixo do limite da placa;
retirar a placa (pinça)
Cromatografia em camada delgada (CCD)
5. Visualizar as manchas:
deixar secar a placa;
marcar as manchas coloridas (LÁPIS);
visualizar manchas com lâmpada UV ou outro Método de Visualização.
Calcular os valores de Rf.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Resultado da CCD: O valor de Rf
Rf: “ratioto front”
Cromatografia em camada delgada (CCD)
O valor de Rf é um parâmetro físico da substância e pode ser utilizado
para aidentificação caso se mantenha constante os seguintes
condições:
solvente ou mistura de solventes;
fase estacionária (silicagel ou óxido de alumínio);
condições ambientais (temperatura etc.)
espessura da camada e quantidade de amostra aplicada.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Métodos de visualização da manchas:
1. Utilizando-se lâmpada UV (254 e 365 nm):
2.Utilizando-se câmara de iodo:
Iodo reage com muitos compostos orgânicos, formando complexos, e levando a
manchas amarelas até marrons.
• Métodos específicos para detecção de grupos funcionais (métodos destrutivos):
a) ácido sulfúrico concentrado e aquecimento (manchas pretas);
Cromatografia em camada delgada (CCD)
b)nitrato de prata para visualizar haletos de alquila (manchas escuras de prata da
decomposição dos compostos de prata formados);
c)formação de 2,4-dinitrofenil hidrazonas a partir de compostos carbonílicos
(coloração amarela ou alaranjada);
d)cloreto férrico (FeCl3) leva a complexos coloridos com fenóis;
e)ácidos podem ser visualizados com indicadores de pH como verde de
bromocresol;
f)compostos facilmente oxidados podem ser visualizados com oxidantes
coloridos como CrO3 ou KMnO4;
g)detecção de aminas com p-dimetilamino-benzaldeído e de aminoácidos com ninidrina.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Referências:
BRASIL. Farmacopéia Brasileira. 6ª ed. Brasília: Agência Nacional de Vigilância Sanitária, 2019. 874 p. Disponível em: 
https://www.gov.br/anvisa/pt-br/assuntos/farmacopeia/farmacopeia-brasileira. Acesso 13 de abril de 2021.
Hiram da Costa Araújo Filho, Ademário Iris da Silva Junior. Análise instrumental uma abordagem prática / texto e organização; coautores Adney
Luís Anjos da Silva.. [et al.] ; coordenação Nival Nunes de Almeida. - 1. ed. - Rio de Janeiro : LTC, 2021.
https://www.gov.br/anvisa/pt-br/assuntos/farmacopeia/farmacopeia-brasileira