PAP -Fermentação Láctea

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PROTOCOLO DE AULA PRÁTICA 
	Número:
	
	
	LAB-PAP-XX
	
	CURSO: 
	ENGENHARIA QUÍMICA
	APROVAÇÃO
	
	DISCIPLINA:
	BIOQUÍMICA APLICADA À INDUSTRIA QUÍMICA
	 
	ELABORADO POR: Wilson Junio da Silva Gomes
	DATA: ___/___/___
	REVISÃO: 00
	MATRICULA: 01180041; TURMA: 10NA
	
	
	NOME DA PRÁTICA
	FERMATAÇÃO: Fermentação Láctica - Obtenção de Iogurte 
	
	OBJETIVOS DA PRÁTICA: 
	Produzir Iogurte a partir da fermentação láctica do leite; Realizar comparação do uso de diferentes culturas e observando as diferentes concentrações do leite em pó; Analisar a alteração do pH e da acidez durante o processo de fermentação.
	
	 
	QTD
	DESCRIÇÃO DAS VIDRARIAS
	QTD
	REAGENTES E SOLUÇÕES
	3
	Erlenmeyer
	1
	Solução de NaOH (0,1 N padronizada)
	2
	Becker
	1
	Solução alcoólica de fenolftaleína 1%
	1
	Proveta
	 
	 
	1
	Papel de Indicador de pH
	 
	 
	2
	Pipeta graduada de 10 mL
	 
	 
	QTD
	MATÉRIA PRIMA/INSUMO OU ANALITO
	QTD
	EQUIPAMENTO POR GURPO
	1
	Água destilada 500 mL
	1
	Banho termostatizado regulado em 45+/-1°C
	1
	Leite integral UHT
	 1
	pHmetro de bancada 
	1
	Leite em pó integral
	 
	 
	1
	Cultura liofilizados probiótica formada de lactobacillus acidophilus, bifidobacterium e streptococcus thermophilus (Bio Bich)
	 
	 
	
	
	 
	 
	
	
	 
	 
	MÉTODO EXPERIMENTAL/PROCEDIMENTO
	
	Procedimentos Experimentais:
· Elaboração do Iogurte
Realizar a mistura do leite integral UHT ao leite pó, de acordo com as proporções e culturas mostrada na tabela ɪ. 
Tabela ɪ
	Formulação
	Leite integral (mL)
	Leite em pó (g)
	Cultura Lática
	1
	500
	40
	Liofilizada
	2
	500
	40
	Iogurte natural
	3
	500
	20
	Liofilizada
	4
	500
	20
	Iogurte natural
Aquecer o leite entre 43-45°C e adicionar a cultura liofilizada/Iogurte natural, até homogeneizar a mistura. Em seguida, transferir para um frasco devidamente apropriado, com identificação da sua formulação, realizar a incubação a 45+/-1°C e deixando fermentar durante 4-5 horas até atingir o pH entre 4,5 e 4,7. Por fim, realizar o armazenamento do produto sobre refrigeração. No decorrer da fermentação, coletar alíquotas de 10 mL para quantificação do ácido lático e medição do pH (desde o tempo zero). 
Fazer a determinação, da acidez e pH da matéria-prima inicial, o leite.
· Determinação do pH
Determinar o pH com papel indicador ou pHmetro. Onde, deverá mergulhar a fita do papel indicador ou pHmetro no iogurte, onde na fita do papel indicador comparar a cor resultante com a que refere-se (na escala de pH presente na embalagem do papel), identificando assim os valores do pH, no pHmetro o valor do pH será mostrado no viso do equipamento, tendo um resultado mais preciso que a fita de papel. 
· Determinação da acidez por titulação
Quantificar o ácido lático através da titulação da amostra, utilizando um solução padronizada de hidróxido de sódio (NaOH), com o indicador de pH fenolftaleína. Em um frasco de erlenmeyer, adicionar 10 mL da amostra e 5 gotas da solução indicadora fenolftaleína 1%. Em seguida realizar a titulação da amostra em uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) a 0,1N, titular até o aparecimento da coloração rósea definitiva. Anotar o volume gasto da solução de NaOH na titulação, para posteriormente realizar o cálculo da porcentagem de ácido lático contido na amostra. 
· Determinação da porcentagem de ácido lático
Realizar a porcentagem do ácido lático contigo em cada amostra utilizando a equação (1) abaixo
Onde: 
VNaOH= Volume gasto da solução de Hidróxido de sódio;
N= Normalidade da solução de Hidróxido de sódio;
ƒ= Fator de correção da solução de Hidróxido de sódio, equivale a 1;
0,09= Fator de conversão em ácido lático (equivalente-grama de ácido lático);
Va= Volume da amostra utilizada;
100= Corresponde a conversão de porcentagem.
Converter a porcentagem de ácido lático em graus Dornic, utilizar a relação de 1°D que corresponde a 0,01% de ácido lático. 
A partir do dados obtidos, gerar tabelas observando a variação do tempo com os dados de volume de hidróxido de sódio gasto na titulação, o pH obtido através do papel indicador ou pHmetro, o percentual de acidez do ácido lático. E acidez em graus Dornic. 
· Perguntas
1- Explique do ponto de vista metabólico, a fermentação láctica. Indique também a reação global da mesma.
2- O que são ingredientes probióticos. Cite alguns exemplos usados na elaboração de iogurtes. Qual importância comercial dos mesmos na elaboração de fermentados lácteos? Quando um produto (iogurte) é considerado probiótico? 
3- O que são ingredientes prebióticos. Cite alguns exemplos usados na elaboração de iogurtes. Qual importância comercial dos mesmos na elaboração de fermentados lácteos? Quando um produto (iogurte) é considerado prebióticos? 
4- O que é um iogurte simbiótico?
5- A importância da fermentação láctica, na produção do iogurte.
6- Explique sobre o ácido láctico.
7- Explique a importância da fermentação homolática e heteroláctica, no processo industrial. Citando as diferenças entre elas e descrevendo o seu comportamento. 
A determinação da acidez do leite é uma das medidas mais usadas no controle da matéria-prima pela indústria leiteira. O teste é usado para classificar o leite e também como um guia para controle da manufatura de produtos como o queijo. A acidez titulável é expressa em graus Dornic (oD) ou em porcentagem (%) de ácido láctico.
O leite fresco normal não contém ácidos, mesmo assim ele apresenta uma acidez detectável pela técnica da titulação. Isso indica que a substância química usada no teste da determinação na titulação combina com algumas substâncias presentes no leite fresco e lhe confere essa acidez aparente. As substâncias responsáveis pela acidez aparente são: os fosfatos e citrato (minerais), a caseína e albumina (proteínas) e gás carbônico dissolvido. O termo acidez aparente não deve ser confundido com a acidez que se forma no leite pelo crescimento de bactérias (acidez real ou verdadeira). Amostras de leite com acidez titulável mais elevada (dentro da faixa normal) podem apresentar, em média, teores de proteína e minerais maiores do que aquelas com acidez titulável menor. Por essa razão, o resultado do teste de acidez titulável pode variar de 15 a 18oD.
Cada 0,1 mL da solução de NaOH N/9 gasto no teste corresponde a 1oD ou 0,1g de ácido láctico/L. 
Na tabela ɪɪ são apresentados alguns exemplos de resultados em graus Dornic, a correspondência em pH e a interpretação com respeito à acidez e à resistência térmica do leite.
Tabela ɪɪ: Interpretação de resultados de valores de pH e da acidez do leite
	pH
	Acidez Dornic (°D)
	Interpretação dos resultados 
	6,6 – 6,8
	15 – 18
	Leite normal (fresco)
	≥ 6,9
	< 15
	Leite típico alcalino: leite de vaca com mastite, leite do final da lactação, leite de retenção, leite fraudado com água
	6,5 – 6,6
	19 – 20
	Leite ligeiramente ácido: leite do princípio da lactação, leite com colostro, leite em início de processo de fermentação
	6,4
	± 20
	Leite que não resiste ao aquecimento a 110oC
	6,3
	22
	Leite que não resiste ao aquecimento a 100oC
	6,1
	≥ 24
	Leite que não resiste a pasteurização a 72oC
	5,2
	55 – 60
	Leite que começa a flocular à temperatura ambiente
	6,5
	9 – 13
	Soro de queijo
Fonte: (Adaptada) Rodrigues et al. (1995)
Referências: 
Disponível em: <https://www.agencia.cnptia.embrapa.br/Agencia8/AG01/arvore/AG01_194_21720039246.html>. Acesso em 28 nov. 19
Apêndice: Fermentação e Processo de Fermentação láctica 
· Fermentação
A fermentação é um dos mais antigos métodos de preservação de alimentos, originários do Oriente (China e Japão), foi introduzido na Europa e Estados Unidos, onde sofre algumas alterações.
É um processo de obtenção de energia em que uma molécula orgânica é degradada a compostos orgânicos mais simples, ocorrendo geralmente em organismos como bactérias e fungos em condições anaeróbicas.
O valor nutritivo dos alimentos fermentados é muito pouco alterado e compara-se aos demais métodos de preservação. Ocorrem pequenas mudanças nos valores energéticos, de minerais e vitaminas.Em várias circunstâncias, os níveis nutricionais são aumentados devido à presença de leveduras. Desta forma, os alimentos fermentados fornecem muitas das qualidades nutricionais.
As características de sabor, aroma e textura, dependem não somente da sua própria natureza, como também das mudanças resultantes da atividade das enzimas microbianas, das enzimas próprias do alimento, e das interações que ocorrem durante o processo fermentativo e a subsequente cura e envelhecimento.
· Fermentação Láctica 
A fermentação realizada por bactérias lática consiste na oxidação anaeróbica parcial de carboidratos, resultando na produção de ácido lático e outras substâncias orgânicas, sendo, de extrema relevância para a área da Tecnologia de alimentos, tendo uma grande relevância econômica. A fermentação láctica tem importância industrial, na produção de queijos, coalhadas e iogurtes. Por ação das bactérias lactobacilos, a lactose do leite é fermentada, gerando ácido láctico. A presença dessa substância deixa o leite com um odor e um sabor característicos (“leite azedo”), e a diminuição acentuada do pH (acidez) provoca a precipitação da caseína, que é uma das proteínas do leite. Processo metabólico no qual carboidratos e compostos relacionados são parcialmente oxidados, resultando em liberação de energia e compostos orgânicos, principalmente ácido láctico, sem qualquer aceptor de elétrons externo. Pode ser classificada em dois tipos, de acordo com a quantidade de produtos orgânicos formados: homolática e heteroláctica.
Fermentação homolática: Processo no qual o ácido láctico é o único produto da fermentação da glicose. As bactérias homolácticas podem extrair duas vezes mais energia de uma quantidade definida de glicose do que as heterolácticas.
Fermentação heteroláctica: processo no qual ocorre produção da mesma quantidade de 
Fermentação heteroláctica: Processo no qual ocorre produção da mesma quantidade de lactato, dióxido de carbono e etanol a partir de hexoses. As bactérias heterolácticas são mais importantes do que as homolácticas na produção de componentes de aroma e sabor, tais como o acetilaldeído e o diacetil.
Os lactobacilos (bactérias presentes no leite) executam fermentação lática, em que o produto final é o ácido lático. Para isso, eles utilizam como ponto de partida, a lactose, o açúcar do leite, que é desdobrado, por ação enzimática que ocorre fora das células bacterianas, em glicose e galactose. A seguir, os monossacarídeos entram nas células, onde ocorre a fermentação. Cada molécula do ácido pirúvico é convertido em ácido lático, que também contém três átomos de carbono. 
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O sabor azedo do leite fermentado se deve ao ácido lático formado e eliminado pelos lactobacilos. O abaixamento do pH causado pelo ácido lático provoca a coagulação das proteínas do leite e a formação do coalho, usado na fabricação de iogurtes e queijos.
· Microrganismos fermentadores 
O grupo das bactérias ácido-lácticas é composto por 12 gêneros de bactérias gram-positivas: Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Lactospha era, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus e Weissella. Todos os membros desse grupo apresentam a mesma característica de produzir ácido láctico a partir de hexoses. Os Enterococcus e os Lactobacillu s não pertencem mais ao gêneroSt reptococcus, o microrganismo deste último gênero mais importante em alimento é o S. thermophi lus. O S. diacetilac tis foi reclassificado como uma linhagem de Lacto coccus subespécie lactis que utiliza citrat o. Algas e fungo s (leveduras e ficomicetos) são também capazes de sintetizar ácido láctico. Produção comparável à das bactérias homofermentativas é obtida pelo fungo Rhizopus oryzae em meio de glicose. Sua utilização é preferível à d as bactérias homofermentativas, porque o tempo gasto na fermentação é menor e a separação do produto, mais simples. Fermentaçao L: glicose --->ac.Piruvico --->ac lactico+2ATP 
· Fase 1 (Glicólise)
A glicólise ocorre em dois estágios o primeiro trata-se de um estágio preparatório, em que a glicose é fosforilada e clivada para gerar 2 moléculas de triose fosfato. Este processo consome 2 ATP, como uma forma de investimento energético. No segundo estágio, 2 moléculas de triose fosfato são convertidas a piruvato, com a concomitante geração de 4 ATP. A glicólise, portanto, tem um rendimento de 2 ATP por molécula de piruvato. 
A equação global final para a glicólise é: 
Glicose + 2NAD+ + 2ADP + 2Pi → 2 Piruvato + 2 NADH + 2H+ + 2ATP + 2H2O
· Fase 2 (Fermentação via láctica)
Após a glicólise, a redução do piruvato é catalisada pela enzima lactato-desidrogenase. O equilíbrio global dessa reação favorece fortemente a formação de lactato. Microrganismos fermentadores regeneram continuamente o NAD+ pela transferência dos elétrons do NADH para formar um produto final reduzido, como o são o lactato e o etanol.
· Referências: 
AQUARONE, E. BORZANI, W. SCHIMIDELL, W. LIMA, U. A. Biotecnologia Industrial. V.4. 1ª Ed. Editora BLUCHER. São Paulo.
Disponível em:<https://www.passeidireto.com/arquivo/49986636/190099627-fermentacao-latica>. Acesso em 28 nov. 19
Disponível em: <https://www.passeidireto.com/arquivo/5637760/fermentacao-latica>. Acesso em 28 nov. 19
Disponível em: <https://www.sobiologia.com.br/conteudos/bioquimica/bioquimica4.php>. Acesso em 28 nov. 19