Extração e quantificação de Ácidos Nucleicos (DNA)

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Bioquímica – Prática
Faculdade de Medicina Universidade Coimbra
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DNA
É um polímero de nucleótidos
O DNA encontra-se no núcleo das células, condensado em cromossomas.
O Homem possui 23 pares de cromossomas
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DNA
Os cromossomas contêm eucromatina, descondensada, tendo genes activos;
Contêm também heterocromatina, condensada, com genes inactivos.
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DNA
Contém o material genético do indivíduo
Responsável pela hereditariedade
Contém inúmeros genes que codificam proteínas
Tem estrutura em dupla hélice, circular ou hélice simples
Cresce no sentido 5’→3’
Tem cerca de 20Å de diâmetro
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DNA
As bases azotadas emparelham duas a duas, por intermédio de pontes de hidrogénio, do seguinte modo :
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RNA
Existe sob 3 formas:
RNAm (RNA mensageiro)
Codifica a informação genética do DNA
É modificado antes da tradução
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RNA
RNAt
Traduz a sequência de bases do mRNA em aminoácidos
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RNA
rRNA
Forma os ribossomas, combinado com proteínas
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RNA
Enquanto que no DNA a pentose é uma desoxirribose, no RNA é uma ribose.
No RNA a base azotada Timina encontra-se substituída por Uracilo
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Detecção dos ácidos nucleicos
Espectro de absorção Região Ultravioleta ( absorção máxima a 260 nm)
Efeito hipercromático Aumento absorção, a um dado comprimento onda
Desnaturação das cadeias
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DNA Difenilamina
Complexo corado azul
Espectofotometria a λ=600 nm
● RNA Orcinol (na presença de FeCl3)
Complexo amarelo
Espectrofometria a λ=670 nm
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Procedimento
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Material:
Reagentes:
- Tampão A (Tampão de lise das hemácias):
 0,32 M sacarose; 10 mM Tris HCl; 5 mM MgCl2; 0.75% Triton-X-100; (pH a 7.6)
- Tampão B (desproteinização):
 20 mM Tris-HCl; 4 mM Na2EDTA; 100 mM NaCl; (pH a 7.4)
- Água
- SDS 10%
- Solução de Proteinase K (20 mg/mL)
- NaCl 5.3 M
- Isopropanol frio
- Etanol 70% frio
- TrisHCl 10 mM
Pipetas e micropipetas
Centrifugadora
Tubos de ensaio
Suporte de tubos de ensaio
Incubadora
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Reagentes
Tampão A
lise dos glóbulos vermelhos
Tampão B
Provoca a lise das membranas celulares (nucleares inclusivé) e desnatura proteínas
Proteinase K destrói as proteínas
Cloreto de Sódio precipita as proteínas
isopropanol força o DNA a precipitar formando a medusa
Etanol lava a medusa
Na estufa o etanol
evapora e o 
DNA solidifica
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Procedimento
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Resultados
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Resultados
Absorvância 260 nm
Absorvância 280 nm
DO260/ DO280
Concentração (µg/µl)
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Medusa de DNA
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Discussão
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Discussão
 Quantificação por espectrofotometria da amostra extraída a 260 e 280nm
 <1,5 
 
Contaminação por PROTEÍNAS
Quociente entre DO260 e DO280
Valor Obtido: 1,4
Parâmetros 
1,5 – 2,0
Valor de Pureza
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Contaminação do DNA
 Contaminação por Proteínas Plasmáticas 
 Contaminação por Proteínas Citoplasmáticas
 Contaminação por Proteínas associadas ao DNA
Ineficiente remoção e destruição das proteínas presentes na amostra 
Erros do experimentador
Centrifugação anómala
Tempo de actuação dos reagentes
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[ ] do DNA extraído
[DNA] = DO260 x 0,05 x fd
0,485 µg/µl
Perdas de DNA:
 Acção de DNases citoplasmáticas
 Insuficiente e não imediata preservação a frio
 Incompleta precipitação do DNA
 (…)
Aferir rendimento da extracção
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Posteriores Aplicações
 PCR
 Electroforese
Amplificar milhões de vezes uma dada sequência nucleotídica de interesse
Avaliar a [ ] do DNA extraído, por comparação de um marcador
 Sequenciação do DNA
 RFLPs
Aplicações forenses, como meio de diagnóstico, filogenéticas
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Grau de Pureza e Aplicações
 A aplicação do DNA extraído em posteriores processos implica um grau de pureza entre 1,5 e 2,0
Na Experiência:
Não pode ser posteriormente aplicado, nomeadamente na técnica de PCR
DNA extraído demasiado contaminado (1,4)
Contaminação dificulta: 
 acesso à DNA Polimerase
 emparelhamento dos primers
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Conclusão
Este trabalho permitiu-nos:
 Relembrar conceitos acerca dos ácidos nucleicos;
 Compreender a metodologia para extracção e quantificação de ácidos nucleicos;
 Quantificar e avaliar a concentração de DNA nas amostras usadas.
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Bibliografia
Nelson, D. L., Cox, M. M., (2005) Lehninger Principles of Biochemistry. W. H. Freema & Co., New York
Sebenta de Bioquímica 1ºano Medicina
www.wikipedia.org
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