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Biotecnologia Aplicada à Biomedicina Responsável pelo Conteúdo: Prof. Dr. Fabio Mitsuo Lima Revisão Textual: Prof.ª Dr.ª Selma Aparecida Cesarin Introdução à Biotecnologia Introdução à Biotecnologia • Apresentar ao aluno as bases da Biotecnologia, o avanço histórico e como ela se relaciona com as demais Áreas da Ciência; • Apresentar características gerais dos principais organismos alvos; • Abordar as principais técnicas relacionadas a processos-chave dentro da Biotecnologia. OBJETIVOS DE APRENDIZADO • Aspectos Históricos da Biotecnologia; • Tecnologia do DNA Recombinante; • Como Gerar Uma Molécula de Dna Recombinante? • Expressão e Purificação de Proteínas Recombinantes. UNIDADE Introdução à Biotecnologia Aspectos Históricos da Biotecnologia Antes de iniciarmos um estudo mais aprofundado sobre essa importante Disciplina, é importante definirmos o que se entende, atualmente, por “Biotecnologia” e abordar- mos brevemente sua história e evolução, sua abrangência e possíveis aplicações. Existem diversas definições para o termo e ficaremos com duas. Segundo a Enciclopédia Britânica, Biotecnologia é o uso da Biologia para solu- cionar problemas e desenvolver produtos úteis. Já o Ministério da Saúde do Brasil estabeleceu, em 2010, a seguinte definição: “Qualquer aplicação tecnológica que usa sistemas biológicos, organismos vivos ou seus derivados para criar ou modificar produtos e processos para usos específicos”. A Biotecnologia é, portanto, uma Área Multidisciplinar, contando com importan- tes contribuições da Genética, Biologia Molecular, Microbiologia, Bioquímica, Quí- mica e Engenharias. Desde a Antiguidade, muitos anos antes da Era Cristã, há registros do uso de microrganismos em processos fermentativos para a produção de bebidas alcoólicas a partir de cereais e para a produção de pão. Os sumérios, os babilônicos e os egípcios realizavam tal tarefa, contudo, sem um conhecimento estritamente científico sobre o tema. Na maioria das vezes, não era um processo em larga escala e controlado, e sim um conhecimento familiar, passado de geração a geração, baseado na observação. Figura 1 Fonte: Getty Images Somente em 1876, com os estudos de Louis Pasteur, foi revelada a real causa das fermentações: a ação de microrganismos. Pasteur comprovou que cada tipo de fermentação era realizado por um tipo es- pecífico de microrganismo. 8 9 Mais tarde, dois químicos alemães, chamados Hans e Eduard Buchner, mostra- ram que extratos de levedura, na ausência de células vivas, eram capazes de conver- ter glicose em etanol. Concluíram, portanto, que se trata de um processo enzimático. Esses achados foram fundamentais para o estabelecimento da Bioquímica mo- derna, que é um dos pilares da Biotecnologia, que teve um avanço significativo no século XX, consequência da evolução científica característica desse momento. Um dos primeiros marcos biotecnológicos desse período foi a descoberta da Penicili- na, em 1928, por Alexander Fleming. O impacto do uso desse antibiótico na saúde pública foi enorme, reduzindo dras- ticamente a mortalidade da população, inclusive durante a Segunda Guerra Mundial. A partir de então, outros antibióticos foram desenvolvidos, como a Estreptomicina e muitos outros. A Biotecnologia da primeira metade do século XX foi baseada, principalmente, no uso de enzimas e reações químicas controladas em Laboratório, como os exemplos citados anteriormente. O grande marco do século XX foi a descoberta da estrutura tridimensional do DNA, por James Watson e Francis Crick, em abril de 1953. Por esse motivo, ambos foram agraciados com o Prê- mio Nobel de Medicina em 1962. Watson e Crick propuseram a base genética da hereditariedade baseada na estru- tura do DNA e isso foi extremamente importante para se chegar aos estudos de tera- pia gênica e à manipulação genética de microrganismos observados nos dias atuais. A descoberta da estrutura do DNA mudou a história da Ciência e, em especial, da Biotecnologia. A partir de 1953, houve uma explosão no número de estudos visando a conhecer melhor o comportamento da molécula de DNA e meios para manipulá-la. Outro marco muito importante foi estabelecido pelo bioquímico americano Arthur Kornberg, que foi capaz de sintetizar uma molécula de DNA em Laboratório, a partir da enzima DNA polymerase, isolada de bactéria. Esses estudos renderam a Kornberg o Prêmio Nobel de Medicina, em 1959. A segunda metade do século XX termina com avanços nunca antes pensados, como a produção de insulina em bactérias, o Projeto Genoma Humano, a clonagem de animais e plantas, a manipulação genética de células vivas, a terapia gênica e muitas outras aplicações que veremos nas Unidades seguintes. Atualmente, as aplicações da Biotecnologia podem ser vistas nas mais diferentes áreas e não somente para a saúde humana: incluem-se as áreas Agrícola, Pecuária, Industrial e do Meio Ambiente. Teste Seu Conhecimento 1. O que é Biotecnologia? Quais Disciplinas contribuem para o conheci- mento nessa Área? 9 UNIDADE Introdução à Biotecnologia 2. Explique o fato de que extratos de levedura são capazes de converter gli- cose em etanol. Por que não é necessário que as leveduras estejam vivas? 3. Por que a descoberta da Penicilina foi um importante marco para a Bio- tecnologia? Relacione essa descoberta com a área; 4. Como a descoberta da estrutura do DNA influenciou drasticamente os rumos da Biotecnologia? 5. Quem foi a primeira pessoa a sintetizar a molécula de DNA em Labora- tório? Qual a importância desse fato para a Biotecnologia? 6. Além da Medicina, quais outras Áreas têm sido beneficiadas com as aplicações da Biotecnologia? Como você, futuro profissional biomédico, pode atuar nesse Setor? Tecnologia do DNA Recombinante Antes de aprendemos como modificar a molécula de DNA, é necessário relem- brar como é sua estrutura. O DNA é uma macromolécula formada por nucleotídeos. Esse, por sua vez, são constituídos de três partes: base nitrogenada, açúcar do tipo pentose (desoxirribose) e grupamento fosfato. Figura 2 Fonte: Adaptado de ZAHA, 2014 Estrutura de um nucleotídeo. O grupamento fosfato está ligado ao carbono 5 da pentose, enquanto a base nitrogenada está ligada ao carbono 1. As dife- renças entre as pentoses que compõem os nucleotídeos do DNA e do RNA estão marcadas em rosa na Figura B: a pentose do RNA possui uma hidroxila na posição 2, enquanto a do DNA não a possui. Por isso, a pentose do DNA chama-se desoxirribose. Além da diferença da ribose, o RNA possui a base nitrogenada uracila e não a timina 10 11 Os nucleotídeos se ligam entre si por meio de ligações fosfodiéster, estabelecidas entre o grupo fosfato situado no carbono 5’ da pentose de um nucleotídeo com a hidroxila situada no carbono 3’ do nucleotídeo vizinho. Figura 3 Fonte: Adaptado de WATSON, 2015 Nucleotídeos ligados por ligações fosfodiéster em uma fita simples de DNA. As extremidades 5’ e 3’ da cadeia estão assinaladas. As pentoses dos nucle- otídeos adenina, citosina, guanina e timina estão mostradas por losangos roxos e os grupamentos fosfato estão dentro de círculos cinza. A ligação fosfodiéster ocorre entre a hidroxila do carbono 3’ da pentose com o gru- pamento fosfato ligado ao carbono 5’ da pentose do nucleotídeo seguinte Muitos nucleotídeos são ligados, um após o outro, formando a molécula de DNA. À extremidade na qual se iniciou a polimerização dá-se o nome de extremidade 5’, por haver um grupamento fosfato livre nela. Chamamos a extremidade oposta de 3’, pois há hidroxila livre nesse local. Note que, independentemente do número de nucleotídeos que são incorporados à molécula de DNA, sempre haverá uma extremidade 5’ e outra 3’, com os grupa- mentos fosfato e hidroxila, respectivamente. Importante! O crescimento da fita de DNA sempre ocorre do sentido 5’ em direção à extremidade 3’. Essa direção é importantíssima no estudo e na manipulação do DNA. 11 UNIDADE Introdução à BiotecnologiaA estrutura de Watson e Crick revelou, ainda, que a forma mais estável do DNA na natureza é formando uma dupla hélice. Assim, duas moléculas de DNA interagem entre si por meio de ligação do tipo ponte de hidrogênio entre as bases nitrogenadas das duas fitas. As duas fitas ficarão dispostas de modo antiparalelo, ou seja, a extremidade 5’ de uma fita se ligará à extremidade 3’ da fita complementar. Figura 4 Fonte: Adaptado de WATSON, 2015 Estrutura do DNA em formato de dupla-hélice (helicoidal). As bases nitrogena- das estão voltadas para a parte central da molécula, sendo que as bases com- plementares de cada fita estão ligadas por pontes de hidrogênio. O esqueleto da fita é formado pelos grupamentos fosfato e pelas pentoses Teste Seu Conhecimento 1. Do que são compostos os nucleotídeos? 2. Como os nucleotídeos são ligados entre si em uma fita simples de DNA? 3. O que é extremidade 5’? E extremidade 3’? Qual a importância dessa informação para o crescimento da fita de DNA? E para a manipulação de DNA? 4. Como as fitas de DNA estão ligadas entre si? Para manipular uma molécula de DNA em Laboratório, é necessário utilizar enzimas que alteram a estrutura dessa molécula. As mais importantes e as que veremos a seguir são: endonuclease ou enzima de restrição, DNA ligase e DNA polimerase. Endonuclease As endonucleases são enzimas que reconhecem uma sequência específica no DNA (sítios de restrição) e cortam a dupla fita, rompendo as ligações fosfodiéster. 12 13 Essas enzimas, em geral, têm origem bacteriana e funcionam na defesa desses microrganismos contra infecções por bacteriófagos. Na Biotecnologia, elas são utili- zadas para cortar fragmentos de DNA de interesse. Pode ser um gene inteiro, parte de um gene, apenas um éxon etc. Uma determinada endonuclease reconhece apenas um único sítio de restrição. Portanto, dizemos que ela é sítio-específica. Uma outra característica importante é que esse sítio é palindrômico. Vamos entender esse conceito. Observe a palavra ARARA. Se você ler da esquerda para direita ou da direita para a esquerda, tem o mesmo significado. Um sítio de restrição funciona de modo semelhante. Veja, por exemplo, o sítio reconhecido pela enzima EcoRI. Fazendo a leitura, no sentido 5’ > 3’, lemos GAATTC. Se realizarmos a leitura, no mesmo sentido, na fita complementar, temos o mesmo: GAATTC. As enzimas de restrição reconhecem apenas sítios palindrômicos. Isso é muito im- portante quando estamos analisando um fragmento de DNA que desejamos manipular. 5 ’ – G A A T T C – 3 ’ 3 ’ – C T T A A G – 5 ’ Figura 5 Sítio reconhecido pela enzima EcoRI. Note que o sítio é palindrômico, ou seja, se você fizer a leitura da fita superior no sentido 5’- 3’ lerá GAATTC. Se fizer a leitura da fita complementar no sentido 5’- 3’ também lerá GAATTC. A enzima EcoRI corta entre o G e o primeiro A tanto na fita superior como na fita complementar gerando extremidades coesivas Quando uma enzima de restrição reconhece seu sítio em determinada molécula de DNA ela pode realizar dois tipos de corte. Um corte simétrico ou um corte assimétrico. Veja três exemplos na Figura a seguir: EcoRI G A A T T C C T T A A G C T G C A G G A C G T C C A G C T G G T C G A C A A T T C C T T A A A C G T C + + + C T G C AP- - P P- P- - P - P -OH HO- -OH -OH HO- HO- C A G G T C C T G G A CG G G G Pstl Pvull Figura 6 13 UNIDADE Introdução à Biotecnologia A seta vermelha mostra o local do corte que será realizado pelas enzimas. Per- ceba que as três reconhecem sítios compostos por 6 nucleotídeos (mas que são diferentes entre si). A enzima da direita, chamada PvuII, reconhece a sequência 5’-CAGCTG-3’ e corta entre o terceiro e quarto nucleotídeos, exatamente no meio do sítio de restrição. Note que, após o corte, temos duas extremidades simétricas, também chamadas de extre- midades cegas. Agora, veja o que acontece com a enzima EcoRI. Como destacado acima, ela re- conhece um sítio 5’-GAATTC-3’. No entanto, ela corta entre o primeiro e o segundo nucleotídeos na fita de cima e entre o primeiro e o segundo nucleotídeos na fita de baixo (oriente-se pelo sentido 5’ > 3’ da fita). Observe que, após o corte, temos extremidades diferentes daquelas geradas pela enzima PvuII. As extremidades EcoRI ficam com quatro nucleotídeos simples fita. Damos a esse tipo de extremidade o nome de coesiva. O mesmo fenômeno acontece quando usamos, por exemplo, a enzima PstI, que reconhece o sítio de restrição 5’-CTGCAG-3’ e corta entre o quinto e sexto nucle- otídeos em ambas as fitas. Perceba que, semelhante à EcoRI, a PstI também forma extremidade coesiva, embora em sentido oposto. É importante ressaltar que o sítio e a forma de cortar são características de cada enzima. A enzima EcoRI sempre irá reconhecer 5’-GAATTC-3’ e sempre irá cortar na mesma posição, bem como qualquer enzima de restrição. Dessa forma, conhecendo o comportamento de cada enzima, é possível planejar a manipulação de uma molécula de DNA de interesse. Figura 7 Fonte: Adaptado de Khan Academy O sítio reconhecido pela enzima EcoRI está presente em uma determinada região do DNA (acima), quando a enzima entra em contato com essa sequ- ência (a seguir à esquerda), a enzima cliva entre os nucleotídeos G e A tanto da fita senso como da fita antisenso (fita complementar) No Laboratório, em experimentos de manipulação do DNA, alguns fatores in- fluenciam na atividade dessas enzimas, visto ser uma condição in vitro, tais como: composição dos tampões, concentração da enzima, temperatura e metilação do DNA alvo. 14 15 Todos esses fatores devem ser considerados conjuntamente, antes da realização de um experimento. Teste Seu Conhecimento 1. O que é enzima de restrição? Qual a importância dessa molécula para a manipulação do DNA? 2. Por que se diz que as enzimas reconhecem sítios palindrômicos? 3. Qual a importância de conhecer quais são as extremidades 5’ e 3’ para entender os cortes das enzimas de restrição? 4. Diferencie extremidade cega e extremidade coesiva após o corte por enzimas de restrição 5. Qual a importância do fato de determinada enzima reconhecer única e exclusivamente um sítio específi co? O nome da enzima de restrição se refere ao gênero e a espécie da bactéria de onde foi isolada da enzima. Algumas vezes, essa sigla é seguida pela linhagem da bactéria. Tabela 1 E Escherichia (gênero) co coli (espécie) R RY13 (estirpe) I Primeira identificada (ordem de identificação da bactéria) Fonte: Wikipedia.org Tabela 2 Enzimas Organismo fonte Sítio de restrição de DNA bifi lamentar Estrutura dos produtos cortados (a) EcoRI Escherichia coli 5’-G-A-A-T-T-C- -C-T-T-A-A-G-5’ -G 5’A-A-T-T-C -C-T-T-A-A 5’ G- Pstl Providencia stuartii 5’-C-T-G-C-A-G- -G-A-C-T-C-5’ -C-T-G-C-A 3’ G- -G 3’ A-C-G-T-C- Smal Serratia marcescens 5’-C-C-C-G-G-G- -G-G-G-C-C-C 5’ -C-C-C G-G-G- -G-G-G C-C-C (b) Haelll Haemophilus aegyptius 5’-G-G-C-C -C-C-G-G- 5’ -G-G 5’ G-G -G-G ‘5 G-G- Fonte: Wikipedia.org → → → → → → → → 15 UNIDADE Introdução à Biotecnologia DNA Ligase DNA Ligase é uma enzima com função oposta à das enzimas de restrição, ou seja, como o nome sugere, elas “ligam” duas moléculas de DNA pelo estabelecimento de ligação fosfodiéster entre o grupo fosfato de uma molécula com a hidroxila de outra. Essa é a condição básica para a ação de uma DNA Ligase. Diferentemente das enzimas de restrição, elas não são sítio-específicas. Figura 8 Fonte: Adaptado de Khan Academy Enzima ligase promove a restauração das ligações fosfodiéster quebradas pela enzima EcoRI. Note que as extremidades coesivas geradas pela enzima EcoRI possuem nucleotídeos complementares que se ligam por pontes de hidrogê- nio. Mas a complementaridade de bases não restaura a ligação fosfodiéster,sendo necessária a ação da enzima ligase Essas enzimas estão presentes em todas as células vivas, participando de impor- tantes processos, como a replicação do DNA durante a fase “S” do ciclo celular e em mecanismos de reparo de DNA, quando esse sofre algum dano. No Laboratório, costuma-se utilizar a DNA Ligase isolada do vírus T4. Como toda enzima, é necessário cuidado na manipulação, obedecendo rigorosamente as condi- ções de temperatura, tempo e pH, para maximizar sua atividade. Teste Seu Conhecimento 1. Qual a função da enzima ligase? 2. Compare a ação da ligase com a função das enzimas de restrição; 3. Você consegue prever porque as ações das enzimas de restrição e da ligase; são COMPLEMENTARES na manipulação de DNA? Dna Polimerase A DNA Polimerase é outra enzima muito importante para a Biotecnologia. Vere- mos mais detalhadamente sua ação no Módulo II, quando estudaremos a técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction), muito utilizada na clínica, mas também funda- mental na manipulação gênica. Essa enzima, como o nome sugere, polimeriza o DNA ao incorporar novos nu- cleotídeos à cadeia pré-existente. Para que ela consiga exercer adequadamente sua função, é necessária uma fita simples de DNA como molde. 16 17 Assim, ela “lê” o molde e incorpora, na nova fita de DNA, um nucleotídeo com- plementar obedecendo à Regra de Chargaff, que diz que uma Adenina (A) pareia com Timina (T) e uma Citosina (C) pareia com Guanina (G). Em outras palavras, quando houver um G no DNA molde, a DNA polimerase incorporará um C na molécula a ser replicada, e assim por diante. Importante! Regra de Chargaff – em uma dupla fita, Adenina (A) pareia com Timina (T) por duas pontes de hidrogênio e Citosina (C) pareia com Guanina (G) por ter pontes de hidrogênio. Quando você encontrar a representação “A. T”, significa que a Adenina está pareada com a Timina e a ligação ocorre pela presença de duas pontes de hidrogênio, cada uma sim- bolizada por um ponto. Quando você encontrar a representação “C...G”, significa que a Citosina está pareada com a Guanina e a ligação ocorre pela presença de três pontes de hidrogênio, cada uma sim- bolizada por um ponto. Outro requisito importante para a atividade dessa enzima é a presença obrigatória de uma pequena sequência iniciadora. Nas nossas células, quando o DNA é replicado, essa sequência é de RNA. Entretanto, in vitro, utilizamos um iniciador de DNA, o qual também chamamos de primer. Ele é ne- cessário, pois a DNA polimerase é incapaz de iniciar a polimerização sem uma região de dupla fita de DNA. Ela precisa reconhecer tal estrutura e, assim, “andar” sobre a fita molde. Figura 9 Fonte: Adaptado de Khan Academy Por fim, é fundamental entender que a DNA polimerase age em apenas uma única direção, que é da extremidade 5’ para a extremidade 3’, isto é, haverá ligação fosfodi- éster entre o fosfato do nucleotídeo livre com a hidroxila do DNA pré-existente. Isso se dá até o final do molde de DNA a ser replicado. Confira esta imagem. Disponível em: https://bit.ly/3dW9nfk 17 UNIDADE Introdução à Biotecnologia Teste Seu Conhecimento 1. O que é e o que faz a enzima DNA polimerase? 2. Em que sentido ocorre a polimerização da fita de DNA? 3. Se a fita molde possui um C, qual nucleotídeo será incorporado na nova fita de DNA? E se for um A? 4. O que é primer ou iniciador? Qual a importância dessa molécula na sín- tese de DNA? Como Gerar Uma Molécula de Dna Recombinante? Agora que aprendemos a função de algumas enzimas modificadoras do DNA, seremos capazes de entender como gerar uma molécula recombinante. Esse conhecimento é fundamental para as aplicações que veremos adiante, tais como: clonagem gênica, produção heteróloga de proteínas recombinantes, produção de vacina e imunobiológicos recombinantes e terapia gênica. Iniciaremos com o raciocínio mais simples possível para depois entendermos os mais complexos. Para isso, precisamos relembrar o conceito de plasmídeo, encon- trados largamente nas bactérias. Os plasmídeos são moléculas de DNA circular, extracromossomal, que carregam genes que conferem resistência a um determinado antibiótico. Na Natureza, esse evento é fundamental para que as bactérias sobrevivam na presença desses antimicrobianos. Esses plasmídeos podem ser transferidos de bactéria a bactéria por meio do processo conhecido como conjugação bacteria- na. Eles são reconhecidos pela célula receptora e exercem a mesma função nesse novo hospedeiro. A Biotecnologia, ou mais especificamente, a Biologia Molecular, utiliza essas mo- léculas como vetores, ou seja, como carreadores de um DNA de interesse. O primeiro caso de sucesso foi a produção de insulina humana recombinante em bactérias, em 1978. No tubo de ensaio, os pesquisadores introduziram o gene da insulina humana em um plasmídeo bacteriano. Posteriormente, essa molécula recombinante (composta por parte de DNA bac- teriano e parte de DNA humano) foi introduzida em uma bactéria, que expressou o gene humano de interesse. A esse processo, dá-se o nome de clonagem gênica. A Figura a seguir mostra um gene de interesse (azul) sendo introduzido em um plasmídeo: 18 19 DNA recombinante Plasmídeo Gene Figura 10 Fonte: Adaptado de Khan Academy O racional dessa metodologia é cortar o gene humano com uma enzima de res- trição para isolá-lo em um tubo de ensaio à parte. Paralelamente, cortamos um plasmídeo com a mesma enzima, por exemplo a EcoRI. Na Figura a seguir, é possível observar que tanto o gene quanto o plasmídeo apre- sentam sítios de restrição para a referida enzima: Figura 11 Fonte: Adaptado de Khan Academy Após a ação da enzima Eco RI, teremos extremidades compatíveis entre o gene alvo e o plasmídeo: Figura 12 Fonte: Adaptado de Khan Academy 19 UNIDADE Introdução à Biotecnologia O próximo passo é adicionar, em um tubo novo, o produto da digestão enzimática do gene alvo, o produto da digestão do plasmídeo e a enzima DNA Ligase. As extre- midades compatíveis serão unidas covalentemente pela enzima. Veja a seguir: Figura 13 Fonte: Adaptado de Khan Academy Se houver a ligação do plasmídeo (em cinza, na Figura acima) com o gene da insu- lina, por exemplo (em azul, na Figura acima), teremos um plasmídeo recombinante: Figura 14 Fonte: Adaptado de Khan Academy Na Figura a seguir, é possível ter a visão geral de todo o processo: Plasmídeo recombinante Liga-se à DNA ligase Plasmídeo Digestão com enzima de restrição Gene-alvo (por exemplo, o gene da insulina) Figura 15 Fonte: Adaptado de Khan Academy 20 21 Teste Seu Conhecimento 1. O que são plasmídeos e onde eles são encontrados, normalmente, na Natureza? 2. Como os plasmídeos são utilizados nos Processos da Tecnologia do DNA recombinante e clonagem gênica? 3. Explique a função de cada uma dessas moléculas no processo de clonagem: a) DNA humano, por exemplo, gene da insulina; b) DNA plasmidial; c) Enzima de restrição; d) Enzima ligase. 4. Pergunta Desafi o: É possível ligar um DNA cortado pela enzima PvuII com um DNA cortado pela enzima EcoRI? Explique; 5. Pergunta Desafi o: É possível ligar um DNA cortado pela enzima PstI com um DNA cortado pela enzima EcoRI? Explique; 6. Pergunta Desafi o: A partir das respostas das perguntas 4 e 5 explique o qual são extremidades compatíveis e qual a importância desse conhe- cimento no processo de clonagem. Para finalizar o processo de clonagem, faz-se necessário introduzir esse plasmí- deo recombinante em um hospedeiro adequado. Pode-se utilizar diferentes hospedeiros, tais como bactérias, fungos, células de insetos e células de mamíferos, dentre outros. Para cada aplicação, há um hospedeiro preferencial e, com ele, modificações no plasmídeo devem ocorrer para que a célula-alvo possa reconhecê-lo. As bactérias são, sem dúvida, os hospedeiros mais utilizados na clonagem. Isso se deve à facilidade de manipulação dessa célula, boa taxa de crescimento celular, diversas cepas e plasmídeos comercialmente disponíveis e sistemade expressão e purificação da proteína recombinante bem conhecidos. Entretanto, é importante ter em mente que há vantagens e desvantagens na uti- lização dos outros organismos citados acima. Tudo vai depender do interesse e da aplicação do pesquisador. Aqui, continuaremos nosso estudo focando nas bactérias. Para introduzir o plasmídeo recombinante na bactéria, é necessário submetê-la a um processo denominado transformação. Nele, bactérias competentes são misturadas ao plasmídeo recombinante e incuba- das em gelo por alguns minutos. Em seguida, essa mistura é submetida a um choque térmico (de zero a 42°C), que promoverá uma desestabilização da membrana celular bacteriana, formando poros transitórios, suficientes para permitirem a entrada do plasmídeo na célula. Uma vez interiorizado, esse plasmídeo passa a conferir resistência a um determi- nado antibiótico por carregar um gene que codifica para tal característica (ampicili- na, por exemplo). 21 UNIDADE Introdução à Biotecnologia Figura 16 Fonte: Adaptado de Khan Academy É importante notar que o processo de transformação não é totalmente eficiente, de forma que poucas bactérias recebem o plasmídeo recombinante em comparação ao número inicial de células. Para selecionar as bactérias que contêm o plasmídeo daquelas que não contêm, semeia-se todo o conteúdo da transformação em placas de Petri contendo meio de cultura com o antibiótico para quem o plasmídeo confere resistência (Ampicilina, nesse exemplo). Após algumas horas sob temperatura adequada, é possível identificar colônias bacterianas no meio de cultura. Elas são provenientes de uma única bactéria resis- tente, ou seja, que recebeu o plasmídeo no processo de transformação, que se mul- tiplicou e formou um aglomerado de células geneticamente idênticas. As bactérias que não receberam o plasmídeo morreram durante esse período de incubação em meio contendo antibiótico e não crescem na placa de cultura. Assim, é possível selecionar as bactérias que contêm o plasmídeo recombinante e utilizá-las para a produção de proteínas recombinantes (insulina, por exemplo) ou para multiplicar esses plasmídeos que serão utilizados posteriormente na terapia gênica, por exemplo. Agora que você aprendeu como funciona o processo de clonagem gênica, vamos citar e explicar as 3 características essenciais de um plasmídeo: • Origem da replicação que seja reconhecida pela DNA polimerase da célula hos- pedeira. Por exemplo, um plasmídeo que vai ser inserido em uma bactéria, deve ter um sítio que seja reconhecido pela DNA polimerase da bactéria. Afinal, quando a bactéria vai replicar o próprio DNA, precisa também replicar o DNA plasmidial contendo o gene de nosso interesse. O mesmo raciocínio é aplicado quando a célula hospedeira é uma levedura ou outra célula eucariótica; • Múltiplo sítio de clonagem – Esse local contém diversos sítios que são reconheci- dos por diferentes enzimas de restrição. Quanto mais sítios, mais fácil é utilizar o 22 23 plasmídeo no processo de clonagem. Lembre-se de que você deve escolher uma enzima de restrição para clivar o DNA de interesse e uma enzima para clivar o plasmídeo: » Quando você escolhe uma enzima que gera extremidades cegas para clivar o DNA de interesse, pode-se utilizar qualquer enzima que gere extremidades cegas para clivar o plasmídeo; » Quando você escolhe uma enzima que gera extremidades coesivas, as extremida- des geradas devem ser compatíveis e complementares para que ocorra a ligação; • Método de seleção das bactérias que incorporaram o plasmídeo. O método mais utilizado é a existência de um gene que confere resistência a algum antibiótico. Dessa forma, basta acrescentar o antibiótico no meio de cultura que é possível selecionar as bactérias que incorporaram o plasmídeo. Teste de Conhecimento 1. Por que é necessário inserir o plasmídeo dentro de uma célula hospedeira? 2. Que tipos de células podem ser utilizadas como hospedeiras? 3. Por que as bactérias são os hospedeiros mais utilizados na clonagem gênica? 4. O que é e qual a função do processo de transformação bacteriana? 5. Descreva o processo de transformação bacteriana; 6. Qual a função do antibiótico (por exemplo, Ampicilina) no Processo de Clonagem Gênica?; 7. Quais as 3 características essenciais de um plasmídeo? 8. Qual a função das seguintes sequências de DNA em um plasmídeo: • Origem de replicação que seja reconhecida pela DNA polimerase da célula hospedeira; • Múltiplo sítio de clonagem; • Método de seleção das bactérias. Expressão e Purificação de Proteínas Recombinantes Após a clonagem gênica, com o plasmídeo recombinante no interior da bactéria, pode- -se induzir a expressão do gene de interesse para a produção da proteína recombinante. Antes de avançarmos nesse tema, é importante voltarmos na estrutura do plas- mídeo utilizado na clonagem para entendermos como é possível “fabricar” proteínas humanas, por exemplo, em Sistema Bacteriano. Anteriormente, havíamos falado que os plasmídeos das 3 características de um vetor de clonagem. 23 UNIDADE Introdução à Biotecnologia Além dessas características, um VETOR DE EXPRESSÃO também precisa ter: • Sequência promotora que seja reconhecida pela RNA polimerase da célula. Essas sequências promotoras determinam onde deve ser iniciada a transcrição, ou seja, onde a RNA polimerase deve iniciar a leitura do DNA para transcrever a molécula de RNA e, geralmente, estão localizadas na região 5’ dos genes. Promotores influenciam a taxa com que esse RNA é replicado; • Sítio de ligação ao ribossomo – é a região do RNAm que é reconhecida no ri- bossomo para início da tradução. Importante! Nem sempre o objetivo do pesquisador ao fazer uma clonagem é expressar proteínas. Muitas vezes, deseja-se conhecer alguma região do genoma cujo produto não seja uma proteína, por exemplo, clonagem de sequências regulatórias, regiões intergênicas (entre genes), promotores, sequências de DNA repetitivo e genes ribossomais. Nesse caso, o pesquisador não deve utilizar um vetor de expressão e sim um vetor de clonagem sem as características adicionais encontradas em um vetor de expressão. Plasmídeo Gene-alvo Gene de resistência ao antibiótico Promotor para conduzir a expressão gene-alvo Figura 17 Fonte: Adaptado de Khan Academy É importante entender, portanto, que o Sistema de Clonagem e expressão base- ado em plasmídeos e bactérias é sempre fixo. O que deve variar, de acordo com o interesse do pesquisador, é o gene que é inserido no plasmídeo. Assim, se quisermos produzir a proteína insulina para tratamento de diabéticos, devemos isolar o gene que a codifica e inseri-lo no plasmídeo. Se, em outro momento, quisermos produzir eritropoietina para tratamento de anemia associada à falência renal crônica ou da anemia em pacientes com câncer tratados com quimioterapia, devemos isolar o gene que codifica para eritropoietina humana e inseri-lo no plasmídeo. O mesmo raciocínio deve ser seguido para a clo- nagem de qualquer gene. 24 25 O mRNA gerado é traduzido pelos ribossomos bacterianos, levando à síntese proteica. A Figura a seguir mostra esse processo, desde a colônia contendo o plasmídeo com o gene de interesse (à esquerda na Figura) até a produção da proteína (à direita na Figura). Figura 18 Fonte: Adaptado de Khan Academy Perceba que nos dois casos exemplificados acima, produção de insulina ou eritro- poietina em larga escala, há necessidade de remover as proteínas recombinantes do interior da célula bacteriana. É preciso purificá-las para o uso biotecnológico. Portanto, o próximo passo é lisar a bactéria para termos acesso à proteína recombinante. Isso é realizado por meio do uso de soluções adequadas e sonicação (uso de ultrassom para lisar células). O rompimento das células provoca o extravasamento de todo o conteúdo celular e esse lisado contêm, além da proteína recombinante, todas as macromoléculas e proteínas bacterianas. O desafio seguinte é purifica-la dessa “sopa”de proteínas. Note que, para o uso terapêutico dessas moléculas, essa purificação deve ser pró- xima da perfeição. Não se pode administrar insulina ou eritropoietina, ou qualquer outra proteína, contaminada com proteína bacteriana. Teste Seu Conhecimento 1. Quais as 5 características essenciais de um vetor de expressão? 2. Qual a importância da existência de um promotor que seja reconhecido pela DNA polimerase da célula? O que acontece na ausência dessa sequência? 3. O que acontece se o pesquisador inserir um plasmídeo contendo um pro- motor que seja reconhecido pela DNA polimerase de bactéria em uma célula de levedura? A proteína será expressa? 4. Qual a importância da existência de sítio de ligação ao ribossomo? Onde deve estar localizada essa sequência? O que acontece na ausência desse sítio? 5. Cite e descreva cada passo necessário para a expressão do hormônio de crescimento humano em bactérias. Dica 1: interprete o texto e faça correlações. Dica 2: faça um mapa mental colorido com todas as etapas para facilitar a memorização e compreensão do processo; 6. Por que se deve purifi car a proteína de interesse após a produção em larga escala pela bactéria? Quais são os desafi os dessa etapa? 25 UNIDADE Introdução à Biotecnologia A maneira mais eficiente para a purificação é a utilização da técnica conhecida por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Esse é um método físico de separação no qual os componentes a serem separa- dos estão distribuídos entre duas fases que estão em íntimo contato. Uma das fases permanece estacionária, enquanto a outra se move através dela. A fase estacionária, geralmente, é formada por partículas sólidas ou semirrígidas, esféricas, nas quais se podem acoplar compostos químicos como uma hidroxila, ca- deias carbônicas apolares e anticorpos específicos, dentre muitos outros. Ao fazer isso, é possível conferir uma característica química à partícula. À essa fase estacionária, dá-se o nome de coluna cromatográfica. A fase móvel, por sua vez, é o solvente no qual as proteínas estarão dissolvidas e que tem a função de carregá-las ao longo de toda a coluna cromatográfica. A intensidade com que as proteínas interagem com a fase estacionária vai deter- minar o tempo que elas ficarão retidas na coluna. Quem interage mais, fica mais tempo. Quem interage menos, fica menos tempo. As proteínas provenientes do extrato bacteriano apresentarão diferentes caracterís- ticas de polaridade, carga, tamanho, afinidade e essas características é que permitem a purificação da proteína recombinante daquelas todas outras proteínas da bactéria. Existem diferentes tipos de cromatografia, sendo as mais comuns: adsorção, troca iônica, exclusão por tamanho e afinidade. Cada uma delas apresenta diferenças na maneira pela qual a proteína interage com a fase estacionária (coluna cromatográfica). Veja a seguir: • Adsorção: a fase estacionária pode conter sítios de adsorção polares ou apola- res. Portanto, a purificação da proteína se dará por sua polaridade; • Exclusão por tamanho: a fase estacionária contém “poros”. Moléculas peque- nas entram e saem dos poros constantemente, enquanto moléculas maiores sequer entram. Dessa forma, as moléculas maiores migram mais rapidamente pela coluna cromatográfica e saem primeiro; • Troca iônica: a fase estacionária apresenta carga (positiva ou negativa). Assim, em uma cromatografia de troca iônica com fase estacionária positiva, as proteí- nas “negativas” irão interagir mais fortemente com a coluna e ficarão mais tem- po retidas, separando-se das proteínas “positivas”. O inverso se observa quando se utiliza coluna com fase estacionária negativa; • Afinidade: a fase estacionária possui moléculas por quem a proteína recombi- nante apresenta afinidade. Por exemplo: se for produzida uma enzima recombi- nante, pode-se acoplar à coluna cromatográfica o substrato para essa enzima. Se a proteína recombinante tiver afinidade a um metal (níquel ou cobalto, por exemplo), pode-se acoplar à coluna cromatográfica esse metal. Se houver um anticorpo específico contra a proteína recombinante, pode-se acoplar à coluna cromatográfica esse anticorpo. 26 27 A utilização de anticorpos específicos é a forma mais eficiente para purificar uma proteína recombinante. Na Figura a seguir, temos um esquema desse processo. No nosso exemplo, insulina ou eritropoietina seriam purificadas após o rompi- mento das bactérias que as produziram. Todo o extrato proteico seria submetido à separação cromatográfica em coluna de afinidade com anticorpos anti-insulina ou antieritropoietina. Todas as proteínas que não têm afinidade pelo anticorpo não se ligam à coluna e passam direto. Segue-se a eluição da proteína recombinante, que é o ato de desligá-la do anticorpo e recolhê-la em um tubo a parte. Figura 19 Fonte: Adaptado de Khan Academy Teste Seu Conhecimento 1. “A Cromatografi a Líquida de Alta Efi ciência (CLAE) é um método físico de separação no qual os componentes a serem separados estão distribuí- dos entre duas fases que estão em íntimo contato. Uma das fases perma- nece estacionária, enquanto a outra se move através dela”. Em que fase estará a proteína que você quer purifi car? O que deve estar presente na outra fase?; 2. Quais os diferentes tipos de cromatografi a para purifi cação de proteínas? Existe alguma que seja mais efi ciente? Explique. Em Síntese Nesta Unidade, vimos o que é Biotecnologia, sua história e algumas áreas onde pode ser utilizada. Demos maior enfoque à Tecnologia do DNA Recombinante, que é a ferramenta básica para muitas dessas aplicações. Aprendemos o processo de clonagem gênica, como expressar e purificar uma proteína recombinante. Lembre-se de que essa metodologia pode ser aplicada a uma variedade de genes. Tudo vai depender do interesse e aplicação do pesquisador. 27 UNIDADE Introdução à Biotecnologia Material Complementar Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade: Livros Biologia Molecular da Célula ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da Célula. Porto Alegre: Artmed, 2011. 1396p. Biologia Molecular do Gene WATSON, J. D. et al. Biologia Molecular do Gene. Porto Alegre: Artmed, 2015. 912p. Capítulo 8: Manipulação de proteínas DNA e RNA. Biotecnologia I: Princípios e Métodos BRUNO, A. N. Biotecnologia I: Princípios e Métodos – Série Teken – Capítulo 1 – Tendências e perspectivas da Biotecnologia, p. 10. Leitura Transformação & seleção bacteriana https://bit.ly/39BVeR9 28 29 Referências ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da Célula. Porto Alegre: Artmed, 2011. 1396p. COOPER, G. M. A célula: uma abordagem molecular. 3.ed. Porto Alegre: Artmed, 2007. 736p. De ROBERTIS, E. M. F.; HIB, J. Biologia Celular e Molecular. 16.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2014. 372p. JUNQUEIRA, L. C. U.; CARNEIRO, J. Biologia Celular e Molecular. 9.ed. Rio de Janeiro: Guanabara, 2015. 376p. LODISH, H. et al. Biologia Celular e molecular. 7.ed. Porto Alegre: Artmed, 2015. 1244p. KARP, G. Biologia celular e molecular: conceitos e experimentos. Barueri: Manole, 2005. 832p. WATSON, J. et al. Biologia Molecular do Gene. 7.ed. Porto Alegre. Artmed, 2015. ZAHA, A., FERREIRA, H. B., PASSAGLIA, L. M. P. Biologia Molecular básica. 5.ed. Porto Alegre: Artmed, 2014. 416p. 29
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