Reacao em Cadeia da Polimerase (PCR)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL
LABORATÓRIO DE GENÉTICA MOLECULAR (LABGEM)
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
Fortaleza/CE
2009
ISABELLE SILVA-FERNANDES
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 Técnica de biologia molecular empregada para se obter amplificação de fragmentos alvo de DNA in vitro, empregando elementos do processo natural de replicação do DNA;
 Produtos da PCR são chamados Amplicons
 DEFINIÇÃO
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 BREVE HISTÓRICO
 
 Prêmio Nobel em 1993 
Kary Mullis
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 Propriedades importantes do DNA para sua manipulação
 Após desnaturação (separação das fitas por altas temperaturas ou meios alcalinos), filamentos do DNA se ligam exatamente nos mesmos pontos na renaturação. 
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 Propriedades importantes do DNA para sua manipulação
 Pares CG três pontes de H: mais difíceis de separar que AT (apenas duas pontes). Quanto mais CG no DNA, mais difícil será de desnaturar.
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 PCR
 Componentes
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 1969 – T. Brock e H. Freeze relataram a descoberta de uma nova espécie de bactéria – Thermus aquaticus – sobrevive na água a temperatura média de 75ºC
 DNA POLIMERASE TERMOESTÁVEL
Yellowstone National Park
 Várias enzimas isoladas desse microorganismo incluindo a primeira DNA polimerase termoestável – Taq DNA polimerase (1976)
 BREVE HISTÓRICO
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 PCR
 A reação
DESNATURAÇÃO → ANELAMENTO  EXTENSÃO
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 PCR
 A reação: 1º ciclo
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 PCR
Polimerização no sentido 5’ 3’ 
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 PCR
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 PCR
 A reação: após sucessivos ciclos
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 VARIANTES
 PCR - PROTOCOLOS
Temperatura de anelamento;
Região a ser amplificada;
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 ELETROFORESE
 É a migração de partículas em um determinado gel (gel de agarose, poliacrilamida) de acordo com seu tamanho e sua carga elétrica;
 O gel é formado por conjuntos de moléculas e polímeros que formam uma rede;
 A eletroforese normalmente é utilizada para separar proteínas ou moléculas de DNA ou RNA 
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 ELETROFORESE
 Enquanto o gel ainda está líquido, coloca-se um pente que induzirá a formação de poços;
 Quando o gel está sólido, retira-se o pente. Nos poços formados, aplica-se DNA, RNA ou proteínas. 
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 ELETROFORESE
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 ELETROFORESE
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506 pb
491 pb
 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
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 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
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 Detecção de mutações/polimorfismos em genes específicos (diagnóstico precoce em estudos de câncer e doenças genéticas);
 Estudos diagnósticos de doenças infecciosas, detecção de bactérias, vírus e protozoários;
 Elucidar relações evolutivas entre espécies;
 Grande potencial na Medicina Forense (Ex: Teste de Paternidade; Inclusão/Exclusão de suspeitos).
 APLICAÇÕES DA PCR
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 POLIMORFISMO DE MICROSSATÉLITES
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 TESTE DE PATERNIDADE
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 IDENTIFICAÇÃO DE SUSPEITO
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 IDENTIFICAÇÃO DE SUSPEITO
 V S1 S2 M V AMOSTRA
S2 é culpado
S1 não pode ser excluído
S2 não pode ser excluído
Não existem informações suficientes para tirar conclusões
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 POLIMORFISMO
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 COMO DETECTAR UMA MUTAÇÃO DE PONTO?
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 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
 Endonucleases de restrição encontradas nas bactérias;
 A descoberta de um vasto número de enzimas de restrição levou à criação de uma nomenclatura uniforme;
	Ex: Eco R1
		E = primeira letra do gênero (Escherichia)
		co = duas primeiras letras do epíteto (coli)
		R = linhagem
		1 = primeira enzima extraída dessa bactéria 
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 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
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 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
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 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
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 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
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OBRIGADA!
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