Testes moleculares

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Camila Mariana Castro de Oliveira 
 Medicina Nove de Julho 
 BCM 2 – Biologia molecular 
 
 
 
➛ Diagnóstico de doenças hereditárias e infecciosas 
➛ Detecção de agentes patogênicos e mutações 
➛ Determinação do sexo a partir do sangue materno 
➛ Medicina forense 
➛ Verificação de polimorfismos 
➛ Verificação de mutações 
➛ Analise de expressão gênica 
➛ As amostras podem ser obtidas por meio de 
diferentes procedimentos, como punção de vasos 
sanguíneos, biópsias, esfregações, cultivos 
microbiológicos ou fragmentos de tecidos, de acordo 
com o organismo envolvido 
➛ O acondicionamento adequado das amostras após a 
coleta é essencial para a sua preservação até o 
momento da extração. Além disso, todo o material 
utilizado no procedimento deve ser esterilizado, a fim 
de evitar a contaminação do DNA ou RNA 
➛ Etapas: 
 ✓ Extração de RNA ou DNA 
 ✓ Análise da integridade do RNA ou DNA 
 ✓ Quantificação do RNA ou DNA 
 ✓ Conversão de RNA para cDNA (DNA originado a 
partir de um RNAm – enzima transcriptase reversa) – 
extração de rna 
 ✓ Técnica molecular -> PCR, sequenciamento, NGS, 
etc 
 
Extração – RNA ou DNA 
 
1) Lise celular 
➛ A lise celular envolve o rompimento das células e 
deve ser realizada em soluções tamponadas, 
geralmente contendo um detergente 
➛ A adição do agente quelante EDTA também auxilia 
na inibição da ação das DNAses por se ligar aos 
cofatores Ca+2 e Mg+2 da enzima DNAse 
➛ O NaCl contribui rompendo ligações iônicas das 
cadeias peptídicas, auxiliando na desnaturação das 
proteínas e adicionalmente promove a aglomeração 
das moléculas de DNA 
2) Separação dos constituintes celulares 
➛ Após a lise das membranas, os ácidos nucleicos são 
liberados na solução aquosa juntamente com outros 
constituintes celulares dos quais devem ser isolados 
➛ Para esse fim, são utilizados solventes orgânicos, 
como o fenol ou clorofórmio, que desnaturam 
proteínas. Nessa etapa. após a centrifugação, o DNA 
permanecerá solúvel na fase aquosa (sobrenadante) 
3) Precipitação do DNA 
➛ Em condições de baixa temperatura e elevada 
contração salina (devido ao NaCl presente no tampão 
da lise), a adição de etanol absoluto, isopropanol ou 
soluções acetatos de amônio ou sódio resulta na 
precipitação do DNA, o que forma em soluções um 
aglomerado de filamentos esbranquiçados que podem 
ser pescados com um bastão de vidro ou concentrados 
no fundo do tubo por centrifugação 
 
 
 
 Camila Mariana Castro de Oliveira 
 Medicina Nove de Julho 
 BCM 2 – Biologia molecular 
 
 
➛ PCR -> reação em cadeia da polimerase 
➛ Técnica que permite a amplificação da quantidade 
de DNA específico utilizando a enzima Taq DNA 
polimerase, dNTP, sequências iniciadoras específicas 
(primers) e variações de temperatura controladas 
➛ Primers: 
 ✓ Responsáveis pela localização da sequência alvo 
 ✓ Oligonucleotídeos com 20-24 bases 
 ✓ O pareamento dos primers com a sequência alvo 
se faz pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio, 
segundo o pareamento convencional descrito por 
Watson e Crick 
 
1) Desnaturação -> as moléculas de DNA são 
inicialmente desnaturadas por alta temperatura (acima 
de 90°) – “abrir a fita” 
2) Anelamento -> a seguir, a temperatura é diminuída 
(usualmente entre 45° e 65°) e dois oligonucleotídeos 
iniciadores (primers) pareiam-se com suas sequencias 
complementares nas fitas molde 
3) Polimerização -> posteriormente, pela disponibilidade 
de extremidade 3’OH dos primers, a enzima DNA 
polimerase realiza a síntese das novas fitas 
➛ PCR em tempo real: 
 ✓ Técnica realizada em um instrumento fechado, que 
contém um termociclador acoplado a um sistema 
óptico para a excitação da fluorescência e um sistema 
de detecção dos sinais fluorescentes 
 ✓ Encontra-se acoplado a um computador com um 
software que captura os dados e faz a análise final da 
reação 
 
➛ Sequenciadores de DNA são equipamentos que 
leem uma amostra de DNA e geram um arquivo 
eletrônico com símbolos que representam a sequência 
de bases nitrogenadas – A, C, G, T – contidos na 
amostra 
 
 
 
 
 
➛ Cada tecnologia de sequenciamento possui uma 
estratégia diferente, mas em geral podemos identificar 
etapas comuns entre todos os sequenciadores 
➛ Benefícios: 
 ✓ Obter informações genômicas em curto tempo a 
um custo razoável 
 ✓ Flexibilidade para ser aplicada em uma série de 
estudos genômicos 
 ✓ Sequenciamento gênico completo em 
determinadas situações e condições biológicas 
 ✓ Exoma 
➛ Sequenciamento completo do exoma na prática 
clínica: 
 ✓ O termo exoma refere-se ao conjunto de éxons 
presentes no genoma de grande parte dos seres vivos, 
composto por cerca de 180.000 éxons nos humanos 
 ✓ O sequenciamento completo do exoma consiste na 
análise dos éxons do DNA, que correspondem às 
regiões codificantes do mRNA 
Sequenciador de eletroforese -> processa no máximo 
96 fragmentos por vez 
NGS -> podem ler até bilhões de fragmentos ao 
mesmo tempo 
 Camila Mariana Castro de Oliveira 
 Medicina Nove de Julho 
 BCM 2 – Biologia molecular 
 
 
➛ Identifica quais são as mutações entre os 
microrganismos circulantes 
➛ Pode identificar espécies novas 
➛ Auxilia no diagnóstico e tratamento 
➛ Auxilia na definição de perfis epidemiológicos 
➛ Metodologia -> técnica de sequenciamento 
automático de DNA 
 
 
➛ Técnicas que visam o isolamento de genes e a 
introdução de genoma exógeno em outros organismos 
➛ São produzidos organismos transgênicos, com 
diversas finalidades 
➛ Ampla aplicação comercial e tecnológica 
 
 
➛ São enzimas encontradas em bactérias, utilizadas 
para realizar cortes no DNA 
➛ Cada enzima de restrição corta o material genético 
em um sítio específico, que são palíndromas 
 
➛ As extremidades das partes cortadas recebem o 
nome de extremidades de ligação, pois se encaixam 
perfeitamente