COMPOSTOS FENÓLICOS

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Synthesis, antitumor and antifungal activity and molecular docking of ten types of ferulic amides.
Compostos Fenólicos
Compostos fenólicos ocorrem universalmente no reino das plantas e são parte de um amplo e complexo grupo de substâncias orgânicas. As plantas são capazes de sintetizar e acumular uma ampla variedade de composto fenólicos, conferindo uma proteção contra o ataque de radicais livres, advindos de subprodutos do processo da fotossíntese e contra danos teciduais [1]. Os compostos fenólicos de fontes vegetais podem ser classificados em dois grupos: flavonóides e os não flavonoides (ou fenólicos simples), sendo ambos considerados metabólitos secundários presentes em frutas e vegetais (Figura 1).
Figura 1.7: Classificação química dos compostos fenólicos. Esquema elaborado por Magnani et al., 2014.
Os denominados de flavonoides, também conhecidos como polifenóis, são os que apresentam a estrutura química descrita como C6-C3-C6, sendo os compostos mais diversificados do reino vegetal. Já os denominados de não flavonoides (ou fenólicos simples) são classificados em três grupos [1][2][3]:
0. os derivados de ácidos hidroxibenzóico que possuem sete átomos de carbono (C6- C1) e, são os ácidos fenólicos mais simples encontrados na natureza. O ácido gálico é um representante dos ácido hidroxibenzóico.
0. os derivados de ácidos hidroxicinâmicos que possuem nove átomos de carbono (C6-C3), sendo sete os mais comumente encontrados no reino vegetal. Alguns exemplos são: ácidos cafeico, ferúlico, p-cumárico, sinápico.
0. As cumarinas são derivadas do ácido cinâmico por ciclização da cadeia lateral do ácido o-cumárico.
Ácido Ferúlico
O ácido ferúlico ( Figura 2) é um dos ácidos fenólicos mais abundantes nas plantas e pode ser encontrado em altas concentrações em alimentos como feijão marinho, farelo de milho, farelo de trigo, berinjela, alcachofra e beterraba [4][5][6][7]. Pode ser encontrado livre, dimerizado ou esterificado com proteínas e polissacarídeos na parede celular, como arabinoxilanos em gramíneas e xiloglucanos em bambu [5].
Figura 2: Estrutura química do ácido ferúlico
O ácido AF [ácido 3- (4-hidroxi-3-metoxifenil) prop-2-enóico] pode ser encontrado como um monômero, dímero, oligômero livre ou polímeros constituintes, ligados covalentemente por ligações ésteres com polissacarídeos, poliaminas e glicoproteínas e como éter ligado à lignina [8][9][10]. O AF possui dois isômeros: cis (líquido oleoso amarelo) e trans (cristal branco), o último correspondendo a 90% de sua ocorrência natural [11]. É sintetizado na via chiquimato / fenilpropanóide principalmente a partir da L-fenilalanina ou em gramíneas a partir da L-tirosina ( Figura 3) [12].
Apresenta uma ampla variedade de possíveis efeitos terapêuticos úteis no tratamento de câncer, diabetes e doenças pulmonares e cardiovasculares; efeitos hepatoprotetores, neuro-protetores e fotoprotetores; e propriedades antimicrobianas e anti-inflamatórias [6][7]. A ação antioxidante do ácido ferúlico esta relacionada à sua capacidade de interrupção da cadeia de radicais livres; porém, por outros mecanismos já foram avaliados, como capacidade de quelantes de metais – reconhecidos catalisadores do estresse oxidativo- e a inibição de enzimas envolvidas na produção de EROs [13]. 
A ação antioxidante do ácido ferúlico é devida, em especial, à sua capacidade de neutralizar três tipos de radicais livres; peroxido de hidrogênio, ânion superóxido e radical hidroxila, reduzindo a degradação de proteínas e lipídeos- provocadas em especial, pela radical hidroxila [14]. 
Figura 3: Biossíntese do ácido ferúlico
Ácido ferúlico como agente antitumoral
Apesar dos esforços globais para limitar a incidencia de câncer, ele se tornou a principal causa de morte nos últimos 50 anos. Com os cânceres que crescem rapidamente nos países desenvolvidos e em desenvolvimento, há uma necessidade urgente de desenvolver medicamentos mais eficazes. 
Os ácidos aromáticos no reino vegetal são agora reconhecidos como agentes quimiopreventores promissores. Eles exibem um amplo espectro de atividades farmacológicas, como o anticâncer.
O ácido ferúlico (ácido 4-hidroxi-3-metoxicinâmico, FA), era ativo contra a carcinogênese pulmonar pelo benzopireno.9 Adicionalmente, poderia diminuir a incidência de azoximetano. neoplasias intestinais reduzidas, sugerindo que ele tem potencial como agente inibidor do gérmen de arroz nas neoplasias do cólon.
A atividade anticâncer da FA está relacionada à sua propriedade antioxidante para eliminar a ERO e estimular a atividade de enzimas antioxidantes (Hirose et al ., 1999).
Mori et al . (1999) estudaram os efeitos da FA no câncer de boca após causar carcinogênese quimicamente induzida em ratos usando 1-óxido de 4-nitroquinolina (4NQO), expondo-os a água potável contendo 0,02 g de 4NQO / kg por 5 semanas e após esse período, submetendo-os a 0,5 g FA / kg de peso corporal. Verificou-se que a incidência de carcinomas na língua e lesões pré-neoplásicas foram significativamente menores no grupo que recebeu a dose de AF do que no grupo controle, sugerindo que os AF possuem atividade quimiopreventiva contra o câncer bucal. Em outro estudo realizado por Kawabata et al.. (2000), os efeitos da FA administrada às dietas de camundongos foram examinados após carcinogênese induzida no cólon pelo azoximetano (OMA). Após 35 semanas, o grupo que recebeu doses de 0,25 e 5 g AF / kg de peso corporal apresentou menor incidência de carcinomas do cólon em relação ao grupo que recebeu apenas OMA. Também foi observado que as enzimas responsáveis ​​pela desintoxicação do fígado e do cólon, a glutationa S-transferase e a quinona redutase, apresentaram atividades aumentadas em camundongos tratados com FA, sugerindo que essas enzimas estão diretamente relacionadas ao efeito bloqueador causado pela FA na carcinogênese induzida por OOM.
Alias e cols.. (2009) avaliaram e compararam o potencial quimiopreventivo da FA aplicada topicamente e administrada por via oral contra a carcinogênese cutânea induzida por 7,12-dimetilbenz [a] antraceno (DMBA), estimando o status dos agentes de desintoxicação das fases I e II, subprodutos da peroxidação lipídica e antioxidantes. O carcinoma de células escamosas da pele foi induzido na parte posterior raspada dos ratos, pintando com DMBA (25 µg em 0,1 mL de acetona) duas vezes por semana, durante 8 semanas. A administração oral de FA impediu completamente a formação de tumores na pele e reverteu o status dos agentes de desintoxicação das fases I e II, subprodutos da peroxidação lipídica e antioxidantes para valores quase normais em camundongos tratados com DMBA. No entanto, quando aplicada topicamente, a FA não mostrou atividade quimiopreventiva significativa durante a carcinogênese da pele induzida por DMBA nos camundongos.
Outro estudo recente usando ratos Sprague-Dawley avaliou o potencial quimiopreventivo da FA, monitorando a incidência de tumores, bem como analisando as enzimas de desintoxicação da fase II durante a carcinogênese mamária induzida pelo DMBA. A administração oral de FA na dose de 40 mg / kg de peso corporal impediu a formação de tumores em 80% dos ratos (Baskaran et al ., 2010). Embora não exista um mecanismo detalhado do processo, o efeito modulador da FA na cascata de desintoxicação da fase II pode ter um papel possível e merece atenção devido ao seu potencial terapêutico na prevenção do câncer mamário.
Agente antimicrobiano e anti-inflamatório
Estudos realizados in vitro para a atividade do FA e do ferulato de etila (EF) no HIV revelaram que esses compostos reduziram a liberação e a atividade do antígeno p24, uma proteína essencial do capsídeo do vírus, após o tratamento de células infectadas cronicamente com 1, 5 e 10 µmol L -1 de FA ou EF. FA e FE a 5 µmol L -1 inibiram a replicação do vírus sem citotoxicidade, sugerindo que a FA e seus derivados são moléculas potencialmente úteis para terapia antiviral (Edeas et al ., 1995).
A FA também inibe o crescimento de bactérias Gram-positivas e negativas (Escherichia coli)e já está presente na composição de medicamentos anti-inflamatórios utilizados na Medicina Oriental (Jeong et al ., 2000).
Hirabayashi et al. (1995) investigaram os efeitos da FA e do ácido isoferulic (IFA), componentes ativos do rizoma das espécies de Cimicifuga (plantas usadas como agentes anti-inflamatórios em medicamentos japoneses) na produção de interleucina-8 murina (IL-8) em resposta à influenza infecções por vírus in vitro e in vivo utilizando o ensaio imunossorvente ligado a enzima sanduíche de anticorpo. A IL-8 é uma proteína da família das citocinas que atua como mediadora no processo inflamatório, que também é expressa nas células tumorais. In vitroNeste estudo, a linha celular de macrófagos murinos RAW 264.7 foi infectada com 10 PFU (unidades formadoras de placas) do vírus influenza e cultivada na presença ou ausência de ácidos fenólicos. Os níveis de IL-8 foram reduzidos após 20 h no meio condicionado quando comparado ao controle, mas o efeito da IFA foi maior que o da FA: os níveis de IL-8 foram reduzidos para 43% e 56% (comparado ao controle) em presença de 100 mg / mL de IFA e FA, respectivamente. No estudo in vivo , os ratos foram infectados com 1 PFU do vírus e receberam administrações orais diárias da Cimicifuga heracleifoliaextrato (5 mg / mouse / dia), FA (0,5 mg / mouse / dia), IFA (0,125 mg / mouse / dia) ou solução salina tamponada com fosfato. Todos os medicamentos apresentaram tendência a reduzir os níveis de IL-8 observados por lavagem broncoalveolar (LBA) dois dias após a infecção, e ambos os ácidos reduziram significativamente o número de neutrófilos exsudados na LBA. Os dados indicam que esses dois compostos são os princípios mais ativos das espécies anti-inflamatórias obtidas de Cimicifuga. 
Zerrin Canturk 2018, investigar a sinergia entre efeitos anticandidais e apoptóticos do ácido ferúlico e da caspofungina contra Candida albicans e Candida glabrata, com a ajuda de um ensaio quantitativo de microdiluição em tabuleiro de damas usando 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2, Brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT) como corante de viabilidade. Os efeitos apoptóticos das concentrações de caspofungina e ácido ferúlico (isolados e combinados) foram analisados ​​para C. albicans e C. glabrata com base nas capacidades de ligação da anexina V-propídio ao iodeto de propídio usando análise citométrica de fluxo. C. albicans mostrou um efeito sinérgico, representado por um índice de concentração inibitória fracionária <<0,5, mas C. glabrata não mostrou efeito sinérgico (índice de concentração inibitória fracionária> 0,5). Os efeitos apoptóticos precoces e tardios das concentrações de caspofungina e ácido ferúlico (1 μg / mL e 1000 μg / mL) foram calculados em 55,7% e 18,3%, respectivamente, enquanto seus efeitos necróticos foram determinados em 5,8% e 51,6%, respectivamente, usando fluxo análises citométricas. Os efeitos apoptóticos da combinação de caspofungina e ácido ferúlico em concentrações de 1 μg / mL e 1000 μg / mL em C. albicans e C. glabrata foram 73,0% e 48,7%, respectivamente. O ácido ferúlico também demonstrou um efeito sinérgico em combinação com caspofungina contra C. albicans. Outra possibilidade é combinar a droga anticandida existente com fitoquímicos para aumentar a eficácia da droga anticandida.
O ácido ferúlico é rapidamente absorvidono trato gastrintestinalcom baixa biodisponibilidade, após a administração oral (LAFAY et al., 2006). O AF é insolúvel em água e óleo, o que restringe suas aplicações. Portanto, a fim de melhorar sua lipossolubilidade e para alcançar anticancerígenos e antifungicidas mais potentes, é necessário modificar suas estruturas, e a amidação é uma alternativa interessante para isso. As amidas são bases fracas, e o par de elétrons livres do nitrogênio é direcionado ao oxigênio da carbonila devido a uma maior eletronegatividade. Isso cria um momento dipolo na molécula, que aumenta a polaridade das amidas, o que explica seu alto ponto de fusão e de ebulição quando comparado com ésteres, ácidos carboxílicos, aldeídos e cetonas. Esse fenômeno também aumenta a capacidade das amidas de serem solvatadas por moléculas de água ou de se agregar com outras moléculas através de pontes de hidrogênio (na atualidade, são chamadas de ligações de hidrogênio) (IUPAC, 1997).
MATERIALS AND METHODS
General procedure for the synthesis of compounds
*BOP as coupling agent
	Into a 50 mL flask equipped with magnetic stirrer with a solution of trans-ferulic acid (0.1 g, 0.51 mmol) in DMF (1.02 mL, 0.51 mmol) was added 0.51 mmol of the respective amine of the compound to be prepared, 0.068 mL (0.51 mmol) of Et3N and another containing 0.225 g of BOP in 1.02 mL of dichloromethane. After stirring in an ice bath for 30 minutes, the reaction mixture was stirred at room temperature until the starting material was completely consumed. The dichloromethane was then removed on a rotary evaporator. The remaining contents of the flask were dissolved in 10 mL of ethyl acetate, poured into separatory funnel with 10 mL of distilled water and extracted with ethyl acetate (three times with 10 mL). The organic phases were combined and washed three times with distilled water; after treatment with 10 mL 1 M NaHCO3 and 10 mL of 1N HCl, were last washed with distilled water, dried with Na2SO4, and the solvent evaporated. The products formed were isolated and purified by column chromatography on silica gel 60. As mobile phase the system was used Hexane: Ethyl acetate. The structural identification was made by infrared, 1H and 13C nuclear magnetic resonance (NMR) analysis and comparison with the literature data.
*DCC as coupling agent
	Into a 50 mL flask equipped with magnetic stirrer containing 3 mL dichloromethane, 0.1g (0.51 mmol) trans-ferulic acid, 0.51 mmol of the respective amine of the compound to be prepared were added, 0.006g DMAP, which corresponds to 10 mol%, and 0.105g DCC (0.51 mmol). After stirring at room temperature for 24 hours the dichloromethane was removed by rotary evaporator. The remaining contents of the flask were dissolved in 10 mL of ethyl acetate, poured into separatory funnel with 10 mL of distilled water and extracted with ethyl acetate (three times with 10 mL). The organic phases were pooled and washed three times with distilled water and, after treatment with 10 mL of 1 M NaHCO3 and 10 mL of 1N HCl, were washed last with distilled water, dried with Na2SO4, and the solvent, evaporated. The formed products were isolated and purified by column chromatography on silica gel 60. As the mobile phase, the hexane: ethyl acetate system was used. The structural identification was made by infrared, 1H and 13C nuclear magnetic resonance (NMR) analysis and comparison with the literature data.
Cells
HepG2 cells (human hepatocellular carcinoma), HCT116 (human colon carcinoma), HL-60 (human promyelocytic leukemia) and MRC5 (human lung fibroblast) obtained from the ATCC were used. Cells were cultured in cell culture bottles (75 cm 3, 250 mL volume), media used were RPMI 1640 and supplemented with 10% fetal bovine serum. Cells were maintained in incubators with 5% CO2 atmosphere at 37 ° C. Cellular growth was monitored daily with the use of an inversion microscope. The medium was changed whenever cell growth reached the necessary confluence for nutrient renewal. For the maintenance of adhered cells, trypsin (0.25%) was used for the cells to detach from the walls of the bottles. Cell cultures showed microplasma negatives, as judged by placement with Hoechst (Mycoplasma Stain Kit, Cat. MYC1, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
Cytotoxicity assay
The biological step to test antitumor activity was done at the Laboratory of Tissue Engineering and Immunopharmacology - LETI, Oswaldo Cruz Foundation (FIOCRUZ). To evaluate the cytotoxicity of the substances, the alamar blue test was performed after 72 hours of exposure with test substances 11. Initially, the cells were plated in 96-well plates (100 μl / well of a solution of 0.3 x 106 cells / ml for cells in suspension and 0.7 x105 cells / ml for adhered cells). After 24 hours of incubation, the test substances dissolved in DMSO were added to each well and incubated for 72 hours. Doxorubicin was used as a positive control. The negative control received the same amount of DMSO. Four hours (twenty-four hours for PBMC) before the end of the incubation period, 20 μL of stock solution (0.312 mg / mL) of alamar blue (resazurin) was added to each well. Absorbances were measured at wavelengths of 570 nm (reduced) and 595 nm (oxidized) using a plate reader.
Micro-organismos 
As cepas de Candida spp. utilizadas nos ensaios microbiológicos foram provenientes da coleção holandesa CBS (Central Bureau voor Schimmelcultures) – C. albicans CBS 562, C. tropicalis CBS 94 e C. krusei CBS 73.
Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
A CIM foi determinada pela técnica de microdiluição em caldo Sabouraud Dextrose (CSD, KASVI, Curitiba, Brasil), de acordo com protocolo proposto pela CLSI (2002), onde foi avaliada atividade antifúngica dos produtos produzidos a uma concentração inicial de 1.000 µg/mL, frente a cepas fúngicas do gênero Candida: C. albicans CBS 562; C. tropicalis CBS 94 e C. krusei CBS 73. Foram utilizadas placas de microtitulação de 96 poços e inicialmente foram inseridos em cada poço 100 µL de CSD. A seguir, 100 µL da solução da substância, foram inseridos no primeiro poço de cada coluna e diluídos seriadamente através da retirada de uma alíquota de 100 µL da cavidade mais concentrada para a cavidade sucessora. Ao fim de cada coluna, a última alíquota retirada foi desprezada. Em seguida, foram inseridos em cada poço 100 µL do inóculo da cepa fúngica, preparado de acordo com as normas do CLSI (2002) em CSD com concentração final equivalente a 2,5 x 103 UFC/mL. As placas foram incubadas em estufa por 24 h a 37 °C e, em seguida, realizada leitura visual dos resultados a partir da observação da formação de aglomerados de células fúngicas no fundo dos poços. Para confirmação da presença de micro-organismos viáveis, foram inseridos 50 µL do corante TCT (2,3,5-trifenil cloreto de tetrazólio) em cada poço da placa e a mesma incubada novamente em estufa por 24h. Neste sentido, na segunda leitura, foram considerados contendo micro-organismos viáveis os poços corados em vermelho. Foram considerados a CIM a menor concentração da substância capaz de inibir visivelmente o crescimento fúngico. Os ensaios foram realizados em triplicata e a CIM calculada pela moda dos resultados obtidos. O controle positivo utilizado para este teste foi nistatina (Sigma-Aldrish, São Paulo, Brasil), a uma concentração inicial de 12,5 µg/mL. Foi realizado controle de viabilidade das cepas, controle de esterilidade do meio de cultura e controle do DMSO (dimetilsulfóxido), utilizado para o preparo da solução dos produtos, simultaneamente ao ensaio. 
Determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM)
A partir dos resultados obtidos no ensaio para determinação da CIM, serão semeados 50 µL do conteúdo dos poços referentes a CIM e as duas concentrações imediatamente mais concentradas (CIMx2 e CIMx4) em placas de Petri contendo ágar Sabouraud Dextrose (ASD, KASVI, Curitiba, Brasil). As placas serão incubadas em estufa a 37°C por 24h. A leitura visual será realizada através da observação de crescimento fúngico no meio de cultura. Será considerada CFM, a menor concentração capaz de inibir o crescimento visível do subcultivo (CLSI, 2002). 
A relação CFM/CIM será calculada de forma a determinar se a substância possui uma atividade fungistática (CFM/CIM ≥ 4) ou fungicida (CFM/CIM <4) (SIDDIQUI et al., 2013).
Verificação do possível mecanismo de ação da substância sobre a parede celular fúngica – Ensaio do sorbitol
Será realizada a técnica da microdiluição (CLSI, 2002) na presença de sorbitol (INLAB, São Paulo, Brasil), protetor osmótico, com o objetivo de verificar o possível mecanismo de ação dos produtos sobre a parede celular de C. albicans (CBS 562). A técnica será realizada de forma semelhante à determinação da CIM, no entanto o inóculo utilizado será preparado com sorbitol a uma concentração final de 0,8 M. As placas serão incubadas em estufa a 37°C e as leituras serão realizadas após 24 e 48 h de incubação.
O controle positivo utilizado neste teste será o Diacetato de Caspofungina – (Sigma-Aldrish, São Paulo, Brasil), a uma concentração inicial de 5 µg/mL, (Letscher-Bru; Herbrecht, 2003; HAO et al., 2013). Será considerada a CIM na presença de sorbitol a menor concentração da substância capaz de inibir visivelmente o crescimento fúngico (FROST et al., 1995; FREIRES et al., 2014; LEITE et al., 2014).
Molecular docking
According to the experimental results, the following proteins of Candida albicans were selected as potential targets of compounds 9 and 10 and used in modeling studies: Lanosterol 14-alpha demethylase (L-14a-D), C-8 sterol isomerase (C-8-SI), Squalene monooxygenase (SQM) and Thymidylate synthase (TS). The X-ray structure of L-14a-D in complex (PDB code 5tz1) with an inhibitors was obtained from the Protein Data Bank [1]. The rest of the potential targets had no structure determined and homology models were obtained for them from the SWISS-MODEL server [2]. The initial 3D structures of the compounds were obtained with the OMEGA software [3] and AM1-BCC charges were added to its most stable conformer with MOLCHARGE [4].
The Gold software [5] was used for molecular docking of compounds 9 and 10 to their potential targets following the protocol described in our previous publication [6]. In brief, all water and non-catalytic cofactors were removed from the receptors. Co-crystallized ligands in the receptor or in the templates used for homology modeling were used to define the ligands binding pocket. The CHEMPLP scoring function was selected for primary docking with ligand flexibility set to Very Flexible (200% Search efficiency). The number of explored binding modes was set to 30 and the resulting binding poses were rescored with the GoldScore, ChemScore and ASP scoring functions of Gold.
The selection of the most probable binding modes of 9 and 10 to the explored targets was carried out following the same approach as in [6]. Given a score Si,j for conformer Ci according to the scoring function Sj, its scaled score Zi was computed as:
			(eq. 1),
where is the mean of the scoring function Sj across all conformers and is the standard deviation of the Sj values. Conformers with Zi>1 were selected as possible binding modes of compounds 9 and 10 to the targets under investigation and selected for further investigations.
Molecular dynamics and MM-PBSA calculations
Amber 2018 [7] was employed for Molecular Dynamis (MD) simulations. The ff14SB and gaff force fields were chosen for proteins and non-aminoacidic residues, respectively. The same modeling protocol was applied to the predicted complexes. This protocol included two energy minimization steps, heating, equilibration and the production runs. MD simulations took place in explicit solvent and otherwise noted default parameters were employed.
The topology and corresponding forcefield modifications of compounds 9 and 10 as well as of the catalytic cofactors were obtained with antechamber. A truncated octahedron box was constructed around the systems that were solvated with TIP3P water molecules. The excess charges on the systems were neutralized through the addition of either Na+ or Cl- ions. In all stages of simulation the PME method was used to treat long range electrostatic interactions. The PME cutoff distance was set to 12 Å for the first energy minimization step and to 10 Å for the rest of the MD stages listed above.
The solvated and neutralized systems were minimized for 500 steps of the steepest descent method followed by 500 cycles of conjugate gradient at constant volume. During this first minimization stage a force constant of 500 kcal/mol.Å2 was used to restrain all atoms except water molecules and ions. The minimized system was then subject of the second minimization stage consistingin 1500 steps of the steepest descent method followed by 1000 cycles of conjugate gradient at constant volume with no restrains.
Afterward, the system was heated from 0 to 300 K at constant volume. All atoms except water molecules and ions were restrained with a force constant of 10 kcal/mol.Å2 during heating. Heating was performed for 10000 steps with a time step of 2 fs. From this stage on, a Langevin thermostat with a collision frequency of 1.0 ps-1 was employed and the SHAKE algorithm was used to constrain the bonds involving hydrogen atoms. The heated system was then equilibrated at constant pressure of 1 bar and 300 K. Pressure was controlled using isotropic position scaling with a relaxation time of 2 ps during equilibration. The last snapshot derived from the equilibration process was used as input for 5 different MD simulations of 2 ns length each. Different initial velocities were assigned to each atom in all these MD simulations.
The free energy of binding of the complexes were estimated by means of MM-PBSA calculations performed with AmberTools 18 [7]. One snapshot every 100 ps spanning the 5 previously obtained MD trajectories was extracted for each system. In this way, 100 snapshots were obtained for free energy of binding calculations. For MM-PBSA calculations the ionic strength was set to 100 mM and default implicit solvent parameters were set.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A análise da razão estrutura-atividade das amidas derivadas do ácido ferúlico foi baseada nos resultados da concentração inibitória mínima nas células HecG2, HCT116, HL-60 e MRC5 obtidas da ATCC e as cepas de Candida spp. utilizadas nos ensaios microbiológicos foram provenientes da coleção holandesa CBS (Central Bureau voorSchimmelcultures) – C. albicans CBS 562, C. tropicalis CBS 94 e C. Krusei CBS 73. A preparação de tais compostos estruturalmente semelhantes, com alteração no número da cadeia alquil e no tipo de substituintes no anel aromático, como doadores ou retirada de elétrons, pode causar alterações significativas nas propriedades dos compostos e resultar em atividades antitumorais diferentes. Portanto, os resultados obtidos neste trabalho podem servir de referência para o desenvolvimento de novos protótipos antitumorais com perfil biológico mais promissor.
As modificações moleculares são determinantes para otimizar a atividade. Moléculas de origem vegetal, entre outras, podem ser utilizadas como protótipo para preparar análogos, com o intuito de potencializar o efeito contra determinado patógeno ou alvo farmacológico (THOMAS, 2003).
Os estudos de relação estrutura-atividade (SAR) são usados ​​para determinar as características químicas que influenciam a ação biológica de uma série de compostos análogos, uma vez que se baseia na premissa geral de que um medicamento atua em um local de ação específico ou uma enzima. Sabe-se que os análogos e seus respectivos alvos farmacológicos são flexíveis e possuem estruturas moleculares em mudanças contínuas (confômeros). Grupos insaturados e sistemas de anéis dão mais rigidez às moléculas e reduzem a quantidade de confomeros, aumentando a probabilidade de interação entre o análogo e seu alvo farmacológico. As funções químicas, como sistemas conjugados alifáticos, anéis aromáticos, heteroaromáticos, ésteres e amidas, também são considerados grupos rígidos (TASDEMIR, 2006). A rigidez das amidas é superior em comparação com os ésteres.
Para aumentar o caráter lipofílico de um análogo, é suficiente aumentar o radical alquil com a inserção de grupos metileno sequencialmente ou com ramificação. Supõe-se que a atividade melhore devido ao aumento da fluidez do composto pelas membranas biológicas, no entanto, dependendo do tamanho da cadeia, pode ocorrer o inverso, pois esse fenômeno também pode aprisionar o medicamento (THOMAS, 2003; KUMAR et al., 2005; SMIEŠKO, 2017b).
A mudança de atividade com a introdução de halogênios, anéis metil, alicíclicos e aromáticos em análogos não é previsível. Esses grupos servem como grupos volumosos, que dificultam o ataque enzimático e a consequente degradação de um análogo em estudo, pois aumentam a lipossolubilidade e as interações hidrofóbicas com seus respectivos alvos farmacológicos (THOMAS, 2003; BARREIRO, et al., 2011).
A introdução de anéis aromáticos permite maior rigidez molecular, o que contribui para aumentar essa interação. Anéis aromáticos heterocíclicos também são amplamente utilizados, e grupos funcionais, como enxofre e nitrogênio inserido no anel, podem aumentar a atividade farmacológica. A atividade farmacológica com a introdução de halogênios (cloro, flúor, bromo ou iodo) também varia de acordo com o halogênio usado e a posição quando inserido em anéis aromáticos. A introdução de grupos hidroxila aumenta a solubilidade em água do composto, e um novo local para as ligações de hidrogênio é formado. Isso aumenta a interação entre o análogo e o receptor ( THOMAS, 2003; BARREIRO, et al., 2011, SMIEŠKO, 2017a; SMIEŠKO, 2017b).
Química
Devido à atividade antitumoral e fungicida do ácido ferúlico e considerando as modificações moleculares com o intuito de melhorar essa atividade, 10 análogos foram preparados tomando-a como molde, a partir do ácido 3- (4-hidroxi-3-metoxifenil) prop-2-enóico na função amidas. Os radicais (R) das amidas estão demonstrados no esquema , a estrutura dos 10 compostos, bem como, os respectivos métodos para a preparação dos compostos.
Esquema: Reações utilizadas para a síntese das amidas e fórmula estrutural do radical R das amidas.
(a) BOP as coupling agent
Compound 1: (E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-N-isobutylacrylamide 
White amorphous solid. M.p. 75-81 °C. Isolated yield (67,23%). IV ʋmax (KBr, m-1): 3286 (O-H), 3083 (C-H sp2), 2961-2934 (C-H sp3), 1656 (C=O), 1592, 1548 e 1516 (C=C aromatic).1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.47 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.96 (s, 1H), 6.90 (d, J=8.0 Hz, 2H), 6.80 (d, J=8.1 Hz, 1H), 6.26 (d, J=16.0, 1H), 6.07 (s, NH), 3.77 (s, OCH3), 3.11 (d, J=6.0 Hz, 2H), 1.76 (sept, J= 6.5 Hz, 1H), 0.86 (d, J=6.0 Hz, 6H). 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ (ppm): 166.61, 147.48, 146.85, 141.08, 127.23, 121.95, 118.06, 114.83, 109.72, 55.74, 47.13, 28.64, 20.11. MS(MALDI) calculated for [C14H19NO3] [M + H]+ 250.310, found [M + H]+ 250,232.
Compound 2: (E)-N-cyclohexyl-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acrylamide 
yellow amorphous solid. M.p.197-205 °C. Isolated yield (83,00%). IV ʋmax (KBr,cm-1): 3108 (O-H), 3012 (C-H sp2), 2979-2892 (C-H sp3), 1657 (C=O), 1618, 1579 e 1532 (C=C aromatic). 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.58 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.04 (d, J=8.0 Hz, 1H), 6.93 (s, 1H), 6.85 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.50 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.23 (s, 1H, NH), 3.85 (s, 1H, OCH3), 3.55 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 1.88 (sl, 4H). 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ (ppm): 165.28, 147.59, 146.88, 127.82, 121.93, 116.12, 114.91, 110.35, 110.20, 56.16, 46.49, 39.88.
Compound 3: (E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-N-phenylacrylamide 
yellow amorphous solid. M.p. 165-170 °C. Isolated yield (87,55%).IV ʋmax (KBr, cm-1): 3283 (O-H), 3066(C-H sp2), 2936-2855 (C-H sp3), 1654 (C=O), 1617, 1542 e 1514 (C=C aromatic).1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.52 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.04 (s, 1H), 6.98 (d, J= 14.0 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.27 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 5.65 (s, NH); 3.88 (s, OCH3); 1,56 (m, 11H). 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ (ppm): 165.46, 147.45, 146.82, 141.13, 127.49, 122.27, 118.48, 114.82, 109.75, 56.08, 48.67, 33.37, 25.66, 24.99.
Compound 4: (E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-N-isobutylacrylamide 
yellow amorphous solid. M.p. 143-147 °C. Isolated yield (91,38%). IV ʋmax (KBr, cm-1): 3361 (O-H), 3065 (C-H sp2), 2944 (C-H sp3), 1654 (C=O), 1583, 1555 e 1518 (C=C aromatic). 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ(ppm): 10.12 (s, OH); 7.69 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.51 (d, J=16.0; 1H), 7.30 (t, J=8.0 Hz, 2H), 7.18 (s , 1H), 7.07 (d , J=8.0 Hz, 1H), 7.02 (d, J=8.0 Hz, 1H), 6.82 (d, J=8.0, 1H), 6.65 (d, J=16.0 Hz, 1H), 3.81 (s, NH), 3.58 (s, OCH3). 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ (ppm): 164.30, 148.82, 148.06, 140.71, 139.62, 128.94, 126.38,123.39, 122.23, 119.56, 119.10, 115.96, 110.99, 55.62.
Compound 5: (E)-N-benzyl-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acrylamide 
White amorphous solid. M.p. 143-147 °C. Isolated yield (70,63%). IV ʋmax (KBr, cm-1): 3337 (O-H), 3090 (C-H sp2), 2977 (C-H sp3), 1656 (C=O), 1621,1587 e 1552 (C=C aromatic). 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.55 (d, J = 16.0 Hz, 1H); 7.26 (sl, 4H); 6.88 (t, J= 8.0Hz, 2H); 6.63 (d, J = 6.0 Hz, 1H); 6.33 (d, J = 16.0 Hz, 1H); 6.03 (d, J = 8.0 Hz, 1H); 5.21 (s, 1H,NH); 4.48 (s, 2H); 3.77 (s, OCH3). 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ (ppm): 164.3, 146.9, 146.2, 140.8, 137.5, 128.0, 126.9, 126.4, 121.4, 117.2, 114.2,109.4, 104.3, 55.04, 43.09.
(b) DCC as coupling agent
Compound 6: (E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-N-(4-methylbenzyl)acrylamide 
yellow amorphous solid. M.p. 145-150°C. Isolated yield (64,94%). IV ʋmax (KBr, cm-1): 3327 (O-H), 3288 (C-H sp2), 2938- 2838 (C-H sp3), 1655 (C=O), 1592 e 1427 (C=C aromatic). 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ(ppm): 9.49 (s, O-H), 8.43 (s, 1H), 7.36 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.10 (s, 4H), 6.97 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.50 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.43 (s, 1H, NH), 3.76 (s, 3H), 3.48 (s, 3H, OCH3); 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ (ppm): 165.60, 148.43, 147.96, 139.64, 136.61, 136.03, 129.02, 127.46, 126.52,121.79, 118.86, 115.68, 110.83, 73.00, 55.69, 42.18.
Compound 7: (E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-N-(4-methoxybenzyl)acrylamide 
white crystalline solid. M.p. 134-139°C. Isolated yield (43,17%). IV ʋmax (KBr, cm-1): 3356 (O-H), 3079 (C-H sp2), 2957- 2839 (C-H sp3), 1654 (C=O), 1592 e 1454 (C=C aromatic). 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.54 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.01 (s, 1H), 6.95 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.26 (d, J = 14.0 Hz, 1H); 6.14 (s, 1H, NH); 4.45 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.74 (s, 3H). 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ (ppm): 166.32, 147.60, 159.11, 146.87, 141.58, 130.34, 129.46, 127.31, 122.20, 117.85, 114.87, 114.16, 109.85, 56.04, 55.51, 43.46. MS(MALDI) calculated for C18H19NO4 [M+H]+: 314,350, found [M + H]+ 314,236.
Compound 8: (E)-N-(4-chlorobenzyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acrylamide 
white amorphous solid. M.p. 157-164°C. Isolated yield (46,87%). IV ʋmax (KBr, cm-1): 3335 (O-H), 3086 (C-H sp2), 2971 (C-H sp3), 1657 (C=O), 1590, 1559 e 1514 (C=C aromatic).1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.52 (d, J=16.0 Hz, 3H), 7.19 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.15 (m, 1H, H-2), 7.13 (s, 1H), 6.99 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.79 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.29 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 5.26 (s, 1H, NH); 4.43 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.78 (s, 3H). 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ (ppm): 166.46, 147.54, 146.76, 141.65, 136.90, 133.26, 129.16, 127.16, 122.22, 117.89, 114.94, 109.98, 109.87, 55.83, 43.11.
Compound 9: (E)-N-(3,4-dimethoxybenzyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acrylamide 
white crystalline solid. M.p. 197-202°C. Isolated yield (52,53%). IV ʋmax (KBr, cm-1): 3227 (O-H), 3063 (C-H sp2), 2937 (C-H sp3), 1652 (C=O), 1593, 1549 and 1515 (C=C aromatic). 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.49 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.20 (s, 4H), 6.93 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.74 (m, 3H), 6.24 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.21 (s, 1H), 4.38 (d, J= 6.0 Hz, 2H) 3.75 (s, 3H). 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ (ppm): 166.39, 149.12, 148.45, 147.64, 146.92, 141.50, 130.84, 127.22, 122.17, 122.09, 120.22, 117.84, 114.90, 111.21, 109.82, 55.94, 43.75.
Compound 10: (E)-N-(benzo[d][1,3]dioxol-5-ylmethyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) acrylamide 
yellow amorphous solid. M.p. 203-208°C. Isolated yield (70,41%). IV ʋmax (KBr, cm-1): 3300 (O-H), 3030 (C-H sp2), 2896 (C-H sp3), 1651 (C=O), 1598, 1534 and 1506 (C=C aromatic). 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ(ppm): 8.26 (s, OH), 7.19 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 6.95 (s, H-2), 6.85 (s, 4H), 6.75 (d, J = 24.0 Hz, 1H), 6.63 (m, 3H), 6.32 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.79 (s, 2H), 5.35 (s, 1H), 4.11 (d, J= 4.0 Hz, 2H), 3.62 (s, 3H). 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ (ppm): 165.54, 148.40, 147.92, 147.34, 143.16, 139.56, 133.53, 126.47, 121.71, 121.71, 120.65, 118.84, 115.75, 110.84, 108.12, 100.92, 55.58, 42.20.
Atividade citotóxica 
Os resultados das atividades citotóxicas dos derivados do AF contra o crescimento de 3 linhagens de câncer humano e 1 linhagem de célula sadia são mostrados na Tabela 1. De acordo com os resultados explicados na Tabela 1, considerando o composto (1) como o esqueleto de base do nosso estudo, uma molécula inédita na literatura, o mesmo não apresentou atividade citotóxica para nenhuma linhagem celular estudada, sugerindo que o grupo alquila não contribui para a atividade citotóxica. 
O composto (2) também não apresentou atividade citotóxica nas linhagens celulares estudadas, diferentemente de seu análogo (3) e (4) no qual o nitrogênio não é um heteroátomo do anel pirrolidínico, mas um ligante da cadeia alicíclica, onde tiveram uma atividade seletiva ás células HL-60 com IC50 = 68.42 μmol / ml e IC50 = 50.40 μmol / ml, uma das explicações é que as amidas terciárias são reatívas e instáveis por não fazer ligações de hidrogênio, diferente das amidas secundárias que suas interações intermoleculares são fortes (VALEUR E BRADLEY, 2009), e pôde se observar que o composto (3) e (4) apresentou um grupo volumoso determinante para haver atividade antitumoral. 
Tabela 1 : atividades citotóxicas das amidas derivadas do AF contra o crescimento de 3 linhagens de câncer humano e 1 linhagem de célula sadia .
	Amidas 
µmol/mL
	HCT116
	HEP62
	HL60
	MRC5
	1
	>25
	>25
	>25
	>25
	2
	>25
	>25
	>25
	>25
	3
	>25
	>25
	68.42
42.05- 100.42
	>25
	4
	>25
	>25
	50.40
33.17-76.59
	>25
	5
	70.29
50.05- 98.66
	107.01
64.79- 104.82
	64.94
52.87- 79.76
	76.45
60.23- 97.02
	6
	>25
	>25
	53.10
39.38- 71.63
	>25
	7
	>25
	64.65
50.84- 82.20
	70.27
63.44- 92.69
	53.23
42.04- 67.40
	8
	>25
	>25
	49.02
29.14 – 82.44
	>25
	9
	>25
	>25
	36.45
21.59- 52.80
	>25
	10
	>25
	>25
	57.44
34.51- 80.24
	>25
	DOX
	0.036
0.01 – 0.073
	0.01
0.01- 0.11
	0.055
0.01- 1.96
	1.83
0.80- 3.69
*As tabelas apresentam os valores de CI50 (concentração inibitória média) e os respectivos intervalo de confiança de 95% obtido a partir de três experimentos independentes realizados em duplicata pelo método do Alamar blue após 72 horas de exposição com as células HepG2 (carcinoma hepatocelular h umano), HCT116 (carcinoma de cólon humano), HL-60 (leucemia promielocítica humana) e MRC5 (fibroblasto de pulmão humano) obtidos por regressão não-linear através do programa GraphPad Prisma versão 5.0. Doxorrubicina (DOX) foi usada como controle positivo
O composto (5), que tem um anel benzílico ligado ao nitrogênio, apresentou atividade antitumoral contra todas células cancerígenas, tendo o melhor resultado nas células HL60 com IC50 = 64.94 μmol / mL, porém apresentou citotoxicidade nas células MRC5 ( fibroblasto pulmonar humano), demonstrando que o composto não é seletivo para células tumorais. Já o composto (6) que tem um metila, que é um grupo doador de eletrons fraco, ligado a posição para do anel benzílico da amida, foi seletivo para as células HL-60 e teve o IC50 reduzido para 53.10 μmol / mL. O composto (7), que assim como o composto (1) é uma molécula inédita na literatura, mostrou citotoxicidade para as linhagens celulares HCT-116, HL-60 e MRC-5, 64.65 μmol / mL, 70.27 μmol / mL e 53.23 μmol / mL respectivamente, o que a torna uma molécula inespecifica para as celulas tumorais, e em comparação com seu análogo (6) e também houve aumento do IC50 na linhagem tumoral HL-60. 
No composto (8), verificou-se que quando mudamos o substituinte do anel aromático de um metoxi (7) para um cloreto, há seletividade para as células HL60 com IC50 = 49.02 μmol / mL, sugerindo que cloro contribui como um doador de elétrons do anel aromático, aumentando a densidade eletrônica na molécula deixando-a mais estável. O cloro também é capaz de fazer ligação covalente polar com o hidrogênio. 
O composto (9) foi o que apresentou o melhor resultado, nele há uma dissubstituição de metoxilas no anel aromático, o deixando específico para a linhagem celular tumoralHL-60 e tendo o menor valor de IC50 (36.45 μmol/ mL). O aumento da rigidez molecular nesse caso foi determinante para sua especificidade e para o aumento de sua atividade. Moléculas volumosas são protegidas de ataques enzimáticos, mas essa característica podem contribuir ou reduzir a atividade biológica.
O composto (10) (IC50= 57.44 μmol/ mL) se constatou que em o aumento da rigidez e a disposição de dois átomos de oxigênio em grupamentos rígidos no radical piperonila não contribuiram para melhorar a atividade sob as células tumorais HL-60, porém continuou específica.
 
Atividade fungicida 
A atividade antifúngica (Tabela 2) das amidas derivadas do ácido ferúlico foi baseada na concentração inibitória mínima (CIM). Os produtos foram interpretados e considerados ativo ou não de acordo com os seguintes parâmetros: ≤ 10 μg/mL = grande interesse para desenvolvimento; 10-50 μg/mL = alta atividade; 50-100 μg/mL = boa atividade; 100-500 μg/mL = atividade moderada; >500 μg/mL = produto inativo (HOLETZ et al., 2002).
A CIM dos compostos foi determinada com os métodos de microdiluição em 96 poços contra 3 espécies de cepas de Candida (Candida albicans, C. tropicalis, C. Krusei). Compostos ativos (CIMs ≤ 500 μg / mL) foram testados quanto à sua capacidade de matar fungos, em vez de inibilos através da determinação da concentração mínima de fungicida (CFM).
Os compostos (1),(2),(3) e (4) apresentaram-se inativos. Por outro lado, os compostos (5), (6), (7), (8), (9) e (10) apresentaram atividades variadas, sendo o composto (10) aquele com a atividade mais ampla e mais alta. 
Uma análise da correlação entre estrutura e atividade mostrou que o composto mais potente (10) possuía a estrutura mais volumosa e que apresentara mais rigidez na molécula por possuir o anel piperonil com duas moléculas de oxigênio como heteroátomos na porção R. O análogo (9) foi o que apresentou o segundo melhor resultado e o mesmo também possui dois oxigenios ligados ao anel aromático na porção R, mas o mesmo apresenta menos rigidez que o composto (10). O que nos leva a supor que o um grupo volumoso que cause rigidez na porção R da molécula é o responsável pela potencialização do efeito fungicida. Pode-se observar que todas as molecúlas que possuem na sua porção R um espaçador entre o anel benzílico e o nitrogênio tiveram atividade fungicida, sendo isso o fator determinante para que as moléculas tenham atividade biológica contra as cepas de Candida. 
Tabela 2 : atividades citotóxicas das amidas derivadas do AF contra o crescimento de 3 linhagens de câncer humano e 1 linhagem de célula sadia .
	
	C. albicans CBS 562
	C. krusei CBS 573
	C. tropicalis CBS 594
	
	CIM
	CFM
	CIM/ CFM
Razão*
	CIM
	CFM
	CIM/
CFM
Razão*
	CIM
	CFM
	CIM/CFM
Razão*
	1
	N.A.
	N.A.
	-------
	N.A.
	N.A.
	-------
	N.A.
	N.A.
	-------
	2
	N.A.
	N.A.
	-------
	N.A.
	N.A.
	-------
	N.A.
	N.A.
	-------
	3
	N.A.
	N.A.
	-------
	N.A.
	N.A.
	------
	N.A.
	N.A.
	-------
	4
	N.A.
	N.A.
	-------
	N.A.
	N.A.
	-------
	N.A.
	N.A.
	-------
	5
	1778.4 µM
	1778.4 µM
	1
	889.2 µM
	889.2 µM
	1
	N.A.
	N.A.
	-------
	6
	N.A.
	N.A.
	-------
	1692.7µM
	1692.7µM
	1
	1692.7µM
	1692.7µM
	1
	7
	N.A.
	N.A.
	-------
	1605.8µM
	1605.8µM
	1
	1605.8µM
	1605.8µM
	1
	8
	N.A.
	N.A.
	-------
	1583.3µM
	1583.3µM
	1
	1583.3µM
	1583.3µM
	1
	9
	1465.5
	N.A.
	-------
	732.7 µM
	732.7µM
	1
	1465.5µM
	1465.5µM
	1
	10
	768.3 µM
	1536.7 µM
	2
	384.1 µM
	384.1 µM
	1
	1536,7µM
	1536.7µM
	1
Mecanismo de ação antifúngica
Afim de determinar o mecanismo de ação das duas melhores amidas com atividade antifúngica, fizemos o teste com um protetor osmótico: sorbitol. 
Protoplastos estabilizados com osmoprotetores têm sido importantes ferramentas bioquímicas para estudar a arquitetura da parede celular (SENTANDREU et al., 1983). Além disso, a estabilidade osmótica tem sido usada com C. albicans e outros fungos para estudar o mecanismo de ação de alguns antibióticos (YAMAGUCHI H. et al., 1982; VARONA et al., 1983). Danos aos componentes essenciais da parede celular a partir de agentes antifúngicos (inibidores da síntese de parede celular) lisariam células na ausência de um osmoprotetor, porém as células continuarão a crescer se um estabilizador adequado estiver presente no meio. Positivos, são então, examinados através da microscopia para verificar alterações morfológicas. Células tratadas com drogas que interferem na síntese da parede celular frequentemente têm características morfológicas distintas. As mudanças na morfologia podem sugerir possíveis alvos ou modo de ação dos inibidores de parede celular. As morfologias das células têm sido usadas como um método para identificar novos antifúngicos inibidores de parede celular (ZACCHINO, 2003).
Figura 3-Diagrama esquemático do bioensaio do sorbitol com valores da Concentração Inibitória Miníma (CIM). Observar o aumento da CIM quando o fungo é tratado com um protetor osmótico. Fonte: ZACCHINO, 2001.
Na tabela 3 podemos perceber que na presença do sorbitol a molécula teve uma CIM 16 vezes maior, não tendo atividade biológica com a presença do mesmo. Estes resultados reforçam a tese de que a parede celular destes microrganismos, pode estar envolvida como alvo, na atividade antifúngica das amidas (9) e (10).
Tabela 3: resultados das CIM’s com e sem a presença do sorbitol.
	
	WITH SORBITOL
	WHITOUT SORBITOL
	Y9
	2931.1 µM
	183.1 µM
	Y10
	3073.5 µM
	192.0 µM
Docking moleculas
Compounds 9 and 10 were docked into the binding sites of Lanosterol 14-alpha demethylase (L-14a-D), C-8 sterol isomerase (C-8-SI), Squalene monooxygenase (SQM) and Thymidylate synthase (TS) as described in the Methods section. The molecular docking results are summarized in Table A. For all targets except TS, more than one possible binding mode was predicted for at least one of the compounds. The visual inspection of the predicted binding poses revealed meaningful interactions between the compounds under investigation and their potential targets. In addition, docking scores support the possibility of the predicted binding poses and differences between the docking scores of both compounds to the same target are small. 
Table A. Summary of the docking of compounds Y9 and Y10 to their potential targets
	Target
	Compound
	Conformer
	CHEMPLP
	GoldScore
	ChemScore
	ASP
	Consensus Z-Score
	
	
	
	Score
	Z-Score
	Score
	Z-Score
	Score
	Z-Score
	Score
	Z-Score
	
	L-14a-D
	9
	1
	88.07
	2.85
	53.08
	1.98
	39.97
	2.19
	40.57
	0.36
	1.85
	
	9
	2
	84.17
	2.19
	52.99
	1.97
	36.91
	0.99
	39.80
	0.07
	1.31
	
	10
	1
	83.95
	2.45
	51.62
	1.73
	34.29
	0.45
	42.47
	0.41
	1.26
	
	10
	2
	77.40
	0.87
	31.52
	-0.49
	40.07
	2.20
	48.10
	2.09
	1.17
	C-8-SI
	9
	1
	58.78
	0.54
	34.51
	1.69
	27.02
	1.17
	46.24
	2.81
	1.55
	
	9
	2
	60.00
	1.01
	32.65
	1.14
	28.06
	2.05
	43.00
	1.44
	1.41
	
	10
	1
	60.26
	1.24
	36.08
	1.33
	24.20
	1.22
	43.97
	1.79
	1.40
	SQM
	9
	1
	76.34
	2.42
	38.04
	1.11
	35.93
	1.74
	46.60
	1.97
	1.81
	
	9
	2
	73.96
	2.06
	20.46
	-0.55
	35.98
	1.76
	46.21
	1.89
	1.29
	
	10
	1
	73.76
	2.15
	40.39
	1.82
	28.98
	0.31
	45.92
	1.75
	1.51
	
	10
	2
	69.62
	1.41
	38.52
	1.41
	30.27
	0.84
	45.08
	1.56
	1.31
	TS
	9
	1
	55.38
	2.10
	41.11
	1.25
	17.03
	1.96
	35.73
	1.88
	1.80
	
	10
	1
	55.57
	1.19
	48.21
	2.40
	17.03
	2.56
	38.79
	2.77
	2.23
It must be considered that during molecular docking several factors involved in molecular recognition are neglected. This is a known limitation of all docking software which is also necessary for the prediction of potential ligand-receptor complexes of large amounts of compounds in a reasonable time. As previously shown, molecular docking can be effective in the initial identification of possible binding modes of ligands to receptors. However, the estimation of the free energies of binding from ensembles of molecular complexes conformations using more accurate modeling approaches such as MD can aid in the identification of feasible complexes [6]. To reduce the number of possible targets of compounds Y9 and Y10, their predicted complexeswith the potential receptors listed in Table A were subject of MD simulations and MM-PBSA calculations as described in the Methods section. The estimated free energies of binding of all predicted complexes are presented in Table B.
Table B. Predicted free energies of binding of compounds Y9 and Y10 to the studied targets. Values are expressed in kcal/mole
	Target
	Compound
	Conformer
	MM-PBSA Component
	DELTA TOTAL
	
	
	
	VDWAALS
	EEL
	EPB
	ENPOLAR
	EDISPER
	DELTA G gas
	DELTA G solv
	
	L-14a-D
	9
	1
	-52.43
	-29.65
	82.24
	-36.77
	62.38
	-82.08
	107.85
	25.76
	
	9
	2
	-48.62
	-41.01
	82.82
	-36.08
	63.19
	-89.63
	109.93
	20.30
	
	10
	1
	-51.47
	-20.29
	57.45
	-33.79
	58.25
	-71.76
	81.92
	10.15
	
	10
	2
	-44.93
	-47.76
	82.67
	-33.76
	59.21
	-92.69
	108.12
	15.43
	C-8-SI
	9
	1
	-49.16
	-7.44
	60.64
	-35.26
	62.39
	-56.60
	87.77
	31.17
	
	9
	2
	-53.86
	-24.34
	57.90
	-37.65
	64.72
	-78.20
	84.97
	6.76
	
	10
	1
	-48.99
	-25.94
	108.12
	-34.03
	59.43
	-74.94
	133.52
	58.58
	SQM
	9
	1
	-53.97
	-11.59
	35.97
	-37.61
	62.19
	-65.56
	60.54
	-5.02
	
	9
	2
	-53.06
	-14.22
	40.04
	-36.94
	64.20
	-67.28
	67.31
	0.02
	
	10
	1
	-52.71
	-11.97
	36.97
	-34.64
	58.73
	-64.68
	61.07
	-3.61
	
	10
	2
	-49.55
	-15.29
	37.82
	-33.70
	60.12
	-64.84
	64.23
	-0.60
	TS
	9
	1
	-51.16
	-41.49
	61.30
	-34.72
	59.37
	-92.64
	85.94
	-6.70
	
	10
	1
	-46.75
	-30.25
	51.82
	-31.18
	55.88
	-77.00
	76.52
	-0.48
According to Table B, all the predicted complexes of compounds Y9 and Y10 to L-14a-D and C-8-SI show positive free energies of binding, indicating that the formation of these complexes is unfeasible. On the other hand, favorable binding is predicted for both compounds to SQM and TS. In the case of SQM where two possible binding modes were explored for each ligand, the ones having the lowest ΔG of binding was selected as the most probable for each ligand. The predicted binding modes of compounds Y9 and Y10 to the SQM enzyme are shown in Fig. A. This figure also summarizes the interactions observed between the ligands and the receptor in the MD snapshots used for the MM-PBSA calculations.
Figure A Predicted binding modes of compounds Y9 (top) and Y10 (bottom) to SQM of Candida albicans (left). At the left side of the figure are represented the predicted interaction frequencies with the residues at the receptor binding site. Darker lines indicate the higher frequencies of interaction.
For SQM, both ligands are predicted to form an extensive network of contacts with the receptor, involving mainly hydrophobic ones. In addition, Y9 and Y10 are predicted to have similar binding modes to the receptor, with their hydroxy‐methoxyphenyl moieties pointing to the FAD cofactor of SQM and mainly occupying the entrance of the binding cavity. It is interesting to note that ligands Y9 and Y10 directly contact the FAD cofactor in only 5% and 18% of the selected MD snapshots, respectively. This difference in contact frequency with FAD could be explained from the bulkier and more rigid benzodioxol group present in Y10 instead of the dimethoxyphenyl moiety present in Y9. This bulkier group might cause compound Y10 to move deeper into the binding cavity close to the FAD cofactor. Both compounds showed contacts with L45, Y74, P427, V237, Y248, L337, G339, F417, L431 during most of the analyzed MD snapshots. The amide group of Y9 is predicted to interact through hydrogen bond with backbone carbonyl of L337 in 58% of the snapshots. Furthermore, in 18% of the MD snapshots its hydroxyl group hydrogen bonds to C71 and the carbonyl oxygen of Y9 forms hydrogen bonds with the hydroxyl moiety of Y74 in 15% of them. The frequencies of the same interactions during the MD simulation of the Y10-SQM complex are 29%, 10% and 18%, respectively.
On the other hand, the predicted binding modes of Y9 and Y10 to TS and the observed contacts between the ligands and the receptor are summarized in Fig B. As observed for SQM, the predicted binding poses of both compounds are highly similar for both compounds. However, in contrast to SQM, in the predicted complex of the compounds under investigation with TS the ligands interact in 100% of the MD snapshots with the receptor bound cofactor. In the majority of these snapshots both ligands make contacts with R26, W87, Y113, C173, H174, N221 and H251. The frequency of hydrogen bonds formation and the extend of the network of this type of interaction is also higher for TS compared to SQM. For example, the carbonyl group of the ligands hydrogen bonds to the sidechain of R26 in 89% and 79% of the snapshots extracted for compounds 9 and 10, respectively. Likewise, the hydroxyl group of the compounds are predicted to interact through hydrogen bond with the sidechain of N221 in 76% of the MD snapshots corresponding to Y9 and the same frequency goes to 89% for Y10. The presence of the bulkier benzodioxol substituent in Y10 induces the poses of this compound closer to the bottom of the binding cavity, making this compound to place more favorably than Y9 to interact with residues such as N221, Y113 and S211. Thus, the frequencies of hydrogen bonding with these residues are higher for Y10 than for Y9. In this sense, hydrogen bonds are observed between the amide group of Y10 with the side chain of S211 in 65% of the snapshots while the same interaction is observed in only 9% of the snapshots corresponding to Y9. A similar behavior is observed for the hydrogen bond between the methoxy group of the hydroxy‐methoxyphenyl group of the ligands with the hydroxyl group of Y113 (64% vs. 17%). 
Figure B Predicted binding modes of compounds Y9 (top) and Y10 (bottom) to TS of Candida albicans (left). At the left side of the figure are represented the predicted interaction frequencies with the residues at the receptor binding site. Darker lines indicate the higher frequencies of interaction.
The obtained values of predicted free energy of binding for SQM and TS, as well as the interaction patterns of both ligands with these two enzymes suggest that compounds Y9 and Y10 could inhibit them. The more extensive network of hydrogen bonds formed between the studied compound and TS also indicate that these compounds might be more effective at inhibiting TS than SQM. Additional experiments will be required to confirm our hypothesis of inhibition of Candida albicans SQM and TS enzymes by compounds Y9 and Y10. The models herein provided will also serve to generate new variants of these compounds with improved inhibitory potency against these enzymes. Finally, the high sequence conservation of these enzymes (more than 90% for TS) in C. albicans and C. tropicalis could make the compounds derived from Y9 and Y10 promising candidates for broad spectrum antifungal agents.
CONCLUSÃO
REFERÊNCIAS 
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