ÁCIDO FERÚLICO

Prévia do material em texto

ÁCIDO FERÚLICO
O ácido ferúlico ( Figura 1) é um dos ácidos fenólicos mais abundantes nas plantas e pode ser encontrado em altas concentrações em alimentos como feijão marinho, farelo de milho, farelo de trigo, berinjela, alcachofra e beterraba (Rosazza et al ., 1995; Kroon et al. , 1997; Rechner et al ., 2001; D'archivio et al ., 2007). Pode ser encontrado livre, dimerizado ou esterificado com proteínas e polissacarídeos na parede celular, como arabinoxilanos em gramíneas e xiloglucanos em bambu (Iiyama et al ., 1994; Rumbold et al.2003; Fazary, Ju, 2007). 
O ácido ferúlico (FA) é um importante componente biológico e estrutural da parede celular da planta. Devido à sua capacidade de interromper reações radicais em cadeia por ressonância seguida de polimerização, o FA oferece proteção contra a radiação UV e é responsável pela reticulação de polissacarídeos e outros polímeros da parede celular (Sánchez et al ., 1996; Kroon et al ., 1999, Santos et al ., 2008).
O ácido FA [ácido 3- (4-hidroxi-3-metoxifenil) prop-2-enóico] pode ser encontrado como um monômero, dímero, oligômero livre ou polímeros constituintes, ligados covalentemente por ligações ésteres com polissacarídeos, poliaminas e glicoproteínas e como éter ligado à lignina (Durán, Padilla, 1993; Bourne, Rice-Evans, 1998; Kroon et al ., 1999). A FA possui dois isômeros: cis (líquido oleoso amarelo) e trans (cristal branco), o último correspondendo a 90% de sua ocorrência natural (Fulcher, 1983). É sintetizado na via chiquimato / fenilpropanóide principalmente a partir da L-fenilalanina ou em gramíneas a partir da L-tirosina ( Figura 2) (Castelluccio et al ., 1995).
O caminho do fenilpropanóide começa com a desaminação da L-fenilalanina para produzir ácido cinâmico, uma reação catalisada pela fenilalanina amônia-liase (PAL). O ácido cinâmico é hidroxilado para dar ácido p- camárico, em uma reação catalisada pela cinnamato 4-hidroxilase (C4H). Alternativamente, a desaminação da L-tirosina, catalisada pela tirosina amônia liase (TAL), produz diretamente o ácido p- camarico (Castelluccio et al ., 1995). p-O ácido coumarico é então esterificado para coenzima A, pela enzima 4-coenzima A ligase (4CL), transesterificado com quiquimato ou quinato por hidroxicinamoil CoA: hidroxicinonamoil transferase quinato / quiquimato (HCT) e hidroxilado adicionalmente no carbono 3 para produzir cafeoil-quiquimato / quinato éster pela enzima coumaroil-3-hidroxilase (C3H). O cafeoil-quiquimato / quinato é transesterificado com CoA e o hidroxil em C3 é metilado pela cinamoil-coenzima A ortometil transferase para produzir feroilil-CoA. O éster pode ser exportado para polissacarídeos de feruloilato no aparelho de Golgi por ação de uma ferrosil transferase putativa ou liberado como coniferaldeído em uma reação mediada pela cinamoil-coenzima A redutase (CCR). A FA livre é produzida pela oxidação subsequente do coniferaldeído pela enzima coniferil aldeído desidrogenase (CALDH) (Chen, 2006).
Ácido ferúlico como agente antitumoral
Apesar dos esforços globais para limitar a incidencia de câncer, ele se tornou a principal causa de morte nos últimos 50 anos. Com os cânceres que crescem rapidamente nos países desenvolvidos e em desenvolvimento, há uma necessidade urgente de desenvolver medicamentos mais eficazes. 
Os ácidos aromáticos no reino vegetal são agora reconhecidos como agentes quimiopreventores promissores. Eles exibem um amplo espectro de atividades farmacológicas, como o anticâncer.
O ácido ferúlico (ácido 4-hidroxi-3-metoxicinâmico, FA), era ativo contra a carcinogênese pulmonar pelo benzopireno.9 Adicionalmente, poderia diminuir a incidência de azoximetano. neoplasias intestinais reduzidas, sugerindo que ele tem potencial como agente inibidor do gérmen de arroz nas neoplasias do cólon.
A atividade anticâncer da FA está relacionada à sua propriedade antioxidante para eliminar a ERO e estimular a atividade de enzimas antioxidantes (Hirose et al ., 1999).
Mori et al . (1999) estudaram os efeitos da FA no câncer de boca após causar carcinogênese quimicamente induzida em ratos usando 1-óxido de 4-nitroquinolina (4NQO), expondo-os a água potável contendo 0,02 g de 4NQO / kg por 5 semanas e após esse período, submetendo-os a 0,5 g FA / kg de peso corporal. Verificou-se que a incidência de carcinomas na língua e lesões pré-neoplásicas foram significativamente menores no grupo que recebeu a dose de AF do que no grupo controle, sugerindo que os AF possuem atividade quimiopreventiva contra o câncer bucal. Em outro estudo realizado por Kawabata et al.. (2000), os efeitos da FA administrada às dietas de camundongos foram examinados após carcinogênese induzida no cólon pelo azoximetano (OMA). Após 35 semanas, o grupo que recebeu doses de 0,25 e 5 g AF / kg de peso corporal apresentou menor incidência de carcinomas do cólon em relação ao grupo que recebeu apenas OMA. Também foi observado que as enzimas responsáveis ​​pela desintoxicação do fígado e do cólon, a glutationa S-transferase e a quinona redutase, apresentaram atividades aumentadas em camundongos tratados com FA, sugerindo que essas enzimas estão diretamente relacionadas ao efeito bloqueador causado pela FA na carcinogênese induzida por OOM.
Alias e cols.. (2009) avaliaram e compararam o potencial quimiopreventivo da FA aplicada topicamente e administrada por via oral contra a carcinogênese cutânea induzida por 7,12-dimetilbenz [a] antraceno (DMBA), estimando o status dos agentes de desintoxicação das fases I e II, subprodutos da peroxidação lipídica e antioxidantes. O carcinoma de células escamosas da pele foi induzido na parte posterior raspada dos ratos, pintando com DMBA (25 µg em 0,1 mL de acetona) duas vezes por semana, durante 8 semanas. A administração oral de FA impediu completamente a formação de tumores na pele e reverteu o status dos agentes de desintoxicação das fases I e II, subprodutos da peroxidação lipídica e antioxidantes para valores quase normais em camundongos tratados com DMBA. No entanto, quando aplicada topicamente, a FA não mostrou atividade quimiopreventiva significativa durante a carcinogênese da pele induzida por DMBA nos camundongos.
Outro estudo recente usando ratos Sprague-Dawley avaliou o potencial quimiopreventivo da FA, monitorando a incidência de tumores, bem como analisando as enzimas de desintoxicação da fase II durante a carcinogênese mamária induzida pelo DMBA. A administração oral de FA na dose de 40 mg / kg de peso corporal impediu a formação de tumores em 80% dos ratos (Baskaran et al ., 2010). Embora não exista um mecanismo detalhado do processo, o efeito modulador da FA na cascata de desintoxicação da fase II pode ter um papel possível e merece atenção devido ao seu potencial terapêutico na prevenção do câncer mamário.
Agente antimicrobiano e anti-inflamatório
Estudos realizados in vitro para a atividade do FA e do ferulato de etila (EF) no HIV revelaram que esses compostos reduziram a liberação e a atividade do antígeno p24, uma proteína essencial do capsídeo do vírus, após o tratamento de células infectadas cronicamente com 1, 5 e 10 µmol L -1 de FA ou EF. FA e FE a 5 µmol L -1 inibiram a replicação do vírus sem citotoxicidade, sugerindo que a FA e seus derivados são moléculas potencialmente úteis para terapia antiviral (Edeas et al ., 1995).
A FA também inibe o crescimento de bactérias Gram-positivas e negativas (Escherichia coli) e já está presente na composição de medicamentos anti-inflamatórios utilizados na Medicina Oriental (Jeong et al ., 2000).
Hirabayashi et al. (1995) investigaram os efeitos da FA e do ácido isoferulic (IFA), componentes ativos do rizoma das espécies de Cimicifuga (plantas usadas como agentes anti-inflamatórios em medicamentos japoneses) na produção de interleucina-8 murina (IL-8) em resposta à influenza infecções por vírus in vitro e in vivo utilizando o ensaio imunossorvente ligado a enzima sanduíche de anticorpo. A IL-8 é uma proteína da família das citocinas que atua como mediadora no processo inflamatório, que também é expressa nas células tumorais.In vitroNeste estudo, a linha celular de macrófagos murinos RAW 264.7 foi infectada com 10 PFU (unidades formadoras de placas) do vírus influenza e cultivada na presença ou ausência de ácidos fenólicos. Os níveis de IL-8 foram reduzidos após 20 h no meio condicionado quando comparado ao controle, mas o efeito da IFA foi maior que o da FA: os níveis de IL-8 foram reduzidos para 43% e 56% (comparado ao controle) em presença de 100 mg / mL de IFA e FA, respectivamente. No estudo in vivo , os ratos foram infectados com 1 PFU do vírus e receberam administrações orais diárias da Cimicifuga heracleifoliaextrato (5 mg / mouse / dia), FA (0,5 mg / mouse / dia), IFA (0,125 mg / mouse / dia) ou solução salina tamponada com fosfato. Todos os medicamentos apresentaram tendência a reduzir os níveis de IL-8 observados por lavagem broncoalveolar (LBA) dois dias após a infecção, e ambos os ácidos reduziram significativamente o número de neutrófilos exsudados na LBA. Os dados indicam que esses dois compostos são os princípios mais ativos das espécies anti-inflamatórias obtidas de Cimicifuga. 
Zerrin Canturk 2018, investigar a sinergia entre efeitos anticandidais e apoptóticos do ácido ferúlico e da caspofungina contra Candida albicans e Candida glabrata, com a ajuda de um ensaio quantitativo de microdiluição em tabuleiro de damas usando 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2, Brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT) como corante de viabilidade. Os efeitos apoptóticos das concentrações de caspofungina e ácido ferúlico (isolados e combinados) foram analisados ​​para C. albicans e C. glabrata com base nas capacidades de ligação da anexina V-propídio ao iodeto de propídio usando análise citométrica de fluxo. C. albicans mostrou um efeito sinérgico, representado por um índice de concentração inibitória fracionária <<0,5, mas C. glabrata não mostrou efeito sinérgico (índice de concentração inibitória fracionária> 0,5). Os efeitos apoptóticos precoces e tardios das concentrações de caspofungina e ácido ferúlico (1 μg / mL e 1000 μg / mL) foram calculados em 55,7% e 18,3%, respectivamente, enquanto seus efeitos necróticos foram determinados em 5,8% e 51,6%, respectivamente, usando fluxo análises citométricas. Os efeitos apoptóticos da combinação de caspofungina e ácido ferúlico em concentrações de 1 μg / mL e 1000 μg / mL em C. albicans e C. glabrata foram 73,0% e 48,7%, respectivamente. O ácido ferúlico também demonstrou um efeito sinérgico em combinação com caspofungina contra C. albicans. Outra possibilidade é combinar a droga anticandida existente com fitoquímicos para aumentar a eficácia da droga anticandida.
Amidas 
	Amidas são encontradas na natureza e se destacam por apresentar lipofilicidade e baixa reatividade em comparação com os outros derivados carboxílicos, pois formam ligações de hidrogênio altamente estáveis. Uma consequência disso são seus altos pontos de fusão e ebulição, uma vez que suas interações moleculares se tornam mais fortes devido a essas ligações (VALEUR E BRADLEY, 2009). De acordo com os relatórios estatísticos das principais empresas farmacêuticas, quase 25% das drogas contem uma unidade de ligação amida (GHOSE, VISWANADHAN E WENDOLOSKI, 1999).
O FA é insolúvel em água e óleo, o que limita suas aplicações. Portanto, a fim de melhorar sua lipossolubilidade e para alcançar anticancerígenos e antifungicidas mais potentes, é necessário modificar as estruturas do FA. A amidação é uma maneira de modificar as propriedades físicas do AF. 
Structure-activity relationship (SAR) studies are used to determine the chemical characteristics that influence the biological action of a series of analogous compounds, since it is based on the general premise that a drug acts at a specific site of action located in an enzyme or (Table 2) 13. In the present study, it was found that the compounds of the present invention have the same pharmacological and / or toxicological activity, ie, they interact with the same site. It is known that the analogs and their respective pharmacological targets are flexible and have molecular structures in continuous changes (confomers). Unsaturated groups and ring systems give more rigidity to the molecules and reduce the amount of confomers, increasing the likelihood of interaction between the analogue and its pharmacological target. The chemical functions, such as aliphatic conjugated systems, aromatic rings, heteroaromatics, esters and amides, are also considered rigid groups, however, the stiffness of the amides is superior in comparison to the others.
To increase the lipophilic character of an analogue, it is sufficient to increase the alkyl radical with the insertion of methylene groups sequentially or with branching. It is assumed that the activity improves due to the increase of the fluidity of the compound by the biological membranes, however, depending on the size of the chain, the reverse may occur, because this phenomenon can also imprison the drug, since with the reduction of water solubility, the distribution is affected 13,14,15.
	The change in activity with the introduction of halogens, methyl, alicyclic and aromatic rings to analogues is not predictable. These groups serve both as bulky groups, which hamper the enzymatic attack and the consequent degradation of an analogue under study, as they increase the liposolubility and the hydrophobic interactions with their respective pharmacological.
The introduction of aromatic rings allows for more molecular stiffness, which contributes to increase this interaction. Heterocyclic aromatic rings are also widely used, and functional groups, such as sulfur and nitrogen inserted in the ring, may increase pharmacological activity13,14,16,17. Pharmacological activity with the introduction of halogens (chlorine, fluorine, bromine or iodine) also varies according to the halogen used and the position when inserted in aromatic rings. The introduction of hydroxyl groups increases the water solubility of the compound, and a new site for hydrogen bonds is formed. This increases the interaction between the analogue and the receptor 13,18.
A análise da razão estrutura-atividade das amidas derivadas do ácido ferúlico foi baseada nos resultados da concentração inibitória mínima nas células HecG2, HCT116, HL-60 e MRC5 obtidas da ATCC. A preparação de tais compostos estruturalmente semelhantes, com alteração no número da cadeia alquil e no tipo de substituintes no anel aromático, como doadores ou retirada de elétrons, pode causar alterações significativas nas propriedades dos compostos e resultar em atividades antitumorais diferentes. Portanto, os resultados obtidos neste trabalho podem servir de referência para o desenvolvimento de novos protótipos antitumorais com perfil biológico mais promissor.
MATERIALS AND METHODS
General procedure for the synthesis of compounds
*BOP as coupling agent
	Into a 50 mL flask equipped with magnetic stirrer with a solution of trans-ferulic acid (0.1 g, 0.51 mmol) in DMF (1.02 mL, 0.51 mmol) was added 0.51 mmol of the respective amine of the compound to be prepared, 0.068 mL (0.51 mmol) of Et3N and another containing 0.225 g of BOP in 1.02 mL of dichloromethane. After stirring in an ice bath for 30 minutes, the reaction mixture was stirred at room temperature until the starting material was completely consumed. The dichloromethane was then removed on a rotary evaporator. The remaining contents of the flask were dissolved in 10 mL of ethyl acetate, poured into separatory funnel with 10 mL of distilled water and extracted with ethyl acetate (three times with 10 mL). The organic phases were combined and washed three times with distilled water; after treatment with 10 mL 1 M NaHCO3 and 10 mL of 1N HCl, were last washed with distilled water, dried with Na2SO4, and the solvent evaporated. The products formed were isolated and purified by column chromatography on silica gel 60. As mobile phase the system was used Hexane: Ethyl acetate. The structural identification was made by infrared, 1H and 13C nuclear magnetic resonance(NMR) analysis and comparison with the literature data.
Compound 1: (E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-N-isobutylacrylamide 
White amorphous solid. M.p. 75-81 °C. Isolated yield (67,23%). IV ʋmax (KBr, m-1): 3286 (O-H), 3083 (C-H sp2), 2961-2934 (C-H sp3), 1656 (C=O), 1592, 1548 e 1516 (C=C aromatic).1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.47 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.96 (s, 1H), 6.90 (d, J=8.0 Hz, 2H), 6.80 (d, J=8.1 Hz, 1H), 6.26 (d, J=16.0, 1H), 6.07 (s, NH), 3.77 (s, OCH3), 3.11 (d, J=6.0 Hz, 2H), 1.76 (sept, J= 6.5 Hz, 1H), 0.86 (d, J=6.0 Hz, 6H). 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ (ppm): 166.61, 147.48, 146.85, 141.08, 127.23, 121.95, 118.06, 114.83, 109.72, 55.74, 47.13, 28.64, 20.11. MS(MALDI) calculated for [C14H19NO3] [M + H]+ 250.310, found [M + H]+ 250,232.
Compound 2: (E)-N-cyclohexyl-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acrylamide 
yellow amorphous solid. M.p.197-205 °C. Isolated yield (83,00%). IV ʋmax (KBr,cm-1): 3108 (O-H), 3012 (C-H sp2), 2979-2892 (C-H sp3), 1657 (C=O), 1618, 1579 e 1532 (C=C aromatic). 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.58 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.04 (d, J=8.0 Hz, 1H), 6.93 (s, 1H), 6.85 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.50 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.23 (s, 1H, NH), 3.85 (s, 1H, OCH3), 3.55 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 1.88 (sl, 4H). 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ (ppm): 165.28, 147.59, 146.88, 127.82, 121.93, 116.12, 114.91, 110.35, 110.20, 56.16, 46.49, 39.88.
Compound 3: (E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-N-phenylacrylamide 
yellow amorphous solid. M.p. 165-170 °C. Isolated yield (87,55%).IV ʋmax (KBr, cm-1): 3283 (O-H), 3066(C-H sp2), 2936-2855 (C-H sp3), 1654 (C=O), 1617, 1542 e 1514 (C=C aromatic).1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.52 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.04 (s, 1H), 6.98 (d, J= 14.0 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.27 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 5.65 (s, NH); 3.88 (s, OCH3); 1,56 (m, 11H). 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ (ppm): 165.46, 147.45, 146.82, 141.13, 127.49, 122.27, 118.48, 114.82, 109.75, 56.08, 48.67, 33.37, 25.66, 24.99.
Compound 4: (E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-N-isobutylacrylamide 
yellow amorphous solid. M.p. 143-147 °C. Isolated yield (91,38%). IV ʋmax (KBr, cm-1): 3361 (O-H), 3065 (C-H sp2), 2944 (C-H sp3), 1654 (C=O), 1583, 1555 e 1518 (C=C aromatic). 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ(ppm): 10.12 (s, OH); 7.69 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.51 (d, J=16.0; 1H), 7.30 (t, J=8.0 Hz, 2H), 7.18 (s , 1H), 7.07 (d , J=8.0 Hz, 1H), 7.02 (d, J=8.0 Hz, 1H), 6.82 (d, J=8.0, 1H), 6.65 (d, J=16.0 Hz, 1H), 3.81 (s, NH), 3.58 (s, OCH3). 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ (ppm): 164.30, 148.82, 148.06, 140.71, 139.62, 128.94, 126.38, 123.39, 122.23, 119.56, 119.10, 115.96, 110.99, 55.62.
Compound 5: (E)-N-benzyl-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acrylamide 
White amorphous solid. M.p. 143-147 °C. Isolated yield (70,63%). IV ʋmax (KBr, cm-1): 3337 (O-H), 3090 (C-H sp2), 2977 (C-H sp3), 1656 (C=O), 1621,1587 e 1552 (C=C aromatic). 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.55 (d, J = 16.0 Hz, 1H); 7.26 (sl, 4H); 6.88 (t, J= 8.0Hz, 2H); 6.63 (d, J = 6.0 Hz, 1H); 6.33 (d, J = 16.0 Hz, 1H); 6.03 (d, J = 8.0 Hz, 1H); 5.21 (s, 1H,NH); 4.48 (s, 2H); 3.77 (s, OCH3). 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ (ppm): 164.3, 146.9, 146.2, 140.8, 137.5, 128.0, 126.9, 126.4, 121.4, 117.2, 114.2,109.4, 104.3, 55.04, 43.09. 
*DCC as coupling agent
	Into a 50 mL flask equipped with magnetic stirrer containing 3 mL dichloromethane, 0.1g (0.51 mmol) trans-ferulic acid, 0.51 mmol of the respective amine of the compound to be prepared were added, 0.006g DMAP, which corresponds to 10 mol%, and 0.105g DCC (0.51 mmol). After stirring at room temperature for 24 hours the dichloromethane was removed by rotary evaporator. The remaining contents of the flask were dissolved in 10 mL of ethyl acetate, poured into separatory funnel with 10 mL of distilled water and extracted with ethyl acetate (three times with 10 mL). The organic phases were pooled and washed three times with distilled water and, after treatment with 10 mL of 1 M NaHCO3 and 10 mL of 1N HCl, were washed last with distilled water, dried with Na2SO4, and the solvent, evaporated. The formed products were isolated and purified by column chromatography on silica gel 60. As the mobile phase, the hexane: ethyl acetate system was used. The structural identification was made by infrared, 1H and 13C nuclear magnetic resonance (NMR) analysis and comparison with the literature data.
Compound 6: (E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-N-(4-methylbenzyl)acrylamide 
yellow amorphous solid. M.p. 145-150°C. Isolated yield (64,94%). IV ʋmax (KBr, cm-1): 3327 (O-H), 3288 (C-H sp2), 2938- 2838 (C-H sp3), 1655 (C=O), 1592 e 1427 (C=C aromatic). 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ(ppm): 9.49 (s, O-H), 8.43 (s, 1H), 7.36 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.10 (s, 4H), 6.97 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.50 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.43 (s, 1H, NH), 3.76 (s, 3H), 3.48 (s, 3H, OCH3); 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ (ppm): 165.60, 148.43, 147.96, 139.64, 136.61, 136.03, 129.02, 127.46, 126.52,121.79, 118.86, 115.68, 110.83, 73.00, 55.69, 42.18.
Compound 7: (E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-N-(4-methoxybenzyl)acrylamide 
white crystalline solid. M.p. 134-139°C. Isolated yield (43,17%). IV ʋmax (KBr, cm-1): 3356 (O-H), 3079 (C-H sp2), 2957- 2839 (C-H sp3), 1654 (C=O), 1592 e 1454 (C=C aromatic). 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.54 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.01 (s, 1H), 6.95 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.26 (d, J = 14.0 Hz, 1H); 6.14 (s, 1H, NH); 4.45 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.74 (s, 3H). 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ (ppm): 166.32, 147.60, 159.11, 146.87, 141.58, 130.34, 129.46, 127.31, 122.20, 117.85, 114.87, 114.16, 109.85, 56.04, 55.51, 43.46. MS(MALDI) calculated for C18H19NO4 [M+H]+: 314,350, found [M + H]+ 314,236.
Compound 8: (E)-N-(4-chlorobenzyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acrylamide white amorphous solid. M.p. 157-164°C. Isolated yield (46,87%). IV ʋmax (KBr, cm-1): 3335 (O-H), 3086 (C-H sp2), 2971 (C-H sp3), 1657 (C=O), 1590, 1559 e 1514 (C=C aromatic).1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.52 (d, J=16.0 Hz, 3H), 7.19 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.15 (m, 1H, H-2), 7.13 (s, 1H), 6.99 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.79 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.29 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 5.26 (s, 1H, NH); 4.43 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.78 (s, 3H). 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ (ppm): 166.46, 147.54, 146.76, 141.65, 136.90, 133.26, 129.16, 127.16, 122.22, 117.89, 114.94, 109.98, 109.87, 55.83, 43.11.
Compound 9: (E)-N-(3,4-dimethoxybenzyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acrylamide 
white crystalline solid. M.p. 197-202°C. Isolated yield (52,53%). IV ʋmax (KBr, cm-1): 3227 (O-H), 3063 (C-H sp2), 2937 (C-H sp3), 1652 (C=O), 1593, 1549 and 1515 (C=C aromatic). 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.49 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.20 (s, 4H), 6.93 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.74 (m, 3H), 6.24 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.21 (s, 1H), 4.38 (d, J= 6.0 Hz, 2H) 3.75 (s, 3H). 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ (ppm): 166.39, 149.12, 148.45, 147.64, 146.92, 141.50, 130.84, 127.22, 122.17, 122.09, 120.22, 117.84, 114.90, 111.21, 109.82, 55.94, 43.75.
Compound 10: (E)-N-(benzo[d][1,3]dioxol-5-ylmethyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) acrylamide 
yellow amorphous solid. M.p. 203-208°C. Isolated yield (70,41%). IV ʋmax (KBr, cm-1): 3300 (O-H), 3030 (C-H sp2), 2896 (C-H sp3), 1651 (C=O), 1598, 1534 and 1506 (C=C aromatic). 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ(ppm): 8.26 (s, OH), 7.19 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 6.95 (s, H-2), 6.85 (s, 4H), 6.75 (d, J = 24.0 Hz, 1H), 6.63 (m, 3H), 6.32 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.79 (s, 2H), 5.35 (s, 1H), 4.11 (d, J= 4.0 Hz, 2H), 3.62 (s, 3H). 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ (ppm): 165.54, 148.40, 147.92, 147.34, 143.16, 139.56, 133.53, 126.47, 121.71, 121.71, 120.65, 118.84, 115.75, 110.84, 108.12, 100.92, 55.58, 42.20.
Cells
HepG2 cells (human hepatocellular carcinoma), HCT116 (human colon carcinoma), HL-60 (human promyelocytic leukemia) and MRC5 (human lung fibroblast) obtained from the ATCC were used. Cells were cultured in cell culture bottles (75 cm 3, 250 mL volume), media used were RPMI 1640 and supplemented with 10% fetal bovine serum. Cellswere maintained in incubators with 5% CO2 atmosphere at 37 ° C. Cellular growth was monitored daily with the use of an inversion microscope. The medium was changed whenever cell growth reached the necessary confluence for nutrient renewal. For the maintenance of adhered cells, trypsin (0.25%) was used for the cells to detach from the walls of the bottles. Cell cultures showed microplasma negatives, as judged by placement with Hoechst (Mycoplasma Stain Kit, Cat. MYC1, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
Cytotoxicity assay
The biological step to test antitumor activity was done at the Laboratory of Tissue Engineering and Immunopharmacology - LETI, Oswaldo Cruz Foundation (FIOCRUZ). To evaluate the cytotoxicity of the substances, the alamar blue test was performed after 72 hours of exposure with test substances 11. Initially, the cells were plated in 96-well plates (100 μl / well of a solution of 0.3 x 106 cells / ml for cells in suspension and 0.7 x 105 cells / ml for adhered cells). After 24 hours of incubation, the test substances dissolved in DMSO were added to each well and incubated for 72 hours. Doxorubicin was used as a positive control. The negative control received the same amount of DMSO. Four hours (twenty-four hours for PBMC) before the end of the incubation period, 20 μL of stock solution (0.312 mg / mL) of alamar blue (resazurin) was added to each well. Absorbances were measured at wavelengths of 570 nm (reduced) and 595 nm (oxidized) using a plate reader.
Micro-organismos 
As cepas de Candida spp. utilizadas nos ensaios microbiológicos foram provenientes da coleção holandesa CBS (Central Bureau voor Schimmelcultures) – C. albicans CBS 562, C. tropicalis CBS 94 e C. krusei CBS 73.
Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
A CIM foi determinada pela técnica de microdiluição em caldo Sabouraud Dextrose (CSD, KASVI, Curitiba, Brasil), de acordo com protocolo proposto pela CLSI (2002), onde foi avaliada atividade antifúngica dos produtos produzidos a uma concentração inicial de 1.000 µg/mL, frente a cepas fúngicas do gênero Candida: C. albicans CBS 562; C. tropicalis CBS 94 e C. krusei CBS 73. Foram utilizadas placas de microtitulação de 96 poços e inicialmente foram inseridos em cada poço 100 µL de CSD. A seguir, 100 µL da solução da substância, foram inseridos no primeiro poço de cada coluna e diluídos seriadamente através da retirada de uma alíquota de 100 µL da cavidade mais concentrada para a cavidade sucessora. Ao fim de cada coluna, a última alíquota retirada foi desprezada. Em seguida, foram inseridos em cada poço 100 µL do inóculo da cepa fúngica, preparado de acordo com as normas do CLSI (2002) em CSD com concentração final equivalente a 2,5 x 103 UFC/mL. As placas foram incubadas em estufa por 24 h a 37 °C e, em seguida, realizada leitura visual dos resultados a partir da observação da formação de aglomerados de células fúngicas no fundo dos poços. Para confirmação da presença de micro-organismos viáveis, foram inseridos 50 µL do corante TCT (2,3,5-trifenil cloreto de tetrazólio) em cada poço da placa e a mesma incubada novamente em estufa por 24h. Neste sentido, na segunda leitura, foram considerados contendo micro-organismos viáveis os poços corados em vermelho. Foram considerados a CIM a menor concentração da substância capaz de inibir visivelmente o crescimento fúngico. Os ensaios foram realizados em triplicata e a CIM calculada pela moda dos resultados obtidos. O controle positivo utilizado para este teste foi nistatina (Sigma-Aldrish, São Paulo, Brasil), a uma concentração inicial de 12,5 µg/mL. Foi realizado controle de viabilidade das cepas, controle de esterilidade do meio de cultura e controle do DMSO (dimetilsulfóxido), utilizado para o preparo da solução dos produtos, simultaneamente ao ensaio. 
Determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM)
A partir dos resultados obtidos no ensaio para determinação da CIM, serão semeados 50 µL do conteúdo dos poços referentes a CIM e as duas concentrações imediatamente mais concentradas (CIMx2 e CIMx4) em placas de Petri contendo ágar Sabouraud Dextrose (ASD, KASVI, Curitiba, Brasil). As placas serão incubadas em estufa a 37°C por 24h. A leitura visual será realizada através da observação de crescimento fúngico no meio de cultura. Será considerada CFM, a menor concentração capaz de inibir o crescimento visível do subcultivo (CLSI, 2002). 
A relação CFM/CIM será calculada de forma a determinar se a substância possui uma atividade fungistática (CFM/CIM ≥ 4) ou fungicida (CFM/CIM <4) (SIDDIQUI et al., 2013).
Verificação do possível mecanismo de ação da substância sobre a parede celular fúngica – Ensaio do sorbitol
Será realizada a técnica da microdiluição (CLSI, 2002) na presença de sorbitol (INLAB, São Paulo, Brasil), protetor osmótico, com o objetivo de verificar o possível mecanismo de ação dos produtos sobre a parede celular de C. albicans (CBS 562). A técnica será realizada de forma semelhante à determinação da CIM, no entanto o inóculo utilizado será preparado com sorbitol a uma concentração final de 0,8 M. As placas serão incubadas em estufa a 37°C e as leituras serão realizadas após 24 e 48 h de incubação.
O controle positivo utilizado neste teste será o Diacetato de Caspofungina – (Sigma-Aldrish, São Paulo, Brasil), a uma concentração inicial de 5 µg/mL, (Letscher-Bru; Herbrecht, 2003; HAO et al., 2013). Será considerada a CIM na presença de sorbitol a menor concentração da substância capaz de inibir visivelmente o crescimento fúngico (FROST et al., 1995; FREIRES et al., 2014; LEITE et al., 2014).
RESULTADOS 
DISCUSSÃO
Atividade citotóxica 
Os resultados das atividades citotóxicas dos derivados do AF contra o crescimento de 3 linhagens de câncer humano e 1 linhagem de célula sadia são mostrados na Tabela 1.
De acordo com os resultados explicados na Tabela 1, considerando o composto (1) como o esqueleto de base do nosso estudo, o mesmo não apresentou atividade citotóxica para nenhuma linhagem celular estudada, sugerindo que o grupo alquila não contribui para a atividade citotóxica. 
O composto (2) também não apresentou atividade citotóxica nas linhagens celulares estudadas, diferentemente de seu análogo (3) e (4) no qual o nitrogênio não é um heteroátomo do anel pirrolidínico, mas um ligante da cadeia alicíclica, onde tiveram uma atividade seletiva ás células HL-60 com IC50 = 18,84 μg / ml e IC50 = 14,28 μg / ml, uma das explicações é que as amidas terciárias são reatívas e instáveis por não fazer ligações de hidrogênio, diferente das amidas secundárias que suas interações intermoleculares são fortes (VALEUR E BRADLEY, 2009), e pôde se observar que o composto (3) e (4) apresentou um grupo volumoso determinante para haver atividade antitumoral. 
O composto (5), que tem um anel benzílico ligado ao nitrogênio, apresentou atividade antitumoral contra todas células cancerígenas, tendo o melhor resultado nas células HL60 com IC50 = 17,49 μg / mL, porém apresentou citotoxicidade nas células MRC5 ( fibroblasto pulmonar humano), demonstrando que o composto não é seletivo para células tumorais. 
O composto (6) que tem um metila, que é um grupo doador de eletrons fraco, ligado a posição para do anel benzílico da amida, é seletivo para as células HL-60 e teve o IC50 reduzido para 15,79 μg / mL. 
O composto (7) mostrou citotoxicidade para as linhagens celulares HCT-116, HL-60 e MRC-5, 20.27 μg / mL , 22.23 μg / mL e 16.69 μg / mL respectivamente, o que a torna uma molécula inespecifica para as celulas tumorais, e em comparação com seu análogo (6) houve aumento do IC50 na linhagem tumoral HL-60. Sugerimos que o oxigenio ligado à metila interfere na flexibilidade da molécula, causando rigidez nessa região da molécula prejudicando a atividade biológica. 
No composto (8), verificou-se que quando mudamos o substituinte do anel aromático de um metoxi (7) para um cloreto, há seletividade para as células HL60 com IC50 = 15,79 μg / mL, sugerindo que cloro contribui como um doador de elétrons do anel aromático, aumentandoa densidade eletrônica na molécula deixando-a mais estável. O cloro também é capaz de fazer ligação covalente polar com o hidrogênio. 
O composto (9) foi o que apresentou o melhor resultado, nele há uma dissubstituição de metoxilas no anel aromático, o deixando específico para a linhagem celular tumoral HL-60 e tendo o menor valor de IC50 (12.51 μg / mL). O aumento da rigidez molecular nesse caso foi determinante para sua especificidade e para o aumento de sua atividade. Moléculas volumosas são protegidas de ataques enzimáticos, mas essa característica podem contribuir ou reduzir a atividade biológica.
O composto (10) apresentou um resultado semelhante ao composto (3), o que se constatou que em o aumento da rigidez e a disposição de dois átomos de oxigênio em grupamentos rígidos no radical piperonila não contribuiram para melhorar a atividade sob as células tumorais HL-60, porém continuou específica.
 
Atividade fungicida 
A atividade antifúngica (tabela 2) das amidas derivadas do ácido ferúlico foi baseada na concentração inibitória mínima. Os produtos foram interpretados e considerados ativo ou não de acordo com os seguintes parâmetros: ≤ 10 μg/mL = grande interesse para desenvolvimento; 10-50 μg/mL = alta atividade; 50-100 μg/mL = boa atividade; 100-500 μg/mL = atividade moderada; >500 μg/mL = produto inativo (HOLETZ et al., 2002).
A concentração inibitória mínima (CIM) dos compostos foi determinada com os métodos de microdiluição em 96 poços contra 3 espécies de cepas de Candida (Candida albicans, C. tropicalis, C. Krusei). Compostos ativos (MICs ≤ 500 μg / mL) foram testados quanto à sua capacidade de matar fungos, em vez de inibilos através da determinação da concentração mínima de fungicida (CFM).
Os compostos (1),(2),(3) e (4) apresentaram-se inativos (Tabela 3). Por outro lado, os compostos (5), (6), (7), (8), (9) e (10) apresentaram atividades variadas, sendo (10) aquele com a atividade mais ampla e mais alta. 
Uma análise da correlação entre estrutura e atividade mostrou que o composto mais potente (10) possuía a estrutura mais volumosa e que apresentara mais rigidez na molécula por possuir o anel piperonil com duas moléculas de oxigênio como heteroátomos na porção R. O análogo (9) foi o que apresentou o segundo melhor resultado e o mesmo também possui dois oxigenios ligados ao anel aromático da porção R, mas o mesmo apresenta um menos rigidez que o composto (10). O que nos leva a supor que o um grupo volumoso que cause uma certa rigidez na molécula é o responsável pela potencialização do efeito fungicida. 
É possivel observar que todas as molecúlas que possuem na sua porção R um espaçador entre o anel benzílico e o nitrogênio tiveram atividade fungicida, sendo isso o fator determinante para que as moléculas tenham atividade biológica contra as cepas de Candida.