ESTUDO DIRIGIDO - EXTRAÇÃO DE DNA

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Estudo Dirigido sobre Extração de DNA
Descreva os principais passos de uma extração de DNA
Descreva os principais passos de uma extração de DNA
Toda extração de DNA se baseia em 4 etapas básicas, presentes em qualquer protocolo de extração: Lise das membranas lipídicas, purificação do DNA (degradação de proteínas e outras macromoléculas), precipitação do DNA e resuspensão do DNA.
A lise da membrana deve ocorrer por meio da solubilização a partir de agentes que rompem as associações hidrofóbicas, destruindo a bicamada lipídica e desnaturando as proteínas. O processo ocorre pela ação de um tampão de extração, contendo: Tris-HCl; EDTA; CTAB ou SDS; PVP, BSA ou β-mercaptoetanol; e NaCl. Adiciona-se ainda uma Proteinase K que tem como função a degradação das proteínas e rapidamente inativa as nucleases que degradam o DNA. Essa mistura é mantida por um período (prox. a 20 min) sob aquecimento. 
Na segunda etapa, de purificação do DNA, utilizam-se reagentes químicos como: fenol, clorofórmio e álcool isoamílico. A função dessa mistura é desnaturar as proteínas que estão no lisado. Fenol e clorofórmio são agentes desnaturantes e o álcool isoamilico tem função de reduzir a geração de espuma no processo. A eficiência da mistura Fenol:Cloroformio em desproteinizar o lisado se fundamenta na propriedade hidrofóbica das proteínas que apresentam afinidade por solventes orgânicos. Após adição dos solventes e posterior centrifugação, teremos uma fase aquosa contendo DNA e proteínas, uma interfase de proteínas e uma fase orgânica contendo principalmente lipídeos. A fase aquosa é coletada e transferida para um novo tubo.
Na terceira etapa precipitaremos o DNA com etanol. O etanol sequestra a água e como o DNA é extremamente solúvel em água, este precipita. Após centrifugação, boa parte do DNA precipita no fundo do tubo. O sobrenadante pode ser facilmente retirado. Após isso, lava-se o precipitado com etanol 70% para completa remoção de sal (NaCl) ainda presente na amostra.
Na última etapa, realiza-se a resuspensão do DNA, utilizando-se um tampão TE (Tris e EDTA). O EDTA é um quelante que irá inativar qualquer enzima que possa ter permanecido ainda no processo enquanto o Tris irá tamponar o meio, garantindo a estabilidade e preservação do DNA extraído. 
Cabe ressaltar que determinadas amostras podem requerer uma etapa de pré-tratamento anteriormente a extração de DNA, como a trituração em N2 liquido empregada para extração de material vegetal.
Explique a função dos principais componentes de um tampão...
Explique a função dos principais componentes de um tampão de lise.
Os principais componentes de um tampão de Lise são:
Tris-HCl pH 8= visa manter o pH da solução durante a extração e evitar a ação de nucleases que degradam o DNA; 
EDTA = é uma substancia quelante de cátions divalentes, como o Mg+2 e Ca+2 inibindo o emprego desses cofatores em DNAses; 
CTAB e SDS = que são detergentes empregado para romper as membranas celulares; 
DTT = Reduz e quebra ligações disulfeto entrer cisteínas nas proteínas.
PVP, BSA ou β-mercaptoetanol = são agentes antioxidantes empregados na proteção do DNA contra a ação de compostos fenólicos; 
NaCl = tem função de auxiliar na precipitação do DNA. 
Proteinase K = tem como função a degradação das proteínas e rapidamente inativa as nucleases que degradam o DNA.
RNAse A = uma ribonuclease que tem por finalidade degradar o RNA presente juntamente com a amostra de DNA.
Explique as etapas de purificação do DNA? O que muda caso...
Explique as etapas de purificação do DNA? O que muda caso seja o RNA?
Na etapa de purificação do DNA, utilizam-se reagentes químicos como: fenol, clorofórmio e álcool isoamílico. A função dessa mistura é desnaturar as proteínas que estão no lisado. Fenol e clorofórmio são agentes desnaturantes e o álcool isoamilico tem função de reduzir a geração de espuma no processo. A eficiência da mistura Fenol:Cloroformio em desproteinizar o lisado se fundamenta na propriedade hidrofóbica das proteínas que apresentam afinidade por solventes orgânicos. Após adição dos solventes e posterior centrifugação, teremos uma fase aquosa contendo DNA e proteínas, uma interfase de proteínas e uma fase orgânica contendo principalmente lipídeos. A fase aquosa é coletada e transferida para um novo tubo. Após isso, precipitaremos o DNA com etanol. O etanol sequestra a água e como o DNA é extremamente solúvel em água, este precipita. Após centrifugação, boa parte do DNA precipita no fundo do tubo. O sobrenadante pode ser facilmente retirado.
	A extração e purificação do RNA é semelhante a observada para o DNA, no entanto, a grande dificuldade é quanto a grande quantidade de ribonucleases (RNAses) estáveis e ativas nos tecidos que permitem uma rápida degradação do ácido ribonucleico. Nos tampões de extração temos substâncias como o cloreto de lítio que auxilia a precipitação do RNA e isotiocianato de guanidina que permite a manutenção do RNA intacto nas etapas posteriores da extração, através da degradação das ribonucleases endógenas. Além disso, o uso de DNAse I proporciona a obteção de um RNA livre de contaminações por DNA. Na etapa seguinte, com adição de clorofórmio e fenol, tem-se após centrifugação, a formação de 3 fases: uma rosada com presença do fenol, uma interfase formada pelo clorofórmio e DNA e uma fase aquosa onde se encontrará o RNA. A precipitação do RNA também ocorre com emprego de um álcool, que em geral é o isopropanol.
Qual a função do Álcool na extração de ácidos nucléicos? ...
Qual a função do Álcool na extração de ácidos nucléicos? Quais álcoois podem ser usados e como escolhê-los?
O álcool é utilizado na etapa de precipitação dos ácidos nucleicos. Em geral, etanol ou isopropanol são os mais empregados. Sua função promove, em presença de cátions monovalentes, uma transição estrutural na molécula do ácido nucleico, que resulta na agregação e precipitação destes. A escolha do álcool varia de acordo com o ácido nucleico de interesse. DNA é mais solúvel em etanol do que em isopropanol, diferente do RNA.
Como podemos quantificar o DNA extraído?
Como podemos quantificar o DNA extraído?
Uma das principais técnicas empregadas na quantificação do DNA extraído é por espectrofotometria. A técnica ainda é capaz de determinar a pureza do material. A quantificação de DNA por espectrofotometria é realizada por medição da quantidade de luz absorvida pelo DNA em solução no comprimento de onda de 260 nm. Quanto maior for a absorção de luz nesse comprimento de onda, maior a concentração de DNA na solução. 
É comum que as amostras de ácido nucleico sejam contaminadas com outras moléculas (proteínas, compostos orgânicos, outros). O benefício secundário da utilização de análise por espectrofotometria é a capacidade de determinar a pureza da amostra usando o cálculo de 260/280 nm. Valores entre 1,7 e 2,0 indicam pureza adequada das extrações de DNA, enquanto valores abaixo podem significar a presença de proteínas ou outros contaminantes, valores superiores indicam contaminações com RNA.
Quais os principais problemas que podem ocorrer em uma ex...
Quais os principais problemas que podem ocorrer em uma extração de ácidos nucléicos e como evita-los?
Dentre os principais problemas que podem ocorrer na extração de ácidos nucleicos, citam-se: Degradação do material genético devido a contaminações por DNAses ou RNAses advindas de soluções, equimanetos, vidrarias ou do operador; Contaminação do material genético com material genético do operador; Degradação do material pelo mal acondicionamento ou manuseio de amostras. 
As principais soluções = Boas práticas de laboratório, cuidados com pipetas, uso de luvas, etc.