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Marcadores: Característica que é capaz de detectar diferenças entre dois ou mais indivíduos ou organismos Marcadores podem ser: ► Morfológicos ► Bioquímicos ► Moleculares (DNA e RNA) Isoenzimas: Marcador bioquímico ► Grupo de múltiplas formas moleculares da mesma enzima que ocorre em uma espécie, como resultado da presença de mais de um gene codificando cada uma das enzimas Homologia entre genes: Desempenham a mesma atividade catalítica, mas podem ter capacidade distinta de migração quando submetidas à eletroforese Etapas Detecção Izoenzimas: I. Extração de proteínas do tecido vegetal II. Separação destas proteínas através de eletroforese III. Coloração do gel IV. Interpretação do padrão de bandas Cada banda revelada no gel se constitui em um marcador genético Vantagens: rápida, barata, co-dominante (genótipos homozigotos e heterozigotos são identificados) Limitações: poucos locos e pequeno número de alelos por locos São Marcadores baseados no polimorfismo em sequência de DNA ou RNA São características de DNA que diferenciam dois ou mais indivíduos e são herdados geneticamente São neutros em relação a efeitos epistáticos (vários genes – um fenótipo) ou pleitrópicos (um gene – vários fenótipos) Permitem a identificação de genótipos em estádios iniciais da planta: aceleram o programa de melhoramento A maioria é co-dominante (diferenciam homo de heterozigoto), ao contrário dos marcadores morfológicos Explicação: P1 é A e P2 é AA; F1 é Aa e seus descentes são misturados, como mostram os marcadores dominantes (que só mostram o fenótipo) e os codominantes (que representam o genótipo) Marcadores moleculares podem ser baseados em: ► PCR ► Hibridização ► Sequenciamento RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA): 1. Extração de DNA 2. Quantificação de DNA extraído 3. Padronização da concentração de DNA para PCR 4. Reação de PCR 5. Eletroforese 6. Coloração com brometo de etídio ou outro 7. Visualização das bandas Uma única sequencias curta e arbitrária de 10 -15 nt Amplificação do DNA genômico em condições de baixa extringência (45°C) Resultam na amplificação de uma ou mais sequencias a partir de cada iniciador São dominantes (não diferenciam homo de heterozigoto) Explicação: Ambos homozigoto (A1A1) e heterozigoto aparecem na eletroforese, mas sem diferenciação entre eles; O único que não aparece é o A2A2 pois é recessivo Depois, transpõe-se a informação do gel para uma matriz binária: Vantagens RAPD: ► Simples, rápida e de baixo custo ► Polimórfica ► Pode ser utilizada sem informação prévia da sequencia de DNA Desvantagens: ► Dominante ► Reprodutibilidade SCAR (SEQUENCE CHARACTERIZED AMPLIFIED REGION): Obtidos pela seleção de marcas RAPD, as quais são clonadas, sequenciadas e utilizadas para o desenho de primers específicos Após PCR, as bandas específicas são observadas em gel de agarose O polimorfismo pode ser detectado diretamente pela presença ou ausência da banda MICROSSATÉLITES: Os microssatélites (SSR- Simple Sequence Repeat) são sequências simples repetidas de DNA, que se repetem em tandem ao longo do genoma, formando sítios altamente polimórficos, o que possibilita o seu uso como marcas moleculares Como marcadores, são codominantes, multialélicos, e aplicáveis em diversos tipos de estudos, principalmente no mapeamento genético Primers que flanqueiam sequências SSR geralmente são desenhados a partir da construção de bibliotecas genômicas, bibliotecas genômicas enriquecidas, sequências depositadas em bancos de dados e, alternativamente, a partir de sequências internas simples repetidas (ISSR) Origem: crossing over desigual, retrotransposição e slippage Etapas da técnica: 1. Extração de DNA 2. Quantificação de DNA extraído 3. Padronização da concentração de DNA para PCR 4. Reação de PCR 5. Eletroforese 6. Coloração com brometo de etídio ou outro 7. Visualização das bandas Utiliza um par de primers específicos desenhados a partir das sequencias conservadas que flanqueiam a região microssatélite São marcadores co-dominantes A eletroforese capilar é uma técnica aplicável na determinação de uma grande variedade de amostras, incluindo hidrocarbonetos aromáticos, vitaminas hidrossolúveis e lipossolúveis, amino ácidos, íons inorgânicos, ácidos orgânicos, fármacos, catecolaminas, substâncias quirais, proteínas, peptídeos e muitos outros A técnica baseia-se no conceito de mobilidade iônica (eletroforética) e na produção de um fluxo eletrosmótico que é mantido através da interação de um eletrólito (Eletrólito de Fundo - EF) com a diferença de potencial aplicada nos eletrodos (e ao longo de todo capilar) e também com superfície de carga formada no interior do capilar Este fluxo deve ser capaz de promover uma migração adequada dos analitos até o detector em um determinado tempo O sinal gerado no detector é plotado sob forma de eletroferograma (gráfico de tempo versus intensidade dos componentes de uma mistura separados por eletroforese em um meio de suporte, neste caso, o capilar de sílica fundida) Vantagens Microssatélites: ► Abundantes e uniformemente distribuídos por todo o genoma ► Multialélicos ► Primers são transferíveis ► Reprodutibilidade ► Requerem pequena quantidade de DNA ► Codominantes Desvantagens: ► Apenas um loco por ensaio: uso de multiplex PCR ► Descoberta de marcadores SSR depende da disponibilidade de sequências para identificar as regiões flanqueadoras das repetições ISSR (INTER- SIMPLE SEQUENCE REPEAT): Permite explorar microssatélites sem conhecimento prévio da sequência de DNA Primers são as próprias regiões microssatélites Os primers são mais robustos que os primers RAPD, pois apresentam maior superfície de ancoragem e possuem maiores temperaturas de anelamento, aumentando a reprodutibilidade dos produtos Vantagens: ► Não necessita de conhecimento prévio da sequencia de DNA ► Técnica simples, rápida, eficiente e com alta reprodutibilidade ► Bastante polimórfico Desvantagens: ► São marcadores dominantes AFLP (AMPLIFIED FRAGMENT LENGHT POLYMORPHISM): Consiste em diferenças herdadas nos tamanhos dos fragmentos de DNA quando ele é digerido com enzimas de restrição A base genética do polimorfismo observado resulta de mutações nos sítios de restrição ou de inserções, deleções ou rearranjos entre estes sítios Etapas da técnica: 1. Extração de DNA 2. Corte da fita dupla de DNA com enzimas de Restrição (corte raro e corte frequente) 3. Ligação de adaptadores 4. PCR: pré-amplificação e amplificação seletiva 5. Gel desnaturante de poliacrilamida 6. Visualização das bandas coradas com prata ou fluorescência Vantagens: ► Muito polimórficos ► Muitos locos avaliados ► Ampla cobertura do genoma ► Não há necessidade de conhecimento prévio da sequencia de DNA Desvantagens: ► São dominantes ► Utilização de gel de poliacrilamida RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGHT POLYMORPHISM): Etapas da técnica: Extração de DNA Corte com enzimas de Restrição Gel agarose Técnica Southern blot Hibridização da sonda Revelação das bandas: exposição a um filme de raio X, reação cromogênica, fluorescência São codominantes DART (DIVERSITY ARRAY TECHNOLOGY): É uma técnica de alto rendimento que pode detectar variações alélicas para fornecer cobertura abrangente do genoma sem qualquer informação de sequência de DNA para genotipagem e outras análises genéticas Marcador DArT: ► 50-100 ng de DNA ► Genotipagem de 5000-8000 locos em um ensaio ► Bialélicos e dominantes Duasetapas principais: A. Construção de microarranjo contendo painel de diversidade B. Hibridização no painel de diversidade As etapas gerais envolvem reduzir a complexidade do DNA genômico com enzimas de restrição específicas, escolher diversos fragmentos para servir como representações para os genomas originais, amplificar via reação em cadeia da polimerase (PCR), inserir fragmentos em um vetor para serem colocados como sondas dentro de um microarray , então os alvos fluorescentes de uma sequência de referência poderão hibridizar com sondas e passar por um sistema de imagem O objetivo é identificar e quantificar várias formas de polimorfismo de DNA dentro do DNA genômico das espécies amostradas SNP (SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM): É uma variação na sequência de DNA que afeta somente uma base (adenina(A), timina (T), citosina (C) ou guanina (G)) na sequência do genoma entre indivíduos de uma espécie ou entre pares de cromossomos de um individuo Um polimorfismo de nucleotídeo único é uma substituição da linha germinativa de um único nucleotídeo em uma posição específica no genoma Marcadores moleculares funcionais focados em: ► DNA conservado e famílias gênicas ► Íntrons ► Genes expressos ► Genes de resistência ► Promotor ► Transposons Marcadores moleculares ► Deve ser capaz de diferenciar progenitores ► Deve ser reproduzido com precisão na progênie ► Estabilidade em diferentes ambientes ► Alto nível de polimorfismo ► Detectar grande número de locos Análise de diversidade genética Estabelecimento de relacionamentos filogenéticos entre diferentes espécies Registro de cultivares Seleção assistida por Marcadores Construção de mapas genéticos Prospecção de genes para o melhoramento genético Mapeamento de QTLs (Quantitative trait loci): ► São regiões genômicas que contêm os genes associados a uma característica quantitativa em particular ► Muitas características agronomicamente importantes, como produtividade, qualidade e algumas formas de resistência a doenças são controladas por muitos genes e são conhecidos como caracteres quantitativos (ou também características poligênicas, multifatoriais ou complexas) https://pt.wikipedia.org/wiki/DNA https://pt.wikipedia.org/wiki/Adenina https://pt.wikipedia.org/wiki/Timina https://pt.wikipedia.org/wiki/Citosina https://pt.wikipedia.org/wiki/Guanina https://pt.wikipedia.org/wiki/Genoma https://pt.wikipedia.org/wiki/Linha_germinal https://pt.wikipedia.org/wiki/Nucle%C3%B3tido https://pt.wikipedia.org/wiki/Genoma
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