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MELHORAMENTO DE PLANTAS

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 Marcadores: Característica que é capaz de 
detectar diferenças entre dois ou mais indivíduos 
ou organismos 
 Marcadores podem ser: 
► Morfológicos 
► Bioquímicos 
► Moleculares (DNA e RNA) 
 Isoenzimas: Marcador bioquímico 
► Grupo de múltiplas formas moleculares da 
mesma enzima que ocorre em uma espécie, 
como resultado da presença de mais de um 
gene codificando cada uma das enzimas 
 Homologia entre genes: Desempenham a mesma 
atividade catalítica, mas podem ter capacidade 
distinta de migração quando submetidas à 
eletroforese 
 
 Etapas Detecção Izoenzimas: 
I. Extração de proteínas do tecido vegetal 
II. Separação destas proteínas através de 
eletroforese 
III. Coloração do gel 
IV. Interpretação do padrão de bandas 
 Cada banda revelada no gel se constitui em um 
marcador genético 
 Vantagens: rápida, barata, co-dominante 
(genótipos homozigotos e heterozigotos são 
identificados) 
 Limitações: poucos locos e pequeno número de 
alelos por locos 
 
 São Marcadores baseados no polimorfismo em 
sequência de DNA ou RNA 
 São características de DNA que diferenciam dois 
ou mais indivíduos e são herdados geneticamente 
 São neutros em relação a efeitos epistáticos 
(vários genes – um fenótipo) ou pleitrópicos (um 
gene – vários fenótipos) 
 Permitem a identificação de genótipos em 
estádios iniciais da planta: aceleram o programa 
de melhoramento 
 A maioria é co-dominante (diferenciam homo de 
heterozigoto), ao contrário dos marcadores 
morfológicos 
 
 Explicação: P1 é A e P2 é AA; F1 é Aa e seus 
descentes são misturados, como mostram os 
marcadores dominantes (que só mostram o 
fenótipo) e os codominantes (que representam o 
genótipo) 
 Marcadores moleculares podem ser baseados em: 
► PCR 
► Hibridização 
► Sequenciamento 
 
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA): 
1. Extração de DNA 
2. Quantificação de DNA extraído 
3. Padronização da concentração de DNA para 
PCR 
4. Reação de PCR 
5. Eletroforese 
6. Coloração com brometo de etídio ou outro 
7. Visualização das bandas 
 
 Uma única sequencias curta e arbitrária de 10 -15 
nt 
 Amplificação do DNA genômico em condições de 
baixa extringência (45°C) 
 Resultam na amplificação de uma ou mais 
sequencias a partir de cada iniciador 
 São dominantes (não diferenciam homo de 
heterozigoto) 
 
 Explicação: Ambos homozigoto (A1A1) e 
heterozigoto aparecem na eletroforese, mas sem 
diferenciação entre eles; O único que não aparece 
é o A2A2 pois é recessivo 
 Depois, transpõe-se a informação do gel para uma 
matriz binária: 
 
 Vantagens RAPD: 
► Simples, rápida e de baixo custo 
► Polimórfica 
► Pode ser utilizada sem informação prévia da 
sequencia de DNA 
 Desvantagens: 
► Dominante 
► Reprodutibilidade 
SCAR (SEQUENCE CHARACTERIZED AMPLIFIED 
REGION): 
 Obtidos pela seleção de marcas RAPD, as quais 
são clonadas, sequenciadas e utilizadas para o 
desenho de primers específicos 
 Após PCR, as bandas específicas são observadas 
em gel de agarose 
 O polimorfismo pode ser detectado diretamente 
pela presença ou ausência da banda 
MICROSSATÉLITES: 
 
 Os microssatélites (SSR- Simple Sequence Repeat) 
são sequências simples repetidas de DNA, que se 
repetem em tandem ao longo do genoma, 
formando sítios altamente polimórficos, o que 
possibilita o seu uso como marcas moleculares 
 Como marcadores, são codominantes, 
multialélicos, e aplicáveis em diversos tipos de 
estudos, principalmente no mapeamento genético 
 Primers que flanqueiam sequências SSR 
geralmente são desenhados a partir da 
construção de bibliotecas genômicas, bibliotecas 
genômicas enriquecidas, sequências depositadas 
em bancos de dados e, alternativamente, a partir 
de sequências internas simples repetidas (ISSR) 
 Origem: crossing over desigual, retrotransposição 
e slippage 
 Etapas da técnica: 
1. Extração de DNA 
2. Quantificação de DNA extraído 
3. Padronização da concentração de DNA para 
PCR 
4. Reação de PCR 
5. Eletroforese 
6. Coloração com brometo de etídio ou outro 
7. Visualização das bandas 
 Utiliza um par de primers específicos desenhados 
a partir das sequencias conservadas que 
flanqueiam a região microssatélite 
 
 São marcadores co-dominantes 
 
 A eletroforese capilar é uma técnica aplicável na 
determinação de uma grande variedade de 
amostras, incluindo hidrocarbonetos aromáticos, 
vitaminas hidrossolúveis e lipossolúveis, amino 
ácidos, íons inorgânicos, ácidos orgânicos, 
fármacos, catecolaminas, substâncias quirais, 
proteínas, peptídeos e muitos outros 
 A técnica baseia-se no conceito de mobilidade 
iônica (eletroforética) e na produção de um fluxo 
eletrosmótico que é mantido através da interação 
de um eletrólito (Eletrólito de Fundo - EF) com a 
diferença de potencial aplicada nos eletrodos (e 
ao longo de todo capilar) e também com 
superfície de carga formada no interior do capilar 
 Este fluxo deve ser capaz de promover uma 
migração adequada dos analitos até o detector 
em um determinado tempo 
 O sinal gerado no detector é plotado sob forma de 
eletroferograma (gráfico de tempo versus 
intensidade dos componentes de uma mistura 
separados por eletroforese em um meio de 
suporte, neste caso, o capilar de sílica fundida) 
 
 Vantagens Microssatélites: 
► Abundantes e uniformemente distribuídos 
por todo o genoma 
► Multialélicos 
► Primers são transferíveis 
► Reprodutibilidade 
► Requerem pequena quantidade de DNA 
► Codominantes 
 Desvantagens: 
► Apenas um loco por ensaio: uso de multiplex 
PCR 
► Descoberta de marcadores SSR depende da 
disponibilidade de sequências para identificar 
as regiões flanqueadoras das repetições 
ISSR (INTER- SIMPLE SEQUENCE REPEAT): 
 Permite explorar microssatélites sem 
conhecimento prévio da sequência de DNA 
 Primers são as próprias regiões microssatélites 
 Os primers são mais robustos que os primers 
RAPD, pois apresentam maior superfície de 
ancoragem e possuem maiores temperaturas de 
anelamento, aumentando a reprodutibilidade dos 
produtos 
 Vantagens: 
► Não necessita de conhecimento prévio da 
sequencia de DNA 
► Técnica simples, rápida, eficiente e com alta 
reprodutibilidade 
► Bastante polimórfico 
 Desvantagens: 
► São marcadores dominantes 
AFLP (AMPLIFIED FRAGMENT LENGHT 
POLYMORPHISM): 
 Consiste em diferenças herdadas nos tamanhos 
dos fragmentos de DNA quando ele é digerido 
com enzimas de restrição 
 A base genética do polimorfismo observado 
resulta de mutações nos sítios de restrição ou de 
inserções, deleções ou rearranjos entre estes 
sítios 
 Etapas da técnica: 
1. Extração de DNA 
2. Corte da fita dupla de DNA com enzimas de 
Restrição (corte raro e corte frequente) 
3. Ligação de adaptadores 
4. PCR: pré-amplificação e amplificação seletiva 
5. Gel desnaturante de poliacrilamida 
6. Visualização das bandas coradas com prata ou 
fluorescência 
 
 Vantagens: 
► Muito polimórficos 
► Muitos locos avaliados 
► Ampla cobertura do genoma 
► Não há necessidade de conhecimento prévio 
da sequencia de DNA 
 Desvantagens: 
► São dominantes 
► Utilização de gel de poliacrilamida 
 
RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGHT 
POLYMORPHISM): 
 Etapas da técnica: 
 Extração de DNA 
 Corte com enzimas de Restrição 
 Gel agarose 
 Técnica Southern blot 
 Hibridização da sonda 
 Revelação das bandas: exposição a um filme de 
raio X, reação cromogênica, fluorescência 
 
 São codominantes 
 
DART (DIVERSITY ARRAY TECHNOLOGY): 
 É uma técnica de alto rendimento que pode 
detectar variações alélicas para fornecer 
cobertura abrangente do genoma sem qualquer 
informação de sequência de DNA para 
genotipagem e outras análises genéticas 
 Marcador DArT: 
► 50-100 ng de DNA 
► Genotipagem de 5000-8000 locos em um 
ensaio 
► Bialélicos e dominantes 
 Duas