Relatório Cromatografias

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Universidade Federal de Minas Gerais
 Instituto de Ciências Exatas
 Departamento de Química
Relatório 1 – Cromatografia em camada delgada e cromatografia em coluna
Isabela de Avellar Costa, Ricardo José da Silva Júnior
Curso de Farmácia, Turma T5, Professora Henriete da Silva Vieira
Belo Horizonte, 10 de abril de 2013
Introdução
A cromatografia é um método físico-químico de análise que possibilita a identificação, purificação e separação de substâncias partindo do princípio de diferença de velocidade com que as substâncias se movem pela fase estacionária quando arrastadas por um solvente em movimento. 
Realizaram-se duas técnicas cromatográficas para a realização dos experimentos. A cromatografia em camada delgada (CCD) e a cromatografia em coluna(CC). Na cromatografia em camada delgada, uma placa de vidro é coberta com uma fina camada de sílica e a amostra é aplicada numa extremidade e o solvente é empregado em uma cuba de eluição, como mostra a figura 1.
Figura 1. Processo de aplicação e de eluição
 Como a sílica é polar, substâncias que interagem com a mesma são pouco arrastadas pelo solvente e substâncias apolares são mais arrastadas na placa pelo solvente que também é apolar. Na cromatografia em coluna um tubo de vidro é empacotado com a fase estacionária e a eluição é feita na vertical com um ou mais solventes (figura 2). 
 Figura 2. Coluna de eluição
São obtidas frações dessa eluição que normalmente é acompanhada pela análise em CCD. Os objetivos dos experimentos são introduzir as técnicas de CCD e CC, estudar a fotoisomerização cis-trans do azobenzeno e extrair pigmentos vegetais e fracioná-los por meio de CC.
Materiais e Métodos
CCD - Parte I – Isomerismo cis-trans no Azobenzeno
Aplicou-se usando um tudo capilar uma gota da solução de azobenzeno (ponto de fusão 69ºC) em uma placa cromatográfica. Levou-se a placa ao sol por 15 minutos. Em uma cuba seca adicionou-se o solvente Tolueno (ponto de fusão -95ºC) de modo a atingir não mais que 1cm de altura e um pedaço de papel filtro para saturar de vapor a cuba. Retirou-se a placa do sol e aplicou-se a solução de azobenzeno que ficou no escuro. 
Introduziu-se a placa na cuba de eluição e deixou-se o eluente subir até cerca de 1cm abaixo da extremidade superior da placa. Removeu-se a placa e marcou-se com um material fino a posição atingida pelo eluente (frente do eluente). Colocou-se a placa na estufa para a evaporação do solvente e mediu-se as distâncias entre o ponto de aplicação da amostra e a frente do eluente e também a distância entre o ponto de aplicação e o centro de casa mancha. Fez-se os cálculos de Fator de Retenção (Rf) através na equação 1.
Rf = Distância percorrida pela subs. = d1 distância percorrida pelo eluente d2
Equação 1. Cálculo de Rf
Associou-se as manchas ao cis-azobenzeno e ao trans-azobenzeno.
Parte II – Identificação dos compostos Benzidrol e Benzofenona
Transferiu-se a ajuda de uma espátula pequena quantidade de uma substância desconhecida (substância A) para um vidro de penicilina e dissolveu-se a substância em três gotas de acetona (ponto de fusão -94,6ºC). Aplicou-se duas vezes com um tubo capilar essa solução em uma placa cromatográfica. Pegou-se outro vidro de penicilina e adicionou-se pequena quantidade de outra substância desconhecida (substância B). Diluiu-se com três gotas de acetona e aplicou-se duas vezes na mesma placa cromatográfica onde foi aplicada a solução A, porém aplicou-se em pontos diferentes cada substância. Procedeu-se a eluição da placa com tolueno na cuba, removeu-se a placa após a eluição, secou-se o solvente da placa na estufa e introduziu-se a placa em uma cuba reveladora contendo iodo. Aguardou-se até completa complexação do iodo para visualização das manchas. Removeu-se a placa e com uma lapiseira contornou-se as manchas. Fez-se os cálculos de Rf’s e associou-se as manchas ao Benzidrol (ponto de fusão 65ºC) e à Benzofenona (ponto de fusão 48,5ºC).
CC – Extração e fracionamento de pigmentos vegetais
Para o empacotamento da coluna, fixou-se uma coluna de vidro em um conjunto suporte. Com a torneira fechada adicionou-se 10mL de Hexano (ponto de fusão -94ºC) e um pequeno chumaço de algodão na coluna com auxílio de um bastão de vidro. Adicionou-se com a ajuda de um funil uma suspensão contendo 5g de sílica e hexano de modo a acomodar bem a suspensão na coluna. Para preparar o extrato, pesou-se 10g de folhas de espinafre sem as nervuras centras e ferveu-se em 100mL de água destilada (ponto de fusão 0ºC) por 2 minutos em um béquer de 250mL. Desprezou-se a água na pia, resfriou-se as folhas em água gelada e secou-se as folhas com papel absorvente. Em um almofariz contendo 15mL de acetona e hexano (1:1) triturou-se as folhas até obter uma solução verde. Transferiu-se a solução para um béquer pequeno e adicionou-se 2 pontas de espátulas de sílica ao béquer para incorporar o extrato. Colocou-se o béquer no banho maria agitando sempre com o bastão para não projetar até o solvente secar completamente, obtendo-se um pó bem fino e verde.
Para a eluição, com a torneira fechado, colocou-se outro chumaço de algodão e o extrato no topo da coluna. Colocou-se o hexano até completar a coluna. Colocou-se embaixo da coluna um erlenmeyer de 125mL, abriu-se a torneira e coletou-se hexano até a 1ª banda ficar bem próxima à torneira. Fechou-se a torneira, trocou-se o erlenmeyer. Abriu-se a torneira e recolheu-se a 1ª banda (Fração I) até o eluente perder a cor. Substitui-se o hexano por acetona e em outro erlenmeyer recolheu-se hexano e acetona até que a 2ª banda ficasse bem próxima da torneira. No 4º erlenmeyer recolheu-se então a 2ª banda (fração II) eluída pela acetona. Ao todo utilizou-se aproximadamente 75mL de hexano e 15mL de acetona para eluir. Mediu-se esses volumes com o auxilio de uma proveta de 25mL.
Resultados e Discussão
CCD – Não realizou-se a Parte I – Isomerismo cis-trans no Azobenzeno pois o Azobenzeno havia acabado no laboratório. Porém pode-se prever o resultado do experimento. O azobenzeno exposto à luz produz tanto o isomerismo cis quanto o trans já que sua ligação π pode ser quebrada se exposta à luz (Figura 3). 
Figura 3. Isomerismo cis-trans do Azobenzeno
Então no local de aplicação do azobenzeno exposto apareceriam duas manchas, uma correspondente ao cis-azobenzeno e outra ao trans-azobenzeno e no local de aplicação do azobenzeno não exposto à luz só apareceria uma mancha correspondendo ao trans-azobenzeno. Como pode-se observar pela estrutura molecular do trans e do cis azobenzeno, a isomeria cis é mais polar do que a isomeria trans, já que os grupos mais volumosos (C6H5) estão no mesmo lado da molécula. Portanto, a placa ficaria conforme a figura 4. 
Figura 4. Placa cromatográfica após revelação no iodo
Observa-se então que a amostra que ficou mais próxima do ponto de aplicação é correspondente ao cis-azobenzeno que é mais polar e interage mais fortemente com a sílica da placa. As outras duas machas, mais distantes do ponto de aplicação são correspondentes ao trans-azobenzeno que é mais apolar e interagiu mais com o eluente (tolueno). Previu-se esse resultado, entretanto não pôde ser possível prever os cálculos de Rf’s já que não realizou-se o experimento. 
A Parte II – Identificação dos compostos Benzidrol e Benzofenona, foi realizada sem nenhum problema. Observou-se na placa duas manchas, uma mais longe do ponto de aplicação e correspondente à substância A e outra mais próxima da placa, correspondente à substância B (figura 5).
Figura 5. Placa cromatográfica após revelação na cuba de iodo.
 Assim concluiu-se que a substância B é mais polar que a substância A já que interagiu mais fortemente com a sílica que também é polar. Analisou-se a estrutura do benzidrol e da benzofenona (figura 6) e observou-se que o benzidrol é mais polar que a benzofenona, pois possuí um grupo hidroxila.
Figura 6. Estrutura da benzofenona e do benzidrol
Assim associou-se que a substânciaA é a benzofenona, pois é mais apolar e o benzidrol é a substância B, pois é mais polar e realizou-se o seguinte cálculo de Rf:
Após os experimentos respondeu-se o questionário abaixo:
Em que consiste a técnica CCD?
A cromatografia em camada delgada (CCD) consiste na separação dos componentes de uma mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana. Uma placa de vidro é revestida com uma fina camada de um material adsorvente (geralmente sílica-gel) formando as cromatoplacas. A amostra a ser analisada e aplicada numa extremidade e o desenvolvimento do cromatograma deve ser feito em atmosfera saturada com o solvente empregado, numa cuba de eluição.
Em que situações CCD pode ser utilizada com técnica de separação/ purificação?
Para, por exemplo, separar compostos orgânicos a partir de extratos naturais. Nesse caso o extrato é primeiro submetido à cromatografia em coluna e posteriormente à cromatografia em camada delgada, onde misturas são identificadas e as substâncias separadas.
 Complete a tabela abaixo:
	
Substância
	Estrutura
	Polaridade (ordem crescente)
	Rf
	Cis-azobenzeno
	
	Cis -Azobenzeno
>
Trans - Azobenzeno
	Não
realizado
	Trans-azobenzeno
	
	
	Não
realizado
	Benzidrol
	
	
Benzidrol >
Benzofenona
	
0,358
	Benzofenona
	
	
	
0,448
Qual azobenzeno foi utilizado na atividade? Justifique.
Utilizou-se o trans-azobenzeno, uma vez que esta é sua configuração antes de passar pela fotoisomerização. Após este processo, ele transforma-se em cis-azobenzeno.
Qual deles é o mais estável? Por quê?
O mais estável é o trans-azobenzeno, pois nesta conformação haverá menor repulsão entre os grupos, já que os mais volumosos estão em locais opostos.
O que ocorreu durante a irradiação de luz? Equacione a reação química correspondente ao processo.
Os azo-derivados possuem a ligação N=N, que é fotoquimicamente sensível na região do visível. Assim, ocorreu a isomerização do composto, transformando o trans-azobenzeno em cis-azobenzeno, como podemos observar na equação química abaixo (equação 2):
Equação 2. Transformação de trans-azobenzeno em cis-azobenzeno pela luz.
Identifique as substâncias A e B.
A substância A é a benzofenona e a B é o benzidrol.
Como a confirmação da identidade dessas substâncias poderia ser feita, utilizando CCD?
Devido à diferença de polaridade das duas substâncias, poderíamos utilizar a CCD para confirmar a identidade dessas substâncias, analisando-se o quanto cada uma delas foi “arrastada” pelo solvente. Assim, a que ficasse mais retida seria o Benzidrol e a que fosse mais arrastada seria a Benzofenona.
 CC – Extração e fracionamento de pigmentos vegetais. Com o experimento de extração de pigmentos do espinafre extraiu-se duas frações de pigmentos: uma fração mais apolar e amarela claro, que foi eluída primeiro pelo hexano que também é apolar e uma fração mais polar e verde, que foi eluída pela acetona que também é polar. Conhecendo que os dois pigmentos do espinafre são os carotenos, com cor amarelada e a clorofila com cor esverdeada, pode-se concluir que a fração I era o caroteno e a fração II a clorofila. E observando-se a estrutura das duas substâncias (figura 7) nota-se que a clorofila é mais polar que o caroteno e por isso foi eluída com a acetona. 
Figura 7. Estrutura do caroteno e da clorofila
Após o experimento respondeu-se o questionário abaixo:
Consulte na literatura as estruturas dos carotenos e das clorofilas.
As duas estruturas estão presentes na figura 7.
Considerando que os carotenos apresentam cores próximas do amarelo enquanto as clorofilas são verdes, avalie as polaridades das misturar obtidas e identifique o conteúdo das mesmas.
O caroteno foi extraído com hexano, que é um solvente apolar. Portanto o caroteno é apolar. Já a clorofila foi extraída com a acetona, que é um solvente polar. Logo, as clorofilas são polares.
Correlacione a polaridade com a estrutura química dos componentes da mistura.
Os carotenos são hidrocarbonetos e possuem uma cadeia de carbono longa. Isso confere à molécula um caráter apolar. Já as clorofilas possuem funções como cetonas, ésteres, aldeídos e ácidos carboxílicos que confere à molécula um caráter polar.
Um aluno leu rapidamente o procedimento experimental e começou esta prática, no entanto, ao invés de utilizar inicialmente o hexano ele confundiu e começou a coluna com acetona. Discuta o que você acha desta troca de eluentes.
A troca de eluentes não irá separar as substâncias e ambas serão arrastadas pelo solvente. Isso ocorre porque a substância menos polar (caroteno) está interagindo menos com a coluna, e o solvente, mesmo sendo polar, o arrastará juntamente com a clorofila, que é polar.
Faça uma pesquisa sobre outros adsorventes que podem ser utilizados em métodos de separação por cromatografia em coluna, mostrando qual a diferença entre eles.
Outros adsorventes sólidos para cromatografia de coluna em ordem crescente de capacidade de retenção de compostos polares são: papel, amido, açucares, sulfato de cálcio, sílica gel, óxido de magnésio, alumina e carvão ativo. A alumina usada comercialmente pode ser ácida, básica ou neutra. A alumina ácida é útil na separação de ácidos carboxílicos e aminoácidos; a básica é utilizada para a separação de aminas.
Conclusão
Com os experimentos realizados concluiu-se que ambas as técnicas de cromatografia são muito eficientes para identificação, separação e identificação de substâncias e que normalmente se faz necessária a utilização concomitante da cromatografia em coluna e da cromatografia em camada delgada.
Referências bibliográficas
Apostila de química orgânica experimental para farmácia – 2013