3.-crescimento-microbiano

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Crescimento Microbiano
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Cultivo e Crescimento de Micro-organimos
Everlon Cid Rigobelo
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Objetivos
• Cultivo laboratorial de Micro-organismos
– Técnica asséptica
• Meios de cultura
• Meios sólidos
• Meios Líquidos
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Objetivos
• Crescimento de micro-organismos
– Crescimento de bactérias
– Crescimento de Fungos
– Multiplicação dos vírus
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Objetivos
• Métodos utilizados para a contagem do
crescimento de micro-organismos
– Contagem em placas
– Contagem em lâmina
– Turbidimetria
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Micro-organismos
Escherichia coli Aspergillus niger 
Bacteriófago 
Fonte: www.hyperscience.com 6
Finalidade de cultivo
• Isolar e identificar
• Testes utilizados:
– Tintoriais, morfológicos, bioquímicos
sorológicos e moleculares
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Morfologia dos Micro-organismos
Vírus animal 
Bactérias do solo 
Micorrizas 
Fonte: www.hyperscience.com 8
Testes de Identificação
Teste Tintorial 
Teste Bioquímico 
Teste Molecular 
Teste Sorológico 
Fonte: www.rehagro.com.br 
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Importância dos micro-organismos
Doenças de Planta 
Álcool e Bebidas Bactericidas 
Produtos Láctios Probióticos
Antibióticos
Fonte: www.brasilescola.com.br
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Cultivo laboratorial de micro-
organismos
• Cultura com um único micro-organismo
– Ausência de contaminantes
– Meios sólidos crescimento das colônias
– Uniformidade das colônias
Cultura Pura
Fonte: www.worldespress.com 11
Cultivo laboratorial de micro-
organismos
• Técnica asséptica
– Meios esterilizados
– Câmara de fluxo laminar
– Uso da chama do bico de Bunsen
Esterilização calor úmido
Fonte: www.worldespress.com
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Técnicas Assépticas
Fluxo Laminar Bico de Bunsen
Fonte: www.worldespress.com
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Cultivo de micro-organismos
• Meios de Cultura
– Soluções nutrientes que promovem o
crescimento microbiano
• Classes de meios de cultura
– Meios definidos e meios complexos
Agar Sangue
Fonte: www.biomedicinamicro.com 14
Meios Definidos
• Quantidades precisas de compostos:
– Orgânicos e inorgânicos
– Fonte de Carbono
– Origem e a concentração da fonte de Carbono
• Depende
– Do micro-organismos cultivado
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Meios Complexos
• Digestos de produtos animais ou vegetais
– Caseína (proteína do leite)
– Carne (extrato de carne)
– Soja (caldo tríptico de soja)
– Células de leveduras (extrato de leveduras)
Agar Trípico Soja
Fonte: www.biomedicinamicro.com 16
Meios Complexos
• Possuem substâncias altamente nutritivas
• Porém impuras
• Comercializados na forma de pó
– Pesados e dissolvidos em água destilada
Agar Seletivo
Fonte: www.biomedicinamicro.com
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Meios Complexos
caseína Extrato de carne
Trípico de soja Extrato de Levedura
Fonte: www.biomedicinamicro.com
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Meios Seletivos
• Inibem seletivamente o crescimento de
micro-organismos
– Presença de compostos
Agar Baird Parker
Fonte: www.pvl.pt
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Meio Diferencial
• Possui um indicador
– Permite a diferenciação de reações químicas
– Específicas que ocorrem durante o crescimento
• Alguns microrganismos realizam:
– Reações particulares outros não
– São úteis na distinção e espécies bacterianas
Agar TSI
Fonte: www.pvl.pt
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Meio Sólido
• Adição de um agente gelificante aos meios
líquidos
• Vantagens
– Imobilizam as células
– Crescem em massas isoladas e visíveis
Agar NI
Fonte: www.mkldiagnostic.com 21
Agar 
Alga da classe Rodophyta
Agar
Agar Mitis Salivarius
Fonte: www.mkldiagnostic.com 22
Crescimento de Bactérias
• Fase elongação
– Podem atingir o dobro do comprimento
• Formação do septo
– Crescimento da membrana plasmática
– Parede celular no interior da célula
• Divisão
– Formam partição que divide a célula em duas
Fonte: www.mkldiagnostic.com
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Fissão Binária
• Geração
• Tempo de geração
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Crescimento de bactérias 
• Culturas de batelada
– Sistema fechado
– Sofre alterações contínuas
– Atividades metabólicas dos micro-organismos
– Alterações drásticas na composição química e
física dos meios de culturas
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Culturas de Batelada
Fermentação Alcoólica
Fonte: www.shared.com
Usina Sucro alcooleira
Fermentação Acoólica
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Ciclo de Crescimento Microbiano
• Fase Lag
– Pouca ou ausência de divisão celular
– Síntese enzimática e de moléculas variadas
– Pode ser curta ou longa dependendo das condições
fisiológicas do inóculo
– Aumento da quantidade de proteínas no peso seco,
e no tamanho celular
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Ciclo de Crescimento Microbiano
• Fase Exponencial
– Crescimento Exponencial das células
– Tempo de geração constante
• Taxa de Crescimento Exponencial
– Número de gerações por Unidade de Tempo
– Será curto ou longo dependendo da
disponibilidades de nutrientes
– Estudos enzimáticos são realizados nesta fase
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Ciclo de Crescimento Microbiano
• Fase Estacionária
– Não se observa crescimento microbiano
– Podem prosseguir o metabolismo energético e
processos biossintéticos
– Consumo de um nutriente essencial
– Acúmulo de um produto de excreção do organismo
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Ciclo de Crescimento Microbiano
• Fase Morte
– Número de células mortas excede o de células
vivas
– A taxa de morte pode ser inferior a taxa de
crescimento exponencial
– A contagem total permanece constante, enquanto
que a taxa de células viáveis cai lentamente
– Pode ocorrer lise celular
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Cultura contínua: quimiostato
• Culturas são mantidas constantes
– Longo período de tempo
– Sistema aberto
– Mantém um volume constante
– Adicionado um meio de cultura fresco a uma taxa
constante
– Remove-se o mesmo volume de meio usado
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Cultura contínua: quimiostato
• Cultura contínua
– Sistema em equilíbrio
• O volume do quimiostato
– Número de células e a quantidade de nutrientes
– Permanecem constantes
Fonte: www.podcastmicro.com
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Quimiostato
• Permite o controle
– Taxa de crescimento populacional da cultura
– Densidade populacional da cultura
• Fatores importantes para esse controle
– Taxa de diluição
– Concentração de um nutriente limitante C - N
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Crescimento em Fungos
– Crescimento e disseminação de filamentos de
hifas
– Produção assexuada de esporos
– Produção esporos sexuais
– Simples divisão celular - brotamento
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Micorrizas
Fonte: www.infoescola.com
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Crescimento de vírus
• Vírus
– Parasitas obrigatórios
– Crescimento utilizando a maquinaria celular da
célula hospedeira
Fonte: www.infoescola.com
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Multiplicação dos Vírus
• Multiplicação do vírus
– Culturas de células – Hela, Vero, BHK, IBRS2
Células de Fibroblastos
Fonte: www.infoescola.com
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Multiplicação dos Vírus
• Inoculação em ovos embrionados
Fonte: www.infoescola.com
Vias de Inoculação Lesões Virais
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Multiplicação Viral
• Animais de Laboratório
Fonte: www.infoescola.com
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Medidas do Crescimento Microbiano
Contagem de Células Totais
Contagem de Viáveis Verificação da Turbidez
Medidas do Crescimento Microbiano
Diretas Indiretas
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Medidas de Crescimento
• Contagem Direta
– No número de células viáveis
– Alterações na concentração de algum
componente celular
– Proteínas, ácidos nucleicos e peso seco das
próprias células
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Medidas de Crescimento
• Contagem de Células Totais
– Contagem microscópica células
– Amostras secas ou líquidas
• Amostras secas
– Podem ser coradas para aumentar o contraste em
as células e o fundo
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Medidas Diretas do Crescimento 
Microbiano
• Contagem em placas– Contagem das células viáveis
– Cada colônia é originada de uma única bactéria (UFC)
– Inóculo original é sempre homogêneo
– Não existe agregação de células
• Desvantagem: precisa de 24 horas de incubação
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Contagem de Células Viáveis
• Viável – capaz de se dividir
• Contagem do número de células em uma
placa
– Capazes de formar colônias
– Contagem de placa
• Método da semeadura por espalhamento
• Método da semeadura em profundidade
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Método da Semeadura por 
Profundidade
– Volume de 0,1 – 1mL
– Pipetado em uma placa de meio estéril
– Adiciona-se meio de cultura fundido
– Mistura-se com movimentos delicados
• Formação de colônias por toda a placa
– Não somente na superfície do ágar
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Método de Semeadura
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Medidas Diretas do Crescimento 
Microbiano
• Contagem em Lâmina
– Utilização de câmaras de contagem (Neubauer)
– Lâmina quadriculada de área conhecida (grid)
– Lamínula sobre a superfície da lâmina de vidro
Fonte: www.infoescola.com
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Limitações da Contagem 
Microscópica
• Apesar de serem rápidas e simples
• Limitações são:
– Não se distingue células vivas e mortas sem
coloração especial
– Células pequenas são de difícil visualização
– Técnica pouco precisa
– Células móveis precisam ser fixadas
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Método da Semeadura por 
Espalhamento
– Volume de 0,1mL
– Espalhado sobre a superfície do meio sólido com
o auxílio de alça
– Incubação da placa e crescimento
– Contagem do número de colônias
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Contagem por Turbidimetria
• Medição do aumento de componentes
celulares
– Proteínas, DNA e peso seco de uma cultura
• Medidas de turbidez
– Suspensão celular – aspecto turvo
– Quanto maior o número de células – maior a luz
dispersa
– Avaliação da massa total de células proporcional
ao número de células
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Turbidimetria
Fonte: www.infoescola.com
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Número Mais Provável
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Contagem de Vírus
• Placas de Lise
– Inoculação do vírus em culturas celulares
– Contagem de células lisadas
– Cada célula equivale a um vírion
• Teste de Elisa
– Número de ligações entre os vírus e o anticorpo
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Contagem de Vírus em Placas de 
Lise
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Teste de Elisa
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Temperatura e Crescimento 
Microbiano
• Temperatura
– Fator mais importante que afeta o crescimento
microbiano
– Temperaturas muito frias ou muitos quentes os
micro-organismos não são capazes de crescer
– As temperaturas máximas e mínimas refletem a
variação da temperatura média de seus hábitats.
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Classes Térmicas de Micro-
organismos
• Psicrófilos
– Temperaturas baixas
• Mesófilos
– Temperaturas medianas
• Termófilos
– Temperaturas altas
• Hipertermófilos
– Temperaturas muito elevadas
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Fatores que influenciam a atividade 
enzimática
• Temperatura
– Em altas temperaturas, as enzimas sofrem
desnaturação e perdem suas propriedades
catalíticas
– Em baixas temperaturas, a taxa de reação diminui
• pH
– pH no qual a atividade enzimática é máxima é
conhecido como pH ótimo
• Concentração do substrato
– Dentro de limites, a atividade enzimática aumenta
com o aumento da concentração do substrato
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Literatura Consultada
Microbiologia de Brook, Michael T. Madigan,
2010.
Pelczar, Jr., Joseph Michael. Microbiologia,
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Muito Obrigado!
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