Clonagem e Enzimas de Restrição Engenharia Genética

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Clonagem e Enzimas de Restrição
Profa. Thaise Gonçalves de Araújo
Universidade Federal de Uberlândia
Instituto de Genética e Bioquímica
BIOTECNOLOGIA - Marcos Históricos
2.000 a.C. Panificação e bebidas fermentadas são utilizadas por egípcios e gregos
1875 d. C. Pasteur mostra que a fermentação é causada por microrganismos
1880-1910 Surgimento da fermentação industrial (ácido láctico, etanol, vinagre)
1910-1940 Síntese de glicerol, acetona e ácido cítrico, descoberta da penicilina
1940-1950 Antibióticos são produzidos em larga escala por processos fermentativos
1953 Watson e Crick e a estrutura do DNA
1968 Purificação da primeira endonuclease de restrição (HindII)
BIOTECNOLOGIA - Marcos Históricos
1970´s Desenvolvimento das primeiras técnicas de DNA Recombinante
1982 Primeira proteína recombinante no mercado (insulina humana)
1983 Kary Mullis e a PCR
1990´s Primeiros estudos de terapia genética
1990´s Primeiras plantas transgênicas
1996 Primeiro mamífero clonado
2000 Sequenciamento do genoma humano
Enzimas Modificadoras de ácidos nucléicos
Nucleases e Ribonucleases
• Responsáveis pela quebra enzimática de ligações fosfodiéster
Nucleases
• Exonucleásica 5’→3’ e/ou 3’→5’
• Endonucleásica → enzimas de restrição
Ribonucleases
• Endoribonucleásica
• 1968, Paul Arber sugere a existência de enzimas 
existentes em bactérias que atuassem como 
proteção à infecção por fagos
– Essas enzimas cortariam o DNA do fago em sítios 
específicas
– Endonuclease R
• 1968
– Meselson & Yuan: EcoRI
• 1970
– Smith & Kelly: nova endonuclease descoberta em H. 
influenzae -- HindIII
– Confirmação da hipótese de Arber, enzima corta 
DNA exógeno mas não DNA celular
– Descoberta do sítio específico de corte pela enzima 
(AAGCTT)
As Enzimas de Restrição
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
▪ As endonucleases de restrição (tesouras moleculares) são enzimas capazes de clivar o
DNA, reconhecendo sequencias curtas de bases e fazem cortes na dupla hélice do DNA.
▪ Clivam na dupla fita
▪ Reconhecem sequencias específicas
▪Clivam dentro da sequencia ou próximo a ela
▪ Diferentes linhagens bacterianas produzem diferentes enzimas de restrição
▪ 250 tipos diferentes
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Função Natural: proteger o DNA
bacteriano do DNA exógeno
As enzimas de restrição são chamadas de acordo com a 
bactéria que a produziu
1º enzima a ser 
descoberta nesta 
bactéria
RY 13
Exemplo: EcoR I
Escherichia coli
Género
Espécie Linhagem
Ordem de 
descoberta
Tipo I
3 subunidades:
✓ 1 subunidade de restrição (“R”)
✓ 1 subunidade de metilação (“M”)
✓ 1 subunidade de reconhecimento (“S”)
Local de hidrólise não é específico e ocorre a mais de 1000 bp de distância
Hidrólise é sempre num local diferente e necessita de ATP 
Impede o seu uso em engenheira genética
2 subunidades:
✓ 1 subunidade de restrição (“R”)
✓ 1 subunidade de metilação e reconhecimento (“MS”)
Sequência de reconhecimento é assimétrica (5-7 bp)
Dupla cadeia de DNA hemimetilada
Local de hidrólise a mais de 24-26 bp de distância
Hidrólise é sempre num local diferente e necessita de ATP
Impede o seu uso em engenheira genética
Tipo III
Tipo II
Duas enzimas:
✓ 1 enzima de restrição (Endonuclease)
✓Estrutura com 4 folhas β e 1 hélice α
Sequência de reconhecimento é palindrómica 4-8nts
Hidrólise ocorre dentro ou nas extremidades da sequência reconhecida
Não necessita de ATP, apenas Mg2+
Importantes na recombinação genética e na elaboração de 
mapas de restrição (especificidade de corte)
Izosquizômeros
Diferentes enzimas de restrição que possuem a mesma
sequência de reconhecimento
Diferem nas condições ótimas de reação, na estabilidade
Enzimas de 
restrição
Sequência de 
reconhecimento
SacI
GAGCTC
CTCGAG
SstI
GAGCTC
CTCGAG
Exemplo:
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
▪ Cada enzima reconhece apenas um tipo de sequencia – seq. palindrômicas
▪ Algumas cortam a molécula produzindo pontas retas (cegas) (Ex.1), enquanto que
outras cortam entre as mesmas bases, mas fora do ponto de simetria, produzindo
pontas desiguais ou coesivas (Ex. 2).
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
▪ As enzimas de restrição do tipo coesivas são utilizadas para clonagem, devido à
facilidade de ligação dos fragmentos por e elas gerados.
▪ Algumas enzimas de restrição reconhecem sítios raros no genoma e são bastante
utilizadas para detecção de mutações.
▪ No caso de detecção de mutações de ponto, utiliza-se uma enzima que seu padrão de
corte é alterado pela mutação, isto é, um sítio de restrição é criado ou abolido para
determinada enzima.
Enzimas de Restrição
▪ Os fragmentos contendo pontas
adesivas, podem se ligar a outras
pontas de moléculas de DNA que
tenham sido cortadas com a
mesma enzima.
▪ Em Engenharia Genética, a
obtenção dos fragmentos de DNA
serve para criar, in vitro, novas
moléculas (DNA recombinante),
recortando e colando vários
pedaços de informações.
“digerem as ligações 
fosfodiéster” 
▪ As sequencias reconhecidas por uma enzima de restrição estão situadas
aleatoriamente dentro do genoma. Consequentemente há uma relação entre o
tamanho da sequencia de reconhecimento e o número de vezes que ela está presente
no genoma.
Exercício 3
▪Uma molécula de DNA bifilamentar tem 5 milhões de pares de bases com uma
composição de 62% G+C. Quantas vezes em média o sítio GGATCC estará presente nessa
molécula?
▪A enzima de restrição HindIII corta o DNA na sequencia AAGCTT. Na média com que
frequencia a enzima corta o DNA bifilamentar?
Ensaio de digestão
• Adicione DNA + tampão + 
endonuclease de restrição
• Deixe digerindo num banho a 
determinada temperatura por 
determinado tempo
• 1 unidade de enzima de restrição 
digere 1 μg DNA em 1h00
Factores que influenciam a atividade das enzimas de restrição:
Digestão com múltiplas enzimas
Composição do tampão
✓ Diferem na força iónica (concentração de sal)
✓ Solução: Manter o pH da reacção (geralmente em 8.0)
Influência da metilação no DNA
✓ Existe algumas endonucleases de restrição que não clivam DNA metilado
Temperatura de incubação
✓ A maioria das enzimas cliva melhor a 37ºC
✓ Excepções: Bactérias termofílicas – clivam melhor entre 50 a 60ºC
Enzimas com tempo de meia vida pequeno a 37ºC, recomenda-se a 
incubação a 20ºC
▪ Quando a concentração da enzima é superior a 5% (v/v) ou quando se usa uma
relação “enzima/mg de DNA” muito alta, a enzima pode reconhecer sítios inespecíficos.
▪ Os diversos componentes da reação devem ser mantidos no gelo até a hora do uso,
com exceção da enzima que é mantida a -20°C.
▪ Algumas enzimas requerem temperatura de incubação acima de 50°C. Em alguns
casos recomenda-se a adição de óleo.
▪BSA deve ser adicionado em digestões longas
▪Nas digestões duplas
▪1. Tampão com menos sal
▪2. Outra enzima
Parâmetro Recomendação
Volume final da reação Até 100 μL
Concentração de DNA 0,1 a 10 μg
Concentração da enzima 1 a 5U/μg DNA
Tri-HCl; pH 7,5 20 a 50 mM
MgCl2 5 a 10 mM
Β-mercaptoetanol 5 a 10 mM
BSA 50 a 100 μg/mL 
Glicerol <5% (v/v)
NaCl Como requerido na enzima
Temperatura Como requerido na enzima
Tempor de incubação Como requerido na enzima
Mapas de Restrição
✓ As unidades do mapa são expressadas em pares de bases ou para 
distâncias mais longas em pares de kilobases
É uma compilação do número, da ordem e da distância entre locais do
corte do enzima de restrição ao longo de um segmento clonado do DNA
Normalmente, o mapeamento é a primeira etapa para caracterizar um
DNA desconhecido e um pré-requisito a manipulá-lo para outras
finalidades.
✓ O DNA encontra-se, geralmente, dentro de um vector bem caracterizado do 
plasmídeo ou do bacteriófago, onde a sequência é conhecida
Elaboração de Mapas de Restrição
Existem dois métodos para elaborar um mapa de restrição:
✓mapeamento utilizando digestões múltiplas
✓mapeamento utilizando digestões parciais
Construção de mapas de restrição com hidrólises múltiplas:
✓ Hidrólise do DNA:
❖ separadamente com hidrólises simples
❖ e com pares de enzima
✓ Aplicar uma electroforeseem gel para os fragmentos obtidos
(Permite a separação dos fragmentos gerados de diferentes tamanhos!!!)
Elaboração de Mapas de Restrição
0.5
1.0
2.5
5.0
8.0
10.0
7.0
6.2
5.8 5.8
0.8
1.2
0.8
0.4
0.8
0.8
1.2
5.8
7.0
7.0
0.8 0.4 5.8
0.8 5.0 1.2
Modelo I
Modelo II
HindIII SalI
HindIII SalI
Mapas de Restrição
Digestão Parcial
Digestão parcial surge em condições não ótimas para que ocorram um 
número limitado de hidrólises:
✓ período de incubação pequeno
✓ incubação a baixas temperaturas
Pode ser parcialmente digerido com enzimas de restrição produzindo
fragmentos marcados de tamanhos diferentes mas que revelam diretamente
onde são os locais de clivagem
Elaboração de Mapas de Restrição
Enzimas Nº de fragmentos Tamanho / kd
XbaI 2 24.0, 24.5
XhoI 2 15.0, 33.5
KpnI 3 1.5, 17.0, 30.0
XbaI + XhoI 3 9.0, 15.0, 24.5
XbaI + KpnI 4 1.5, 6.0, 17.0, 24.0
É linear
Tamanho do fragmento: 48.5 kd
Nº de sítios restrições de:
✓ XbaI – 1
✓ KpnI – 2
✓ XhoI – 1
Elaboração de Mapas de Restrição
XbaI 24.0, 24.5
XhoI 15.0, 33.5
XbaI + XhoI 9.0, 15.0, 24.5
48.524.0 24.5
XbaI
9.0 15.09.015.0
Todos os locais de restrição do KpnI caem no fragmento da XbaI 24.5 kb, uma vez 
que o fragmento 24.0 kb continua intacto após a digestão dupla do XbaI-KpnI
A ordem dos fragmentos do KpnI só pode ser determinado pela digestão parcial
XhoI XhoI
Elaboração de Mapas de Restrição
Os fragmentos 1.5, 17.0 e 30.0kd são produtos da digestão completa
Os fragmentos 18.5 e 31.5kd são produtos da digestão parcial
48.524.5
XbaI
9.015.0
XhoI
6.0
KpnI
18.517.0 1.517.01.5
KpnI’s
Enzima Tamanho / kd
KpnI – digestão parcial 1.5, 17.0, 18.5, 30.0, 31.5, 48.5
XbaI + KpnI 1.5, 6.0, 17.0, 24.0
Elaboração de Mapas de Restrição
EcoRI BamHI HindIII HaeII
EcoRI + 
HaeII
BamHI + 
HaeII
HindIII + 
HaeII
EcoRI + 
HindIII
EcoRI + 
BamHI
BamHI + 
HindIII
12.0 12.0 12.0 6.0
4.0
2.0
5.0
4.0
2.0
1.0
6.0
4.0
1.5
0.5
6.0
2.5
2.0
1.5
6.5
5.5
10.5
1.5
8.0
4.0
12.0kd
HaeII (6.0)
HaeII(
10.0)
HaeII (0/12.0)
EcoRI 
(1.0)
BamHI 
(11.5)
HindIII 
(7.5)
É circular
Tamanho: 12.0kb
▪ Um fragmento de DNA de camundongo com pontas adesivas de EcoRI porta o gene M.
Este fragmento de DNA que tem 8kb de tamanho é inserido em um plasmídeo
bacteriano. Esse plasmídeo recombinante é cortado com 3 tratamentos diferentes de
enzimas de restrição.
▪EcoRI : fragmentos de 8kb e 6kb
▪BamHI: 5,5kb, 4,5kb e 4,0 kb
▪EcoRI + BamHI: 4,0kb+ 3,5kb+ 3,0kb+ 2,5kb+ 1,0kb
Construa o mapa de restrição
A importância dos polimorfismos
Profa. Thaise Gonçalves de Araújo
Universidade Federal de Uberlândia
Instituto de Genética e Bioquímica
POLIMORFISMOS GENÉTICOS
▪ Variações nas seqüências de DNA que
ocorrem na população geral de forma estável
▪ Freqüência de 1% ou superior (1 a cada 1.250
pb)
▪ Deleções, mutações, substituições de base
única (SNP - 90%) ou variações no número de
seqüências repetidas
▪ Podem afetar a seqüência de aminoácidos da
proteína e alterar a função da mesma
▪ Podem alterar a expressão e/ou a atividade
de sítios de ligação de medicamentos
Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de 
Restrição (PCR – RFLP)
Fragmento Amplificado pela PCR de 400 pb
300 pb 100 pb
Sítio de Reconhecimento de 
Enzimas de Restrição
GAATTC
Normal
GAATTT
Mutante
Eletroforese e Detecção
400
300
200
100
M CC CT TT
A enzima não 
reconhece o sítio 
– não corta –
CAGAGCATGGACAGGGAGCAAGGCCAGGCAGGGACAGGGCCAGGTGCGCCCATGGA
AGGACCTAGGTCTGGATCCTAAATGCACGGAGAAGTCACTGGAGGGCTTTGGGGCCAG
GCAGTGGTATCACCGGTCAGCAGTCATAGAGGGGTGGCCTAGGGGGTGCTGCCGTTGA
GTGTCTGTGTGGGTGGGGGGTGGTGGGATTGAGCAGTGAGGGGCCCAGCTGAGAGCT
CCTGTGCCTTCTTCTCTATCCCCGTGCCCACAGATCGTCCTGGGGTGCAGGACGCCGCGC
TGATTGAGGCCATCCAGGACCGCCTGTCCAACACACTGCAGACGTACATCCGCTGCCGC
CACC
Mutação: T→C (AY342404)
Posição: 61968
Enzima: 5’-T*CGA-3’
Indivíduo TT: TT 
Indivíduo tt: CC
Alelo T: 352pb
Alelo t: 293pb
Posição: 61968
Enzima: 5’-T*CGA-3’
352 pb 
352 pb  293pb
Investigação de Vínculo Genético - PCR-RFLP
• Nos exames de paternidade, aplicando-
se a eletroforese em fragmentos de DNA,
obtidos por ação de enzimas de restrição
em amostras sanguíneas dos entes
envolvidos: mãe (M), filhos (F1, F2, F3 e
F4) e o suposto pai (SP).
• A herança das bandas presentes nos
filhos e ausentes na mãe, somente pode
ter sido transferidos aos filhos pelo pai.
• No caso, constata-se a contribuição
genética do suposto pai, indicada por
círculos vermelhos.
LIS-SSCP
• Descrito por Maruya et al. (1996)
• Baseado na mobilidade
eletroforética dos ác. nucléicos 
descobre mutações de ponto em
uma variedade de posições, em
fragmentos de DNA
•Eficiência: < 200 pb (100%)
> 400 pb (<50%)
Homozigoto A Heterozigoto Homozigoto B
Desnaturação à 97° C por 10 min.
Eletroforese em gel poliacrilamida
O que, então, era possível fazer?
• Era possível pegar o DNA de 
qualquer espécie, picotá-lo e inseri-
lo em uma bactéria que o 
amplificaria milhões de vezes
• A era da engenharia e da 
manipulação genética tem início...
• Mas o que se pode fazer? Até onde 
podemos chegar?
– Verdade seja dita: ninguém sabe ao 
certo...