Biologia Molecular Unidade 1

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Biologia Molecular
Unidade I
A Biologia Molecular é uma área da ciência que estuda os aspectos genéticos das células dos seres vivos, abordando desde a estrutura básica do DNA com todos os seus componentes até o desenvolvimento de alterações e doenças associadas. O conhecimento acerca desse assunto vai facilitar a sua assimilação a respeito do modo como algumas doenças se desenvolvem, dos diagnósticos delas e do direcionamento de alguns tratamentos. Sabemos que diversos diagnósticos são realizados utilizando o material genético, portanto, o conteúdo desta disciplina poderá ser aplicado tanto no diagnóstico de doenças infecciosas e na terapia gênica, bem como na compreensão dos aspectos farmacogenéticos para o tratamento de doenças. 
Genética Molecular
O interesse humano em compreender tanto os mecanismos envolvidos com a ampla variabilidade fenotípica distribuída entre as espécies quanto a maneira como essas informações são passadas para as gerações posteriores é antigo, sabia?
Pois é, foram nas pesquisas idealizadas por Gregor Mendel (1822 – 1884) que surgiram os primeiros esboços sobre os mecanismos relacionados à hereditariedade, os quais futuramente seriam considerados a base para o estudo da Genética. Entretanto, apenas no início da década de 70 houve uma série de novas descobertas, que permitiram um avanço rápido e significativo na área da Biologia Molecular, que trouxe como consequência o surgimento do estudo da Engenharia Genética, caracterizada pela manipulação do DNA a nível molecular.
De forma geral, a Engenharia Genética pode ser resumida a um conjunto de métodos e técnicas que podem ser aplicados para diversas finalidades e que possuem como mecanismo de ação a fragmentação de uma molécula de DNA, que serve para a futura análise de um gene específico. 
Nesse sentido, as principais descobertas que favoreceram a evolução teórica/prática da Engenharia Genética foram: 
· Enzimas de restrição: Também podem ser chamadas de endonucleases de restrição e possuem como mecanismo de ação o reconhecimento de uma sequência de nucleotídeos específica de uma molécula de DNA, promovendo a clivagem (hidrólise) dessa sequência. 
· DNA ligase: Como o próprio nome sugere, essas enzimas possuem a função de ligar fragmentos da molécula de DNA que possuem terminações complementares. 
· Plasmídeos; São fragmentos circulares de DNA extracromossomial, que podem ser utilizados como carreadores de material genético entre diferentes organismos. 
O uso dessas estruturas permitiu a criação de organismos geneticamente modificados (transgênicos), designados como organismos que foram submetidos a modificações genéticas, visando o favorecimento de uma característica específica de interesse e sendo amplamente utilizado na indústria alimentícia. A nível laboratorial, houve uma evolução significativa no desenvolvimento de kits voltados ao diagnóstico de doenças infecciosas.
Para saber mais a respeito da Genética Molecular, convidamos você a assistir ao vídeo baixo, que aborda sobre esta área de estudo e seus impactos no futuro da saúde pública e na sociedade:
Estrutura e composição dos ácidos nucleicos 
Com base no que tratamos aqui, é importante situar você sobre o foco dos estudos da área de genética molecular: os dois tipos de ácidos nucleicos que podem estar presentes nos organismos, o DNA e o RNA, que, de forma geral, são os responsáveis pelo transporte e pelo armazenamento das informações genéticas. Ambos apresentam similaridades em relação a sua estrutura química, já que são formados por um componente comum, os nucleotídeos. Estes, são formados basicamente por três componentes, uma pentose (açúcar que possui cinco carbonos), que assume uma posição central, para que um grupo fosfato e uma base nitrogenada possam se ligar a um dos carbonos de sua estrutura. As bases nitrogenadas, vale dizer, são formadas por uma estrutura anelar de carbono e nitrogênio e, como tendem a se ligar entre si em determinadas ocasiões, são consideradas as estruturas de maior variabilidade dos nucleotídeos. 
Ainda, as bases nitrogenadas podem ser divididas em dois grupos: 
· As purinas, que representam o grupo caracterizado por possuir dois anéis de carbono e nitrogênio, sendo composto pelas bases adenina (A) e guanina (G), 
· As pirimidinas, que são menores, por possuir apenas um anel de carbono e nitrogênio, sendo composto pelas bases timina (T), citosina (C) e uracila (U). O DNA possui A, G, C e T, e o RNA contém U ao invés de T, apresentando A, G, C e U na sua composição.
Para o estudo da composição do DNA e RNA, é essencial o entendimento de dois tipos de interações estruturais que ocorrem na molécula, as ligações fosfodiéster e as ligações de hidrogênio. 
 
As fosfodiéster são responsáveis pelas ligações entre os nucleotídeos, gerando polinucleotídeos e conferindo às cadeias de ácidos nucleicos linearidade e direcionalidade. Assim, as cadeias possuem uma extremidade diferente da outra, que representam o início e o fim da cadeia.  
Essa interação ocorre entre o grupamento fosfato, que está ligado ao carbono 5’ da pentose de um nucleotídeo, com o grupamento hidroxila, ligado ao carbono 3’ da pentose do nucleotídeo adjacente. Quando a ligação acontece, o primeiro e o último nucleotídeo da cadeia apresentam respectivamente um grupamento fosfato (5’) e um grupamento hidroxila (3’) livres e, por isso, é dito que a síntese dos ácidos nucleicos acontece no sentido 5’ – 3’. O DNA possui duas cadeias de nucleotídeos distintas que se ligam entre si e caracterizam uma conformação em dupla hélice. Para entender como ocorre essa ligação, primeiramente é importante compreender que as duas cadeias possuem direções opostas, ou seja, o início de uma cadeia (extremidade 5’) vai estar pareado com o final da outra cadeia (extremidade 3’), representando uma orientação antiparalela entre as duas. A ligação propriamente dita acontece pela interação entre as bases nitrogenadas das duas cadeias, por meio de ligações de hidrogênio. Por razões de tamanho, formato e composição química, a ligação não ocorre aleatoriamente entre os diferentes tipos de bases nitrogenadas, e o que se observa é a interação entre adenina (A) e timina (T), por duas ligações de hidrogênio, e entre citosina (C) e guanina (G), por três ligações de hidrogênio. Resumidamente, a estrutura do DNA é composta por uma parte externa, formada por polinucleotídeos e mantida por ligações fosfodiéster, e uma parte interna, formada por bases nitrogenadas mantidas por ligações de hidrogênio, contribuindo para a manutenção da estrutura de dupla hélice. O RNA é uma molécula que possui uma estabilidade química inferior ao DNA, normalmente é formada apenas por uma fita simples e, por isso, não forma ligações de hidrogênio com outra cadeia de nucleotídeos, exceto nos casos em que existe a possibilidade de um dobramento estrutural sobre si própria, para formar algumas regiões de dupla hélice. 
Propriedades do ácido desoxirribonucleico (DNA) 
Como você entende o DNA? 
Podemos dizer que o ácido desoxirribonucleico (DNA) é a molécula responsável pelo armazenamento das informações genéticas, que conduzem a estrutura biológica de uma espécie específica e coordenam as funções celulares. Como já foi visto, a estrutura do DNA é formada por nucleotídeos, que contém uma pentose denominada desoxirribose e possuem adenina, timina, citosina ou guanina como possibilidades de bases nitrogenadas ligadas a si. A estrutura final é caracterizada pela ligação entre duas cadeias distintas, que giram em torno do próprio eixo, contribuindo para a formação da dupla hélice. Durante alguns estudos conduzidos sobre o funcionamento do DNA, foram estabelecidas algumas propriedades funcionais dessa molécula, que são essenciais para a evolução e a manutenção fisiológica de um organismo. Dentre elas, podemos citar: 
Estrutura diversificada: apesar de possuir apenas quatro tipos de bases nitrogenadas, essas estruturas podem se organizar em diferentes sequências específicas e ordenadas, que passam a constituir um gene. Os genes,por sua vez, podem apresentar entre si tanto variação de tamanho quanto variação nas combinações de bases utilizadas para formação de uma sequência. Nesse contexto, os genes são codificados com o objetivo de produzir um produto funcional biológico, que na maioria das vezes trata-se de uma proteína, que são moléculas primárias que podem assumir diversas funções. A obtenção de proteínas por meio da codificação de um gene é feita a partir da realização de transcrição e tradução do DNA, funções que serão comentadas posteriormente. 
Habilidade de replicação: a replicação é um processo que precede a divisão celular e tem como objetivo duplicar o conteúdo de DNA de uma célula para dividir o material entre as células-filhas, garantindo que ocorra a preservação da informação genética.
Mutabilidade: durante a replicação, podem ocorrer erros que levam a alterações estruturais e falhas na organização sequencial das bases nitrogenadas dos genes, caracterizando uma mutação. As mutações ocorrem frequentemente no DNA, mas a maioria delas não apresenta efeitos adversos significativos em relação à função das moléculas codificadas. E quando ocorre uma mutação, existe a possibilidade de se realizar uma replicação de uma cópia de DNA diferente da original, que passa a ser transmitida para as células descendentes. 
Realizar transcrição e tradução: são etapas relacionadas com a expressão e codificação do gene para a produção de uma molécula específica. Para a realização de todas as etapas que envolvem essas duas fases, ocorre a participação de diversas moléculas assessórias que atuam diretamente no DNA. 
Propriedades do ácido ribonucleico (RNA) 
Já o ácido ribonucleico (RNA) é uma molécula que está diretamente relacionada com a regulação gênica e a produção de proteínas, sabia? 
 Bem, assim como o DNA, o RNA possui uma estrutura formada por nucleotídeos, porém, a pentose do RNA é chamada de ribose, a diferença dessa para com a desoxirribose é apenas em relação ao grupamento que está ligado ao carbono 2’. Enquanto a ribose possui uma hidroxila, a desoxirribose possui um hidrogênio. 
 Mais do que isso, sabe-se que as bases nitrogenadas disponíveis para o RNA são diferentes, apresentando adenina, guanina, citosina e uracila. Dessa maneira, a estrutura final é geralmente caracterizada como uma cadeia simples de polinucleotídeos com as bases nitrogenadas ligadas a si. 
Observe, na Figura 3, as diferenças estruturais entre o RNA e o DNA. 
Existem basicamente três tipos de moléculas de RNA, que desempenham funções distintas, são elas:
RNA mensageiro (RNAm): É o produto obtido após a transcrição do DNA. Mantém a característica de fita simples e possui a função de carregar uma informação específica do código genético do DNA para os ribossomos, para que estes possam realizar a síntese das proteínas.
RNA ribossômico (RNAr): É um componente dos ribossomos que atua no reconhecimento da sequência de informações do RNAm. Alguns RNAr possuem atividade enzimática, ou seja, podem catalisar as reações químicas envolvidas com a síntese de proteínas, recebendo o nome de ribozimas. 
RNA transportador (RNAt): É responsável pelo transporte dos aminoácidos até os ribossomos para que sejam utilizados na formação das proteínas. É necessário que os aminoácidos transportados sejam aqueles especificados pela sequência do RNAm. 
O dogma central da Biologia 
Dogma central é um termo utilizado para referenciar a sequência de eventos a qual a informação genética é submetida, mostrando como o DNA é capaz de produzir proteínas. As etapas do dogma central se iniciam com a utilização do DNA para a produção de uma molécula de RNA mensageiro, num processo denominado transcrição. Após essa transcrição, o RNA obtido contém as informações necessárias para a codificação dos aminoácidos que são utilizados para formar as proteínas, caracterizando, assim, a etapa de tradução. Essa teoria do dogma central já sofreu algumas atualizações, após a descoberta de que algumas espécies virais possuem a capacidade de converter uma molécula de RNA em DNA, num processo conhecido como transcrição reversa. 
 Observe a esquematização do dogma central na Figura 4.
Agora, tomando essa discussão por base, vamos às etapas do dogma central?
Replicação de DNA  
A replicação do DNA é uma etapa essencial para a transmissão do material genético após a divisão celular, garantindo que as células-filhas possuam ao final do processo a mesma quantidade de material genético. Ela acontece seguindo um modelo semiconservativo, o que significa, em outras palavras, que cada fita da dupla hélice de uma molécula de DNA já existente (parentais) vai servir como modelo para a síntese de duas novas fitas duplas, formadas por uma fita recém-sintetizada e outra que foi preservada das fitas parentais. 
O início dessa etapa se dá pela separação das fitas parentais de DNA, que resulta na formação de uma região chamada forquilha de replicação, onde estão presentes as enzimas que participam do processo. A separação das fitas parentais, por sua vez, é feita por uma enzima chamada DNA helicase, que atua desfazendo as ligações de hidrogênios que formam os pares de base, permitindo que cada uma das fitas simples de DNA formadas tenham as bases nitrogenadas livres para ligações posteriores. Dessa maneira, atuando junto a helicase durante a abertura das fitas, a DNA topoisomerase diminui a tensão geral atribuída às torções excessivas da dupla hélice. Após a separação, uma enzima chamada primase (um tipo de RNA-polimerase) produz uma pequena fita complementar de RNA, chamada primer, nas duas fitas simples de DNA que foram formadas. A DNA polimerase, nesse caso, como enzima responsável pela adição de novos nucleotídeos nas fitas, tem o seu desempenho dependente da efetividade das enzimas citadas anteriormente. Assim, a helicase e a topoisomerase criam condições favoráveis, que facilitam a movimentação da polimerase ao longo da fita, e o primer, inserido pela primase, atua como uma fita iniciadora, suprindo a falta de capacidade da polimerase em produzir uma nova sequência do início, passando a expandir a cadeia a partir do primer. Como mencionado antes, as duas cadeias que compõe uma molécula de DNA estão dispostas em uma orientação antiparalela, e essa característica promove uma interferência durante o processo de separação da dupla hélice. Nessa disposição, a polimerase só consegue adicionar os nucleotídeos quando segue a direção 5’ – 3’, porém, durante a separação das fitas antiparalelas do DNA, ocorre a formação de duas fitas simples distintas, uma fita líder (leading strand) que possui sentido 5’ – 3’, que segue a mesma direção da forquilha de replicação, e uma fita descontínua (lagging strand) que possui sentido 3’ – 5’, direção oposta a forquilha. É importante dizer que a síntese da fita líder acontece continuamente a partir de um único primer na extremidade 5’, enquanto a síntese da fita descontínua exige um procedimento mais complexo, que envolve a participação de múltiplos primers, adicionados regularmente à medida que ocorre a separação da fita parental, que juntos formam uma sequência descontínua que segue na direção 5’ – 3’. Cada primer associado à sua fita-molde é chamado de fragmento de Okazaki, e esse, posteriormente, tem a sequência de primer retiradas, e, ainda nesse processo, sabe-se que as cadeias de DNA remanescentes são ligadas por uma enzima chamada DNA ligase. 
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja:
· DNA polymerase = DNA polimerase.
· RNA primer = RNA iniciador.
· Single strand binding protein = Proteína de ligação de fita simples.
· Sliding clamp = Grampo deslizante. 
· Okazaki fragments = Fragmentos de Okazaki.
· Lagging strad = Fita atrasada.
· Leading strad = Fita líder.
Transcrição de DNA 
Já a transcrição do DNA é a etapa caracterizada pelo uso do DNA para a produção de RNA mensageiro (RNAm). A RNA polimerase é a enzima que, com outros fatores, atua em diversas funções noprocesso de transcrição, como o reconhecimento e a ligação a uma região específica do DNA (região que vai ser transcrita), que passa a ser chamada de promotor. Após a ligação, essa enzima promove ao redor do promotor a dissociação dos pares de base do DNA, formando uma estrutura chamada bolha de transcrição (Figura 7), que facilita o acesso à região molde do DNA necessária para o início da transcrição. Os nucleotídeos da fita de RNA são complementares a sequência do promotor e após o pareamento entre ambas, os outros nucleotídeos vão sendo adicionados pela RNA polimerase no sentido 5’ – 3’ num processo denominado alongamento da cadeia. O RNA mensageiro que foi transcrito apresenta as bases nitrogenadas complementares ao molde de DNA, exceto pela troca da timina por uracila. Assim, após o reconhecimento da sequência finalizadora, a RNA polimerase reconhece o término do transcrito e se dissocia tanto do RNA transcrito, como da sequência molde (DNA). 
Após a finalização do processo de transcrição, a cadeia de RNA, que foi transcrita, é considerada um pré-RNAm, que deve ser submetida a alguns processos, para que venha a se tornar um RNAm maduro e funcional. 
 Nesse sentido, o processamento do pré-RNAm também envolve algumas etapas, que se inicia pela adição de diferentes grupos químicos em cada extremidade da fita. Na extremidade inicial 5’ de um pré-RNAm recém-formado, um grupo enzimático sintetiza e adiciona uma guanina modificada, que passa a se chamar cap 5’, ao passo que na extremidade terminal 3’ a enzima poli (A) polimerase adiciona uma sequência de bases adenina, que formam uma estrutura chamada cauda poli (A). As duas estruturas promovem a proteção do RNAm contra atividades enzimáticas e auxiliam no seu transporte até o citoplasma. 
Observe o processo de Splicing na figura abaixo.
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja:
· Primary RNA transcript = Transcrição de RNA primário.
· RNA processing = Processamento do RNA.
· Spliced RNA = RNA após maturação. 
· UNTRANSLATED REGION = Região não traduzida. 
Quando o pré-RNAm é formado, a sua estrutura é composta por dois tipos de regiões: 
· os éxons, que correspondem as regiões codificadoras de proteínas;
· e os íntrons, que representam as regiões não codificadoras.
Para o andamento da maturação, o pré-RNAm é submetido a um processo chamado splicing de RNA, que consiste na remoção das regiões não codificadoras (íntrons), para posterior união das regiões codificadoras (éxons) remanescentes. Os eventos do splicing são mediados por um complexo de proteínas de RNA, chamado de spliceossomos. Nele, as proteínas se ligam primeiramente a sequências potencializadoras de splicing, que estão localizadas nos éxons, para que ocorra o recrutamento de outras proteínas que se ligam a dois pontos distintos do íntron, uma região chamada Branch site e outra localizada próxima a região 3’. Após a ligação em ambas as regiões, as proteínas se unem formando o complexo spliceossomos, que atua removendo as extremidades do íntron e fundindo os éxons, obtendo, ao final, um RNAm maduro. 
 Observe o processo de splicing de RNA na figura abaixo.
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja:
· pre-mRNA = pré-RNAm
· Spliced mRNA = RNAm após splicing
Além disso 1. o 2'OH de um nucleotídeo dentro do intron, sendo este definido durante a montagem do spliceossomo, executa um ataque nucleofílico no primeiro nucleotídeo do intron, consideramos como o local do splice, formando o laço 2. 3'OH do exon 5' promove um ataque eletrofílico no primeiro nucleotídeo juntando-se assim aos exons e liberando o laço do íntrons, promovendo a remoção dessas regiões.
Tradução de RNA 
A tradução do RNA, por seu turno, é um processo que envolve a decodificação e o uso das informações genéticas presentes em um RNAm para a produção de proteínas. Esse processo envolve a participação cooperativa de três tipos diferentes de RNA: o RNA mensageiro (RNAm), o RNA transportador (RNAt) e o RNA ribossômico (RNAr). O início da tradução é caracterizado pela formação de um complexo formado a partir da interação entre três componentes, o RNAm que possui as instruções necessárias para a codificação de uma proteína específica, que é envolvido por um ribossomo que possui duas partes, uma grande e uma pequena, e o RNAt (Figura 10).
A leitura do RNAm é feita por códon (sequência de três nucleotídeos), onde cada códon representa um aminoácido específico que vai compor a estrutura da proteína codificada, e se inicia quando o RNAt associado a subunidade pequena do ribossomo se liga ao início da extremidade do RNAm e migra ao longo da cadeia até encontrar o códon de iniciação, que na maioria dos casos corresponde a sequência específica da metionina (AUG). 
 Após isso, a subunidade grande do ribossomo se associa, formando o complexo de iniciação. Uma vez formado o complexo, é preciso entender alguns pontos relacionados a sua estrutura: 
· Primeiramente, o RNAt é formado por uma sequência de três nucleotídeos, que são complementares a sequência dos códons e, por isso, são chamados de anticódons;
· O outro ponto é a existência de três compartimentos no ribossomo (E, P e A), responsáveis por auxiliar a ligação do RNAt ao RNAm e conduzir a movimentação do RNAt ao longo do complexo.
No início da tradução, o RNAt que transporta a metionina está localizado no compartimento P, e para dar continuidade ao processo, precisa que o códon que está exposto no compartimento A seja preenchido por outro RNAt correspondente. Com o complemento simultâneo dos dois compartimentos (P e A), o RNAr catalisa uma reação peptiltransferase, que resulta na ligação peptídica entre o aminoácido associado ao RNAt do compartimento P, que é transferido para o aminoácido ligado ao RNAt do compartimento A.  
Depois da ligação entre os aminoácidos, o RNAm é deslocado, de forma que o RNAt que não apresenta mais o aminoácido associado seja expulso através do compartimento E, enquanto o RNAt que agora possui dois aminoácidos associados seja transferido para o compartimento P, deixando um novo códon exposto no compartimento A, para que o processo seja repetido. A fase de alongamento é caracterizada pelo aumento do tamanho da proteína, a partir da junção de todos os aminoácidos instruídos pelo RNAm. (Figuras 10). 
O fim da tradução ocorre pelo reconhecimento de códons de parada, que não apresentam uma sequência relacionada à especificação de um aminoácido, mas promove a sinalização necessária para a separação e a liberação da proteína sintetizada. 
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja:
· Amino acid = Aminoácido.
· tRNA= RNAt.
· Large ribossomal subunit = Grande subunidade ribossomal.
· Small ribossomal subinit= Pequena subunidade ribossomal.
· EUKARYOTIC.... = Iniciação da tradução. 
· Star códon = Códon iniciador.
· tRNA= RNAt.
· Initiation complex = Complexo iniciador.
· Complex of small subunit ........ (1) = Complexo da pequena subunidade ribossomal e iniciador RNA se liga a região 5'. 
· Complex scan.... (2) = O complexo verifica para procurar o códon iniciador.
· Initiator tRNA binds... (3) = O iniciador RNAt se liga ao códon iniciador.
· Large ribossomal subunit joins... (4) = A grande subunidade ribossomal se une para formar o complexo iniciador.
· First round of elongation = Primeira etapa de alongamento.
· Anticodon= Anti-códon.
· mRNA = RNAm.
· Methionine = Metionina.
· Ribosome = Ribossomo.
· Next amino acid = Próximo aminoácido.
· tRNA binds to matching codon = RNAt se liga ao códon correspondente.
· New peptide bond = Nova ligação peptídica.
· mRNA shifts forward by a codon = RNAm se desloca para frente. 
Mutação Genética
E, nesse cenário, o que são as mutações gênicas?
 Como o próprio nome sugere, são alterações em regiões gênicas, mais precisamente nas bases nitrogenadas de DNA, criando uma modificação no gene original, que interfere de maneira direta na síntese de proteínas. Alémdisso, elas são responsáveis pela variabilidade genética que colabora com a evolução das espécies. Porém, é necessário mencionar, a viabilidade do material genético dessas espécies depende do equilíbrio funcional entre dois processos antagônicos: o reparo de DNA, responsável por conservar a molécula, e as próprias mutações, que geram as mudanças. 
Diante disso, as mutações podem ser classificadas como:
· Cromossômicas: Quando estão relacionadas a modificações quantitativas ou estruturais dos cromossomos; 
· Gênicas:Quando causam alterações nos pares de bases ou em extensas regiões do DNA.
Aqui, estudaremos as mutações gênicas que alteram números pequenos de pares de base. Os seres humanos são organismos complexos, que apresentam dois tipos básicos de células susceptíveis a desenvolver mutações, as células somáticas e as células germinativas. 
 
As células somáticas abrangem todas as células do organismo, com exceção das células gaméticas masculinas e femininas. A mutação que acontece nesse tipo celular normalmente apresenta o potencial de interferir na funcionalidade celular, e pode apresentar uma evolução branda ou mais significativa. Durante a reprodução, a mutação somática não apresenta a capacidade de ser transmitida para a prole do portador da mutação. 
 Por outro lado, as células da linhagem germinativa podem ser acometidas por mutações, mas, diferentemente da mutação somática, essa pode ser herdada pela prole do portador. As mutações germinativas estão diretamente ligadas com a evolução das espécies, já que o fato de ser transmitida a prole favorece a variabilidade genética.
Mutações espontâneas 
Durante o processo de replicação do DNA, diversos fatores endógenos podem provocar uma mutação espontânea por erros metabólicos, sabia? 
 Esses fatores em geral promovem o estabelecimento de mutações espontâneas pontuais, ou seja, alteram um único par de base da cadeia de DNA, como é o caso das substituições de base ou alterações em um número maior de bases, como acontece na adição ou deleção de base. 
 A DNA polimerase, por exemplo, está sujeita a incorporar erroneamente uma base nitrogenada na sequência de DNA durante o processo de replicação, podendo ser causado por um deslize de movimentação da enzima ao longo da fita, ou induzida por modificações tautoméricas das bases nitrogenadas. 
As modificações tautoméricas são caracterizadas como flutuações químicas ocasionadas pela mudança na posição dos átomos de hidrogênio que compõe a estrutura da base, comprometendo a estabilidade da molécula e favorecendo a falha de sua incorporação a cadeia. 
Algumas alterações químicas dos nucleotídeos também podem favorecer o surgimento de mutações espontâneas, como a perda de bases e a desaminação de bases. 
 A perda de bases acontece pelo rompimento espontâneo das ligações N-glicosídicas dos nucleotídeos, responsáveis pela ligação da base nitrogenada a pentose. Dependendo do tipo de base que foi perdida, podemos dizer que a molécula de DNA sofreu um processo de despurinação (quando a base perdida é uma purina) ou dispirimidinação (quando a base perdida é uma pirimidina), que por efeito, cria na cadeia um sítio apurinico (ausência de uma purina) ou apirimídico (ausência de uma pirimidina). Diante da ausência de uma base nitrogenada no seu sítio de ligação específico, qualquer um dos outros quatro tipos de base podem ser incorporados para substituí-lo, caracterizando uma mutação. 
 A água presente no meio intracelular pode favorecer reações espontâneas de hidrólise, que modificam algumas propriedades das bases nitrogenadas. A desaminação hidrolítica, nesse sentido, é a perda do grupo amina da base nitrogenada após uma reação de hidrólise, que resulta na criação de outro tipo de base, interferindo diretamente no pareamento que forma os pares de base. Um exemplo disso é a desaminação da adenina, que forma uma base chamada hipoxantina, caracterizada por se ligar a uma citosina ao invés de uma timina, que seria a ligação natural da adenina, originando uma mutação. 
Substituição de bases 
Por afetar apenas um par de base da cadeia, a substituição de bases é classificada como uma mutação pontual, que atua na troca de bases nitrogenadas da cadeia do DNA.
Quanto aos tipos de substituição, encontramos dois: 
1 - A transcrição, caracterizada pela troca de uma base por outra de mesma categoria química, ou seja, substituição de uma purina por outra purina (A e G) ou a substituição de uma pirimidina por outra pirimidina (C e T); 
2 - e a transversão, que é caracterizada pela troca entre bases de diferentes categorias químicas, ou seja, uma purina por uma pirimidina ou vice-versa. 
Quando as mutações por substituição de base ocorrem em sequências codificadoras de proteínas, podem provocar efeitos a nível molecular da proteína específica. Esses efeitos podem ser classificados como mutações com sentido trocado, mutações sem sentido e mutações silenciosas. 
· Mutações com sentido trocado: São caracterizadas pela modificação de um códon do RNAm, que passa a especificar e associar um aminoácido diferente a estrutura da proteína.
· Mutações sem sentido: Aqui, um códon específico para um aminoácido é alterado, e passa a atuar como um códon de terminação, trazendo como consequência o término prematuro do processo de tradução, produzindo uma proteína incompleta, que normalmente apresenta alteração ou perda de função. 
· Mutações silenciosas: Elas provocam alterações em um códon específico, mas como o código genético é degenerado, o códon continua codificando o mesmo aminoácido. 
Observe o esquema de mutações por substituição de bases na figura abaixo.
Adição ou deleção de bases 
Diferentemente das mutações por substituição de bases, as mutações por adição ou deleção de bases não se restringem apenas a modificações em um único par de base da cadeia de DNA, e sim por alterações mais extensas em relação a sequência de bases. 
 Como o próprio nome sugere, as adições estão associadas à inclusão de bases extras na sequência de DNA, enquanto as deleções se associam à remoção de bases da sequência de DNA que foi formada. Uma vez que a leitura do RNAm durante o processo de tradução é feita em sequências de três em três bases (códons), mutações por adição ou deleção podem alterar a fase de leitura, caracterizando uma mutação frameshift, que possui o nível de gravidade diretamente relacionado com o número de bases que foi adicionada ou removida. 
 Assim sendo, pelo fato da sequência dos códons do RNAm ser alterada, é gerado um impacto direto na proteína que será codificada, seja por interrupção de tradução, seja com uma sequência de aminoácidos diferentes do que se esperava. Quando ocorre a mutação frameshift em bases nitrogenadas múltiplas de três (adição ou remoção completa de uma sequência de três bases que compõe um códon), os efeitos são menos graves, pois esse tipo de alteração resulta na tradução de uma proteína com aminoácidos a mais ou faltando, mas a sequência do RNAm é preservada e a leitura em si, acontece normalmente. 
Mutações induzidas 
As mutações induzidas são aquelas provocadas pela ação exógena de um agente mutagênico, que são algumas substâncias químicas ou fatores de natureza física, que possuem a capacidade de alterar a estrutura da molécula de DNA. Esse tipo de mutação está diretamente relacionado com a evolução dos hábitos da população humana, como mudanças nos padrões alimentares, condições sociais, local de moradia, acesso a saúde, entre outros. Sabe-se que os efeitos causados por esses agentes exógenos aumentam a reatividade da molécula do DNA, induzindo o surgimento de mutações causadas por erros estruturais. Considerando a dimensão desses efeitos, ressaltamos que há alguns tipos de mutação induzida, o que será apresentado logo a seguir. 
Mutações induzidas por agentes físicos
Os principais agentes mutagênicos de natureza química são a luz ultravioleta (UV) e um conjunto de raios e feixes, que compõe o grupo associado a radiação ionizante. As radiações ionizantes possuem alta energia e capacidade de penetraçãotecidual, que podem induzir a molécula de DNA a sofrer adição ou deleção de bases nitrogenadas ou até mesmo danos mais graves, como o rompimento da molécula. O mecanismo de ação desse tipo de radiação é promover a ionização dos compostos químicos das células, aumentando a sua reatividade e, por consequência, a possibilidade de atuação direta sobre a molécula de DNA, causando as mutações. Nesses casos, a probabilidade de desenvolvimento de mutações está diretamente relacionada com a concentração total de radiação a qual o organismo foi exposto. Ao contrário da radiação ionizante, a luz ultravioleta não possui uma quantidade de energia suficiente para penetrar nos tecidos e causar a ionização dos compostos, por isso, propicia danos ao DNA de duas formas diferentes. A primeira forma é um dano direto a molécula de DNA, causado pela alta capacidade de absorção de luz UV, por parte de bases pirimidínicas (principalmente a timina). O excesso de absorção dessas bases induz um processo chamado dimerização de bases pirimidínicas, tornando-as ineficazes no ato do pareamento de bases, e ocasionando diversas ligações indevidas. A segunda forma é um dano indireto induzido pela excitação da luz UV a outros compostos celulares, que passam a agir diretamente na molécula de DNA. 
Observe o processo de dimerização pirimidínica na figura abaixo. 
Mutações induzidas por agentes químicos
Os principais agentes mutagênicos de natureza química são as substâncias conhecidas como bases análogas, intercalantes de DNA e agente de ação direta. As bases análogas são componentes que possuem uma estrutura molecular semelhante à das bases nitrogenadas do DNA, e por isso, caso estejam presentes no momento da replicação da molécula, podem ser incorporadas indevidamente. Podemos citar como exemplos desses compostos a 5-bromouracila, que apresenta similaridade estrutural com a timina e pode estar ligada a uma adenina; e a 2-aminopurina, que possui similaridade com a adenina e pode estar ligada a uma timina. A ligação dessas substâncias pode induzir a substituição de bases, causando mutações. O ácido nitroso (HNO2) é o principal represente dos agentes de ação direta, ele promove um processo que já comentamos anteriormente, a desaminação de bases. A perda do grupo amina produz outros tipos de bases nitrogenadas, que alteram o pareamento de bases. Outra classe de agentes químicos que podem causar mutações são os intercalantes de DNA, que possuem a capacidade de se posicionar entre duas bases pareadas, aumentando a distância entre elas e alterando a estrutura da molécula de DNA. Esse tipo de agente está relacionado com mutações do tipo adição ou deleção de bases, já que quando ele se intercala entre bases de uma cadeia formada, outra base pode ser adicionada no espaço que ele cria entre duas bases, enquanto existe a possibilidade de um agente se intercalar entre bases
de uma cadeia em crescimento, impedindo que outra base seja adicionada no local que foi ocupado. 
Reparo do DNA 
Após estudar os mecanismos de formação e perpetuação das mutações, que causam lesões e incorporações equivocadas de bases nitrogenadas na cadeia de DNA, ocasionando erros de leitura que se refletem na produção de proteínas com função comprometida, vamos nos deter nos modos de reparo do DNA.  Bem, é preciso saber, antes de tudo, que durante a síntese da cadeia do DNA, as células adotam alguns mecanismos de reparo, que garantem a manutenção da integridade do genoma. Dentro desse contexto, a DNA polimerase desempenha uma atividade revisora que constitui o primeiro mecanismo de prevenção à formação de mutações, a exonuclease, que é caracterizada pelo deslocamento no sentido 3’ – 5’ da enzima, com o objetivo de reconhecer possíveis erros de incorporação de base, que em seguida possam ser corrigidos pela própria polimerase.  O surgimento das mutações no DNA é inevitável, e por isso, as defesas dos organismos estão em constante evolução. Caso ocorra falha funcional nos mecanismos de reparo, as mutações tendem a se acumular no DNA, e por efeito são repassadas para as células filhas, ocasionando doenças com gravidade significativa, como a formação de tumores e cânceres no portador. Assim, como já dito, a célula é capaz de adotar diferentes mecanismos e estratégias para corrigir as lesões causadas pelas mutações, dentre elas podemos citar o reparo direto, o reparo por excisão e o reparo por recombinação, que explicamos abaixo.
Reparo direto 
O mecanismo de reparo direto é caracterizado pela ação simples de remoção ou reversão das lesões na cadeia de DNA.  
As principais lesões passíveis de serem corrigidas pelo reparo direto são a dimerização de pirimidinas e a alquilação de bases nitrogenadas. Fotorreativação é o nome dado ao mecanismo desencadeado pela enzima DNA fotolíase, que possui o objetivo de reverter a dimerização de pirimidinas, que foi induzida pela exposição a luz ultravioleta. Como mecanismo de ação, a enzima se utiliza do reconhecimento das bases dimerizadas e passa a absorver a energia luminosa, o que facilita a catálise da reversão dos dímeros as suas formas originais.
EXEMPLO: Um dos mecanismos de ação da quimioterapia para impedir o crescimento das células neoplásicas é a indução da alquilação das bases nitrogenadas do DNA, entretanto, as células são dotadas de um mecanismo natural de reparo, que consegue reverter esse erro, e por isso, é considerado como um fator de resistência ao tratamento quimioterápico. 
O processo de alquilação é caracterizado pela transferência de um grupamento metil ou etil as bases nitrogenadas do DNA, induzindo uma mudança conformacional que leva a erros de pareamento entre as bases. 
 A guanina é a base com maior probabilidade de sofrer alquilação, pela adição de um grupamento metil a sua estrutura. A indução da metilação da guanina, por um agente alquilante, leva à formação da base O6-metilguanina, que passa a se parear com a timina ao invés da citosina (base originalmente pareada com a guanina), criando uma mutação no momento da replicação. 
 Frente a isso, o mecanismo de reparo natural desse erro é a ação de uma enzima chamada O6-metilguanina-metiltransferase (MGMT), que reconhece a base alterada e remove o seu grupamento metil.
Reparo por excisão 
Os reparos por excisão se caracterizam pelo reconhecimento e pela remoção de uma região lesada da fita, para que posteriormente ocorra uma nova síntese da região da cadeia, que irá servir como substituta. Além disso, existem dois tipos de reparos feitos por excisão, um que se volta a pares de base e outro direcionado aos nucleotídeos:
Reparo por excisão de base 
É mediado por um grupo de enzimas chamadas glicosilases. 
Como já comentamos, a desaminação de uma base pode convertê-la em um tipo diferente de base, provocando o erro no pareamento e uma consequente mutação. Sobre isso, sabe-se que existem diferentes tipos de glicosilases, que reconhecem especificamente cada tipo de base que possa estar desaminada (ou com outros erros) e rompem a sua ligação N-glicosídica.
Essa ligação, por sua vez, é responsável por unir a base nitrogenada (nesse caso, uma base defeituosa) a pentose do nucleotídeo. Após a eliminação da base, enzimas de restrição identificam o compartimento vazio na cadeia e removem o restante do nucleotídeo, para que a DNA polimerase possa inserir o nucleotídeo correto ao pareamento. 
Reparo por excisão de nucleotídeos
É um importante mecanismo de reconhecimento e remoção de bases defeituosas, ou de alterações em sequências específicas, que possam causar a distorção estrutural da molécula de DNA. E um dos principais danos que é reparado por esse tipo de mecanismo é a dimerização da timina, induzida pela exposição a luz ultravioleta. O reparo se inicia com a enzima helicase formando uma bolha (semelhante à bolha de transcrição, mas com objetivos diferentes) para que um grupo de enzimas possa reconhecer a sequência de nucleotídeos que está causando o dano. É após o reconhecimento que enzimas de restrição rompem as ligações fosfodiéster (aquelas responsáveispelas ligações entre nucleotídeos) e removem a sequência defeituosa. Dando continuidade ao processo, a DNA polimerase utiliza a extremidade 3’ da fita que teve a sequência removida como um primer (iniciador), para sintetizar uma nova sequência corretamente. 
Observe o passo a passo do reparo por excisão de nucleotídeos na figura abaixo.
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja:
· A radiação UV produz dímeros de timina;
· Uma vez que os dímeros são detectados, o DNA circundante aos dímeros se abre formando " uma bolha";
· Enzimas específicas cortam a região danificada para fora da bolha;
· DNA polimerase substitui o DNA e a ligase promove as ligações especificas, finalizando o reparado da molécula.
Reparo por recombinação 
Já o reparo por recombinação é um mecanismo alternativo de correção para erros que não foram solucionados por outras estratégias de reparo. Isso, porque, como já mencionado, a maioria dos mecanismos de reparo, após a remoção de uma base ou sequência defeituosa, se utiliza de uma fita de DNA não danificada como molde para a síntese de uma nova sequência. Entretanto, em situações em que existem danos nas duas fitas do DNA, não havendo disponibilidade no uso de uma sequência molde, a célula adota as estratégias relacionadas ao reparo por recombinação. Ou seja, quando a DNA polimerase está se locomovendo ao longo da fita durante a replicação e encontra uma região danificada, ela precisa ultrapassar essa região sem adicionar os nucleotídeos para dar continuidade ao processo, criando uma dupla hélice filha. Diante disso, os espaços gerados pela ausência de nucleotídeos são preenchidos pelo material da outra fita de DNA, o que se qualifica como a recombinação. 
Extração de Ácido Nucleico
Com o conhecimento sobre o que é o DNA e o RNA e como eles atuam, agora discutiremos a respeito da extração deles, que se dá por meio de testes diagnósticos. O que você sabe sobre isso? Para começar, é preciso ter em mente que os testes diagnósticos que se baseiam na análise dos ácidos nucleicos se iniciam com uma etapa de extração, que se baseia na manipulação das amostras biológicas, a fim de se obter um material de ácidos nucleicos puro, isto é, um material que não apresente outros componentes celulares, como proteínas, lipídeos e eletrólitos, que podem interferir nos resultados dos testes. Além disso, existem diferentes metodologias de extração de ácidos nucleicos, algumas são mais modernas do que outras, mas nelas o protocolo de extração escolhido varia a depender do tipo de ácido nucleico de interesse (DNA ou RNA) e do tipo de material biológico que será analisado. O manuseio prático desse tipo de teste, por sua vez, deve obedecer a diversas etapas rigorosas de controle de qualidade, relacionados com a prevenção da degradação do material genético e com contaminação da amostra durante o procedimento. Diante disso, manteremos nossa atenção especialmente nas principais etapas do procedimento de extração de ácidos nucleicos de uma amostra biológica. 
Preparo das amostras
 
A extração de ácidos nucleicos pode ser realizada em diversas situações, como investigações criminais, testes de paternidade, diagnósticos de doenças infecciosas, tumores, entre outros. Por isso, diferentes amostras biológicas podem ser submetidas à extração dos ácidos nucleicos, e cada tipo de amostra possui uma particularidade de preparo antes do procedimento. 
 As amostras líquidas, como o sangue e o líquido cefalorraquidiano, são centrifugadas antes do procedimento, para que ocorra a separação das estruturas celulares por diferenças de densidade, obtendo o material de interesse — células e partículas virais quando se trata de um diagnóstico infeccioso. 
 Em amostras sólidas como pedaços de órgãos e músculos, é necessária uma etapa de quebra de estruturas resistentes, antes de dar continuidade ao procedimento. Outro ponto importante é o uso de conservantes ou congelamento em amostras que não vão ser processadas de imediato, principalmente naquelas em que o objetivo é a extração de RNA, já que essa molécula possui estabilidade química inferior ao DNA.
Lise celular 
A lise celular é a primeira etapa do procedimento técnico, sendo caracterizada pelo rompimento da membrana celular, que contribui para a liberação de todo o conteúdo intracelular, facilitando o acesso aos ácidos nucleicos presentes no núcleo. 
 Essa etapa é feita a partir da adição de uma solução tamponada, que além de conter os reagentes que mantem o PH constante, evitando a ação de enzimas que agem diretamente nos ácidos nucleicos, também é composta por algum tipo de detergente específico. O detergente presente na solução atua diretamente nos lipídeos da membrana celular, causando o rompimento celular e a liberação do seu conteúdo. 
Separação das estruturas celulares
Em seguida, os ácidos nucleicos precisam ser separados dos outros componentes celulares que foram liberados no meio. Para isso, são utilizados solventes orgânicos, principalmente o fenol e o clorofórmio, que atuam na desnaturação de proteínas, incluindo aquelas que estão ligadas aos ácidos nucleicos. Após a desnaturação induzida pelos solventes, os resíduos das proteínas criam uma região hidrofóbica, que após a centrifugação, contribui para que os ácidos nucleicos, que são hidrofílicos, se concentrem em uma fase aquosa, enquanto os outros elementos celulares constituem uma fase orgânica.
Formação do precipitado de ácidos nucleicos
Após a separação, os ácidos nucleicos precisam ser isolados da solução aquosa. Isso é feito a partir da adição de um componente hidrofílico, no qual os ácidos nucleicos não são solúveis e passam a se precipitar no fundo do tubo. O etanol absoluto ou isopropanol é o reagente hidrofílico mais utilizado nessa reação e, com a alta concentração salina da solução tamponada, contribui para a precipitação dos ácidos nucleicos no fundo da solução. O precipitado de ácidos nucleicos se forma após a centrifugação, e esses ácidos devem ser retirados para dar continuidade ao procedimento.
Lavagem e suspensão 
Depois que o precipitado é retirado, ainda existem alguns contaminantes presentes na solução, como resquícios dos detergentes e solventes que foram utilizados no teste, entre outras impurezas. Por isso, os ácidos nucleicos são submetidos a etapas de lavagem, que são feitas a partir da adição de etanol a 70%. Esse etanol evapora facilmente após o cumprimento de suas funções, tornando necessário que o material seco seja reidratado por uma solução tampão TE ou água ultrapura, garantindo, com isso, a estabilidade e a possibilidade de armazenamento por longos períodos de tempo.
Extração por coluna
Atualmente, existem alguns kits comerciais de extração de ácidos nucleicos que fornecem todos os reagentes necessários para o teste, visando a redução da rotina de trabalho que as outras técnicas proporcionam, que estão relacionadas com a produção dos próprios reagentes, a quantidade de reagentes utilizados e o tempo de execução prática do teste. A maioria dos kits comercializados tem como metodologia o emprego de uma coluna de extração, composta por uma membrana de sílica, que possui afinidade cromatográfica pelos ácidos nucleicos, levando a sua retenção. A extração por coluna também se inicia com a lise celular, e esse lisado é adicionado a coluna junto a um reagente formado por sais caotrópicos. Esses sais, por seu turno, cumprem a função de desnaturação das proteínas e preservação do ácido nucleico, ocasionando a ligação dos ácidos à membrana. É interessante dizer que, assim como nos outros procedimentos, na extração por coluna, os ácidos nucleicos precisam ser submetidos a uma etapa de lavagem a partir da adição do etanol, e uma etapa de eluição pela adição de uma solução tampão (pode se o tampão TE). Durante o procedimento, as colunas são acopladas em tubos (Figura 14), e, nas etapas de adição do lisado aos sais caotrópicos e de lavagem, o complexo coluna-tubo é centrifugado. Com isso, o ácido nucleico permanece associadoà membrana, ao passo que os reagentes que já cumpriram suas funções atravessam a membrana e se precipitam no tubo, sendo descartados em seguida. Ao final do procedimento, é obtido o ácido nucleico eluido. 
Observe, na Figura 15, a diferença entre a extração por coluna os demais protocolos de extração.
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja:
· Cell harvest = Precipitado de células. 
· Cell Lysis = Lise celular.
· Reagent system = Sistema de reagente.
· Column system = Sistema de coluna.
· Protein removal = Remoção das proteínas.
· Dna preciptation = Preciptação do DNA.
· DNA rehydration = Reidratação do DNA. 
· DNA binding = Ligação do DNA.
· Wash = Lavagem.
· DNA elution = Eluição do DNA.
Eletroforese
A eletroforese é uma técnica de biologia molecular amplamente utilizada em pesquisas científicas, essa se baseia na separação de moléculas ionizadas a partir das diferenças de peso molecular, tamanho e carga elétrica que possuem. Diversas moléculas podem ser submetidas a testes em eletroforese, possuindo diferentes objetivos associados a diagnósticos, investigações criminais, testes de paternidade, entre outros. 
Essa técnica utiliza componentes essenciais para a metodologia que é aplicada, dentre esses existe um gel que atua como matriz de migração das moléculas, essa migração ocorre após a indução de um campo elétrico formado por uma fonte de energia. Além disso, é necessário o uso de uma solução tampão, tanto para a produção do gel, quanto para uso no momento da execução do teste, pois possui a função de manter o PH do meio. 
O procedimento se inicia com a produção do gel que será utilizado como matriz de migração para as moléculas, e ele é feito a partir da mistura entre um meio desidratado e o tampão que é utilizado no teste, devendo ser fundidos por homogeneização seguida de aquecimento. A cuba de eletroforese é uma peça adotada como meio de suporte para a realização do teste, e é nela que a solução do gel deve ser despejada após o aquecimento, para que se possa acrescentar um “pente” que servirá como molde para formação dos poços no gel, após a sua solidificação (Figura 16). 
A cuba de eletroforese possui em suas extremidades um eletrodo positivo e outro negativo, por isso, os poços do gel que foram utilizados para depositar as moléculas de interesse de separação devem ser posicionados na extremidade do eletrodo negativo, por tais moléculas serem atraídas para o eletrodo positivo durante a migração. Desse modo, antes da fonte de energia ser ligada, criando o campo elétrico, o gel presente na cuba deve ser imerso pela solução tampão. 
Nos próximos tópicos, você entenderá mais sobre os princípios individuais de cada componente da eletroforese. 
Características dos géis utilizados 
Mas de que se tratam os géis utilizados na eletroforese e quais são? Sabe-se que são placas moldadas a partir de um componente gelatinoso, que vão servir como matriz de migração para a amostra de interesse. Atualmente, existem dois principais tipos de géis empregados nas práticas de eletroforese, o gel de agarose e o gel de poliacrilamida, ambos apresentam diferenças funcionais. A base de produção dos géis é normalmente comercializada, e a sua confecção pode ser feita no próprio laboratório, a partir de uma reação de polimerização dos seus componentes, que leva à solidificação que resulta no gel.
· O gel de poliacrilamida: Comumente chamado de PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis), esse gel tem a sua matriz formada a partir da polimerização gerada pela mistura entre a acrilamida e a bis-acrilamida, que resulta na formação de ligações cruzadas entre as moléculas de acrilamida. 
 
Para auxiliar na polimerização, algumas substâncias químicas que atuam como catalisadoras da reação podem ser acrescentadas, como o persulfato de amônio, que é utilizado como fonte de radicais livres e a tetrametiletilenodiamina (TEMED), que possui a função de decompor o persulfato de amônio. Após a decomposição, os radicais livres são liberados, e são eles que catalisam a polimerização do gel. 
 A maior desvantagem do uso do gel de poliacrilamida é que os componentes utilizados para a sua produção (acrilamida e TEMED) são neurotóxicos, por isso exigem cautela durante o seu manuseio.
· O gel de agarose: A agarose utilizada para a produção do gel de agarose é um polissacarídeo natural, derivado de algas marinhas e composto basicamente por repetições de unidades de agarobiose, que são dissacarídeos compostos por D-galactose e 3,6-anidro-L-galactose. 
Opostos aos PAGEs, os géis de agarose não possuem componentes neurotóxicos e apresentam uma polimerização mais simples e rápida, além de existir a possibilidade de um gel de agarose ser reutilizado para a confecção de outra matriz. [TB1] 
A diferença entre os dois géis é basicamente no tamanho dos poros que são formados na matriz após a polimerização, onde os poros do gel de agarose são maiores, permitindo a separação de moléculas com uma maior variedade de tamanho, mas apresentando uma baixa capacidade de resolução se comparado ao PAGE, enquanto os poros do PAGE são menores, o que limita a separação de moléculas menores, tendo, no entanto, maior capacidade de resolução. 
Devido a variedade de tamanho das moléculas de ácidos nucleicos, para a separação de seus fragmentos, os géis de agarose são habitualmente mais escolhidos do que os PAGEs. Por exemplo, os fragmentos de DNA que foram separados durante a eletroforese têm o seu tamanho definido pela quantidade de pares de base (pb) que possuem. Uma eletroforese com gel de poliacrilamida apresenta maior eficácia em separar fragmentos menores, de até 500 pb, entretanto, o gel de agarose possui a capacidade de separar fragmentos que possuem de 100 pb até 50 kpb (1 kpb = 1000 pb). 
Fatores que conduzem a migração das moléculas no gel 
Uma vez que o gel está pronto, uma amostra controle junto as demais amostras de interesse devem ser distribuídas nos poços do gel, para que ele possa ser cuidadosamente posicionado no interior da cuba de eletroforese, dando continuidade ao procedimento — as amostras podem ser transferidas antes ou depois de posicionar o gel na cuba de eletroforese. 
Caso o interesse seja separar fragmentos de ácidos nucleicos, partimos do princípio de que os nucleotídeos que compõe a estrutura da molécula são carregados negativamente devido ao grupamento fosfato e, por isso, a extremidade do gel que contém os poços deve ser posicionada na mesma direção polo negativo da cuba (cátodo), para que após a submersão do gel em solução tampão, e no momento em que a fonte de energia seja ligada, as moléculas sejam atraídas para o polo positivo (ânodo), que está posicionado na extremidade oposta. 
 Observe os componentes da eletroforese e o direcionamento da migração das moléculas na figura abaixo. 
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja:
· Electrode = Eletrodo.
· Power supply = Fonte de energia.
· Sample wells = Poço. 
· Direction of movement = Direção da migração.
· Buffer solution = Tampão de corrida.
· Electrophoresis tank = Cuba de eletroforese.
Alguns fatores interferem diretamente na velocidade com que as moléculas se deslocam ao longo do gel, dentre eles, destacam-se os que estão associados com os componentes elétricos e os que estão relacionados com a resistência friccional. 
Os componentes elétricos estão ligados a dois fatores, o primeiro é o potencial elétrico aplicado no teste, ou seja, a voltagem utilizada pela fonte de energia e o segundo é a carga líquida das moléculas que estão sendo testadas. A carga líquida se baseia na capacidade que as proteínas possuem de adquirir carga, positiva ou negativa, a partir do PH do meio em que elas estão e, por isso, é importante que a reação seja feita com o uso de uma solução tampão, que estabilize o PH.
 A resistência friccional envolve alguns fatores que atuam como forças impeditivas que dificultam a migração das moléculas no gel. Dentre eles, podemos citar:
· a tamanho das moléculas,de maneira que as moléculas menores se difundem por distâncias maiores e mais rapidamente que as moléculas maiores;
· a concentração do gel, que está associada a possíveis manipulações no tamanho dos poros do gel, a partir de modificações na concentração da solução utilizada para produzi-lo;
· a viscosidade da solução tampão em que o gel é imergido;
· a conformação da molécula, no caso do DNA, este pode se encontrar em conformação circular, com excesso de torção etc.. 
A mobilidade eletroforética determina a velocidade com que uma molécula se movimenta no gel, a partir da exposição a um potencial elétrico específico. Esse índice pode ser calculado a partir da divisão da velocidade, que é diretamente proporcional aos elementos elétricos presentes, e inversamente proporcional a resistência friccional.
Existem algumas diferenças entre a eletroforese que é feita para separação de proteínas, da que é feita para a separação de ácidos nucleicos. 
 A eletroforese de ácidos nucleicos se baseia essencialmente no tamanho e na conformação dos fragmentos para realizar a separação, enquanto a eletroforese de proteínas utiliza outras variáveis, como carga intrínseca da molécula. 
 Como as proteínas são formadas a partir da ligação de diferentes tipos de aminoácidos, existe uma variedade química e estrutural superior à dos ácidos nucleicos, que tem a sua estrutura composta por um número mais limitado de elementos. Diante disso, algumas técnicas podem ser executadas para a separação das proteínas, como o uso de um detergente chamado dodecil-sulfato de sódio (SDS), que altera a carga intrínseca das proteínas, tornando-as obrigatoriamente moléculas de carga negativa, de forma que a separação segue a mesma lógica que a dos ácidos nucleicos (atração de moléculas negativas pelo polo positivo).
 
Nesse cenário, uma técnica chamada focalização isoelétrica utiliza o princípio das cargas líquidas das proteínas para alcançar sua separação e, para isso, precisa preservar a carga intrínseca das proteínas. Mas, como foi discutido, as proteínas apresentam a característica de modificar a sua carga, dependendo do PH encontrado no meio, por isso, essa técnica utiliza um gel que possui variações de PH ao longo de sua estrutura. 
 Isso faz com que as proteínas migrem normalmente até alcançar uma região do gel (ponto isoelétrico), que possui um gradiente de PH específico, que a induz a tornar-se neutra, interrompendo a migração. Esse tipo de técnica é empregado na eletroforese de hemoglobinas, utilizada para o diagnóstico de diversas hemoglobinopatias. 
Eletroforese em ácidos nucleicos 
A interpretação a respeito do tamanho das moléculas dos ácidos nucleicos é determinada pelo número de pares de base (pb) quando se trata de DNA (dupla fita) e pelo número de nucleotídeos quando se trata de RNA (fita única). 
 Além do tamanho dos fragmentos, a conformação que eles possuem tem importância significativa para o deslocamento no gel. Moléculas distintas que possuem equivalência de massa podem se movimentar em velocidades diferentes a partir da conformação que apresentam. Em outras palavras, uma molécula que apresente um volume menor se desloca mais rápido que uma molécula maior, mesmo que ambas possuam a mesma quantidade de massa.
 Assim que o tempo predeterminado de indução de carga elétrica termina, os fragmentos de ácidos nucleicos formam bandas no gel. E a variedade de bandas formadas no gel é estabelecida pelo tamanho e conformação dos fragmentos da molécula, onde as bandas que se aproximaram mais do polo positivo representam os fragmentos menores, que possuem uma mobilidade eletroforética maior, ao passo que as bandas que permaneceram mais próximas ao polo negativo representam os fragmentos maiores, que consequentemente possuem menor mobilidade eletroforética. 
 Para que a visualização das bandas seja possível, os ácidos nucleicos precisam ser marcados previamente por corantes ou por radioisótopos. Um dos principais corantes utilizado na eletroforese de ácidos nucleicos é o brometo de etídio, caracterizado por ser um agente intercalante de DNA (se intercala entre os pares de base) e fluorescente, que torna possível a visualização das bandas quando colocado em contato com uma luz ultravioleta, fornecida por um equipamento chamado transiluminador. 
 Ainda, o brometo de etídio apresenta alto potencial carcinogênico ao entrar em contato com o corpo, tornando-se um risco em potencial tanto para os analistas que trabalham com a técnica, quanto para o ambiente, caso o descarte não seja apropriado. Frente a essa condição, o corante Safer se tornou uma alternativa para suprir essas desvantagens e, apesar de ser mais caro do que o brometo de etídio, tende a substitui-lo gradativamente, por ser um reagente não mutagênico e também por cumprir a função de permitir a visualização das bandas após entrar em contato com a luz ultravioleta.
Após os resultados obtidos pela eletroforese, a técnica de Southern blot (Northern blot se for para RNA) pode ser aplicada, para confirmar se uma sequência de DNA específica de interesse está ou não presente na amostra que foi analisada. Ou seja, essa técnica serve para identificar a presença de um gene específico em uma amostra que possui todo o genoma do organismo.
 Além de tudo o que já discutimos, é fundamental dizer que há um procedimento feito após a eletroforese, e ele consiste em duas etapas que se realizam em sequência, a transcrição e a hibridização. 
· 1 - A etapa de transcrição se baseia no uso de uma membrana de nitrocelulose, que é posicionada sobre o gel de eletroforese, para que possa ser pressionada a partir da adição de um peso sobre a mesma (pode ser várias folhas de papel toalha). 
Nesse sentido, tanto a pressão exercida sobre a membrana, quanto uma etapa de aquecimento feita em seguida garantem que o DNA que estava no gel seja passado para a membrana. 
· 2 - A próxima etapa é a hibridização, que se caracteriza pelo uso de uma sonda, que é uma molécula de DNA que possui uma sequência já conhecida e que deve ser idêntica ou complementar à sequência que se tem interesse de se pesquisar. 
A sonda de DNA é normalmente marcada quimicamente, e caso ocorra pareamento entre as bases da sonda e do DNA da amostra, significa que a sequência pesquisada estava presente. A reação pode ser vista com o auxílio de uma autorradiografia ou por alteração de cor, caso a marcação seja feita por uma substância cromogênica. 
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja:
· 1- Electrophoresis gel = Gel de eletroforese.
· 2-Nitrocellulose filter = Membrana de nitrocelulose.
· 3-Blotting paper = Papel absorvente (blotting).
· 4-DNA transferred to filter = DNA transferido para a membrana.
· 5-Hybridize with unique nucleic acid probe = Hibridização com a sonda específica.
· 6-Probe hybridized... = Sonda hibridizada a sequência complementar de DNA.
· 7-Leitura. 
SINTETIZANDO
Neste material, conversamos sobre os aspectos genéticos, abordando a estrutura dos ácidos nucleicos e a formação dos nucleotídeos para originar a molécula de DNA, bem como o processo primordial da síntese proteica com o dogma central da biologia que envolve a replicação, a transcrição e a tradução. 
 Além disso, observamos que falhas no DNA podem acarretar mutações genéticas que estão relacionadas com determinadas alterações de uma região do DNA que pode interferir na síntese proteica e promover alterações conformacionais na proteína e, com isso, causar doenças específicas. Nesse sentido, percebemos que tais alterações apresentam classificações que se dão de acordo com o tipo de nucleotídeo e a sequência do DNA. 
 Posteriormente, aprendemos sobre duas técnicas iniciais que permitiram seguir com nossos estudos: a extração de DNA, que é necessária para que os procedimentos moleculares sejam aplicados para um diagnóstico específico, e a eletroforese, que é adotada para revelar se a extração ocorreu corretamente e para verificar de forma visual a técnica denominada reação em cadeia da polimerase (PCR). 
 Agora,vamos seguir com nossos estudos? Estou lhe esperando!