Genotoxicidade_final

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Toxicologia Aplicada – Módulo II
Genotoxicidade
· Capacidade de agentes químicos ou físicos causarem dano nas moléculas de informação genética (DNA, RNA).
Agentes
Genotóxico: reage com o DNA causando dano.
Mutagénico: aumenta a frequência de mutações. Normalmente, um agente mutagénico também é genotóxico – causa danos que a célula não consegue reparar. 
Carcinogénico: aumenta a incidência de tumores (mutações em genes que comprometem a célula aumentam a incidência de tumores).
Teratogénico: induz malformações no embrião ou no feto. Agentes teratogénicos muitas vezes também são carcinogénicos, mutagénicos e genotóxicos.
· Não são conceitos independentes, um agente pode ser vários.
Lesões primárias após tratamento com mutagéneos
Mutação: alteração ma sequência das bases de DNA. Há danos mais facilmente reparáveis que outros.
· Aducto de uma molécula volumosa (Ex: benzo(a) pireno)
· Alquilação (agentes alquilantes monofuncionais) – alteração do grupo alquilo numa das bases.
· Danos de bases (Raios-X)
· Dímero de Pirimidina (UV) – muito comum, duas Timinas emparelham uma com a outra, é facilmente reparável. Muito comum na pele (por ser provocado por UV)
· Formação de radicais (BUDR-Luz, raios-x, …)
· Fosfotriesteres (agentes alquilantes monofuncionais)
· Intercalações (acridinas)
· Ligações cruzadas DNA-proteína (Raios-X, agentes alquilantes polifuncionais)
· Ligações cruzadas inter-catenarias (agentes alquilantes bifuncionais)
· Ligações cruzadas intra-catenárias (agentes alquilantes polifuncionais)
· Rupturas de cadeias simples (Raios-X, UV,…) – dano comum e facilmente reparável
· Ruturas de cadeias duplas (radiações ionizantes)
· Sítios Apirimidinicos (agentes alquilantes monofuncionais)
· Sítios Apurínicos (agentes alquilantes monofuncionais) – são locais no DNA onde devia haver uma purina (uma base) mas por qualquer reação química ou por tratamento com um composto, a base sai – a DNApolimerase não vai reconhecer.
Danos no DNA endógenos e exógenos
· Processos endógenos:
· Danos oxidativos: podem ocorrer em qualquer molécula (ex. proteínas, lípidos, DNA também mas é mais complicado). Hidrolisação, quebras de cadeia.
· Metilação
· Agentes físicos: radiação UV, radiação ionizante
· Agentes químicos: PAHs (fumo de cigarro), aminas heteroacídicas (dieta), quimioterapia.
Agentes mutagénicos e seus mecanismos de ação
· Agente alquilante: Ex. Ethylmethane sulfonate e nitrogen mustard. Mecanismo: ligações bulky em grupos de lado em bases.
· Agente intercalante: Ex. proflavina. Mecanismo: a topoisomerase II deixa um corte numa cadeia de DNA, má reparação resulta na inserção ou deleção de un/alguns nucleótidos.
· Agente oxigante: Ex: ácido nitroso. Mecanismo: deaminação.
· Água – pode ser genotóxica: radicais podem fazer hidrólise. Mecanismo: depurinação (separa A ou G da desoxirribose)
· Análogos de bases: compostos moleculares químicos que no meio celular têm estrutura química semelhante a algumas bases, o DNA liga-se a estes em vez das bases e a enzima não vai reconhecer. Ex. 5-bromodeoxyuridina, 5-bromouracilo. Mecanismo: aumenta o mispairing de bases.
· Luz ultravioleta: Ex. luz natural ou de lâmpadas. Mecanismo: forma dímeros de pirimidina (ligações covalentes entre pirimidinas adjacentes, primariamente T)
· Radiação ionizante: Ex. Raios-X, materiais radioativos, Radão (muito presente em trás-os-montes, no granito), materiais radioativos. Mecanismo: quebras na cadeira única ou dupla do DNA; danos nos nucleótidos.
Agente químico, físico ou biológico -> Lesão primária no DNA:
· Apoptose
· Reparação:
· Eficiente -> estabilidade genética
· Deficiente (às vezes os mecanismos podem não estar a 100%, por exemplo por excesso de danos, e podem reparar mal) -> mutação ↓
· Replicação -> mutação -> cancro, envelhecimento, doenças genéticas na descendência
· Mutações génicas: dentro dos genes
· Anomalias cromossómicas
Nota: dano no DNA/lesão primária: é reparável e a mesma coisa.
Possíveis efeitos: o mais normal depois da lesão génica é a reparação. A lesão pode afetar células somáticas (cancro) ou células germinais (efeitos hereditários). Efeitos epigenéticos (cancro).
Mecanismo de ação de mutagénicos químicos
· 1º Reagindo com as bases: formas tautoméricas (alternativas das bases e elas emparelham de forma diferente), bases alquiladas, transições e transversões.
· 2º Análogos das bases: transições
· 3º introduzindo-se entre as moléculas de DNA: distorce a molécula originando adição e deleção
Agrupação de acordo o seu mecanismo de ação:
· Ação direta: reagem com o DNA sem necessidade de ativação metabólica, ou seja, sem necessidade de haver uma transformação da sua estrutura química)
· Ação indireta: requerem ativação metabólica para reagirem com o DNA
· Modificam o DNA indiretamente: que, modificados ou não, não provocam eles mesmos os danos no DNA mas originam produtos mutagénicos ativos.
Ativação metabólica: é diferente de espécie para espécie, as bactérias não têm a mesma metabolização dos xenobióticos que os mamíferos (mesmo entre eles há diferenças) – para fazermos testes, temos que ver se o metabolismo dos compostos é equivalente.
Ambiente 
· Em cada dia que passa são sintetizados novos produtos químicos que assim, constantemente, são introduzidos no ambiente.
· Há cada vez mais compostos usados em veterinárias, indústria, no dia-a-dia a que estamos expostos diariamente (por ex. escape do carro).
· Os organismos vivos, incluindo o Homem, são afetados pelo ambiente em que vivem, estando continuamente expostos a agentes químicos e físicos capazes de provocar lesões.
· Há muitos compostos naturais (não sintetizados pelo Homem) que são genotóxicos (moléculas de síntese também). 
Mutagénese ambiental: ramo da genética que estuda os efeitos mutagénicos dos contaminantes ambientais.
Carcinogéneos
· Podem ser genotóxicos ou não genotóxicos.
· As propriedades mutagénicas de um composto dependem de um grande número de circunstâncias, tais como:
· Via de entrada no organismo (ingestão, injeção, inalação, etc.), 
· Forma de transporte, acessibilidade às células alvo, atuação dos sistemas do metabolismo xenobiótico e reatividade com o DNA, bases e posições que danifica e reparabilidade dos danos induzidos.
· Etapas do processo mutacional (desde a entrada do composto na célula, até ao dano genético):
1. Entrada do mutagéneo na célula e sua interação com os componentes extra cromossómicos, podendo dar lugar, à formação de um derivado mutagénico, dependendo do facto de serem mutagéneos de ação direta ou indireta e de existirem ou não enzimas de metabolização;
2. Uma vez em contacto com o cromossoma, o mutagéneo (ou o seu derivado) reagirá ou não com o DNA, dependendo não só do tipo e da dose da substância mutagénica, mas também do estado do material genético (espiralização, fase do ciclo celular, etc.);
3. A etapa seguinte é a reação química real entre o mutagéneo e o DNA, reação essa que tem sido experimentada in vitro para muitas substâncias. A mutagenicidade de um composto, depende da sua reatividade com o DNA, posições que danifica, tipos de aductos formados, etc;
4. Finalmente, se o mutagéneo produzir uma lesão no DNA, essa passa ainda por toda uma série de processos de reparação do material genético com vista a manter a viabilidade celular e a fidelidade da replicação do DNA. Só no caso de falharem esses mecanismos de reparação é que a mutação está fixada, podendo então tornar-se hereditária.
Nota: 
· Transições: trocas de pirina por pirina (AG) ou pirimidina por pirimidina (CG). Por ex: devido a análogos de bases
· Transversões: trocas de pirina por pirimidina ou pirimidina por purina.
Mecanismo de ação dos mutagéneos físicos:
· Via indireta: radiação atinge molécula de água, o radical livre causa dano na cadeira de DNA.
· Via direta: radiação atinge diretamente e causa dano na cadeira de DNA.
Em estudo:
· Usamos doses abaixo da DL50 – pois se usamos doses muito tóxicas, as células/organismos não vão ter descendência para testar, porque retiram-se células após o tratamento ou da descendência.
· Fazer curva de letalidade,para determinar DL50 e depois usar doses abaixo.
· Composto X – doses altas, depois moderada, para determinar a DL50. Muitas vezes as baixas também são altas.
· Se derem positivo, passa-se para os testes in vivo:
· Se for positivo: o composto tem potencial genotóxicos
· Se for negativo: não tem potencial genotóxicos
· Objetivo dos ensaios:
· In vivo: efeito no organismo como um todo (organismos modelo, células isoladas depois de um tratamento in vivo)
· In vitro: efeito a nível celular (células em cultura, células isoladas e exposição in vitro, bactérias)
Teste de Ames
Bacterial reverse mutation assay: teste genotóxicos de curto termos mais usado para a análise de possíveis carcinogéneos químicos. Procedimento fácil, rápido, barato e sensível de analisar rotineiramente. Usado para fazer um primeiro screening, se der positivo depois podemos fazer um mais especifico.
· Utilizam-se estirpes de bactérias (Salmonella) deficientes a sintetizar aminoácidos essenciais – tryp- ou his- (não crescem em meio básico).
· Se não crescerem – continuam tryp- e o composto não é mutagénico
· Se crescerem – passam a tryp+ e o composto é mutagénico
· Nota: para manter estas colónias (para multiplicação, etc) temos que adicionar ao meio os aminoácidos que elas são deficientes. 
· Em ensaios não usamos, em meio mínimo só vão crescer tryp+ ou his+ -> é preciso que ocorra uma mutação para passarem a tryp+ ou his+ que ocorre se o composto for mutagénico (este é adicionado ao meio de cultura)
Problema: as bactérias estão muito longe fos mamíferos, especialmente em metabolização de compostos xenobióticos (depois podem passar de mutagéneos a não mutagéneos ou vice-versa).
Teste de Ames atualizado 
Adiciona-se estrato enzimático de fígado de rato (Sq) – é mais facilmente extrapolável para mamíferos, simula a metabolização dos tóxicos que acontece em mamíferos.
A – Controlo: só bactérias em meio mínimo, as que cresceram têm mutações espontâneas.
B – O composto não aumenta o número de colónias em relação ao controlo. É um falso negativo: pelo teste de Ames básico podíamos concluir que não é mutagénico.
C – Controlo da enzima
D – diferença muito significativa em relação ao controlo. É mutagénico e necessita de ativação metabólica, é positivo em mamíferos. 
· Forma mais correta: durante a ativação metabólica, o composto X transformou-se num composto mutagénico.
Notas: 	Metabolização por fígado de rato pode diminuir a taxa de mutagénese – pode dar um falso positivo no teste básico de Ames (ou seja, sem ativação ser mutagénico, mas com ativação não ser mutagénico).
Temos sempre de indicar as doses, se teve ativação metabólica ou não, para dizer se é genotóxicos.
Ensaio do Cometa
· Indicado para danos recentes.
· Técnica de avaliação para medir os danos no DNA em células individuais fazendo uma eletroforese de células isoladas. Os fragmentos de DNA que migram durante a eletroforese de uma célula constituem a cauda do cometa e são detetados mediante um sistema de analise de imagem. O ensaio em condições alcalinas facilita a deteção de ruturas de cadeia simples. 
· Deteta quebras do DNA, roturas de cadeias simples e duplas, e sítios alquiláveis (sensíveis a pH alcalino).
· Exemplo de dano: sítios sem bases, em pH básico vão-se tornar numa rutura.
· In vitro: células em cultura, células isoladas e submetidas a tratamento in vitro. 
· In vivo: células isoladas após exposição a agente ou condição ambiental in vivo (linfócitos; tecidos alvo – fígado, cérebro, etc; spz)
· Eletroforese em agarose:
1. Lise (em solução com alta concentração de sais e detergentes – tira membranas, histomas, citoplasma etc, só fica o DNA livre para eletroforese. Sem lise o DNA não migra – triton X-100, 2.5M NaCl
2. Tratamento alcalino – desnaturação do DNA, conversão dos sítios alquiláveis em ruturas - 0.3 M NaOH, 10mM EDTA
3. Eletroforese: forma o cometa
4. Neutralização, coloração DAPI, microscopia fluorescente
· Cabeça do cometa: DNA intacto
· Cauda do cometa: DNA com ruturas – quanto maior mais danos. As ruturas são de cadeias duplas e simples (para outros têm que se fazer passos extra)
· A fração de DNA na cauda reflete a quantidade de quebras no DNA – com a limitação, de que quando todo o DNA está na cauda, o ensaio fica saturado. Este limite é atingido a niveis baixos contráriamente a outros ensaios. 
· O limites do ensaio do cometa são estreitos, desde poucas centenas a poucos milhares de quebras por célula; o que torna o ensaio muito sensivel.
· % de DNA na cauda é proporcional ao número de ruturas/danos. É o que nos vai dar as unidades arbitraries.
Vantagem: pode-se aplicar a todas as células eucarióticas isoláveis.
Valor significativo: depende das células. O controlo quanto mais baixo melhor (exemplo: o fígado tem muitos, podemos ter 100 unidades). Em drosófilas vemos melhor, em controlo baixo, se os valores forem significativamente diferentes (estatisticamente) consideramos genotóxicos.
Tail moment: intensidade da cauda x comprimento (não diz muito, se a concentração de agarose for alta, não migra tão longe, e o contrário também).
Unidades arbitrárias: 0		 1		 2			 3		 4		Cálculo: nº de cometas x valor dessa classe, somar tudo.
	Exemplo: 4 cometas no 2 e 5 cometas no 3 = 7x2+5x3 = 29
Drosophila
· Utilidade: manipulação genética, ciclo de vida curto (12 dias) e tem metabolismo de compostos xenobióticos parecidos aos mamíferos (também tem enzimas antioxidantes e sistema de reparação de DNA parecidos).
SMART Assay
· Somatic Mutation Recombination Test
· Indicado para danos acumulados ao longo do tempo.
· Usa duas linhagens (olhos brancos + olho selvagens), as fêmeas-filhas vão ser heterozigóticas (w+/w[branco, recessivo]). 
· Exemplo: recombinação somática dos cromatídeos, perda de cromossomas, deleção da zona w+, mutação -> 4 situações que dão white e é isso que procuramos, comparamos com o controlo para ver se o composto é genotóxicos (mais olhos brancos, significa mais genotoxicidade).
· Ensaio de cosmética: se o composto biológico prolonga a longevidade tem efeito antioxidante ou de reparação do DNA.
· Composto antigenotóxico - faz-se um teste conjunto: challenge 
· Se o controlo for baixo, faz-se um controlo positivo com um genotóxicos conhecido e tratamos simultaneamente o genotóxicos conhecido com o composto que queremos testar, para ver se diminui a genotoxicidade.
· Detetar acontecimentos que levam à formação de descendência white (não sabemos qual foi a observar a mosca):
· Recombinação somática: sempre genotóxicos
· Perda de cromossoma completo: o composto tem ação genotóxica e/ou mutagéneo
· Deleção do local do gene
· Mutação somática de w+ a w-
· Nota: crossing-over e recombinação meiótica são normais, recombinação mitótica não é normal – há genotoxicidade.
Challenge
· Streptomidina: é um medicamento altamente genotóxico. Num ensaio anterior, demonstrou alta atividade genotóxica sem efeitos tóxicos. Parece um indutor poderoso de mutações somáticas.
· No SMART Assay com 20mM -> 40% de olhos brancos
· Streptomidina + composto antigenotóxico: bom sistema para avaliar a antigenotoxicidade (juntam-se no meio de cultura).
· Para vermos se reduz a percentagem de olhos brancos, no mínimo faz-se o ensaio com 600 olhos.
· Ensaio com azeitonas:.
· A azeitona transmontada tem efeito antigenotóxico.
· Sem a streptomidina: só conseguíamos concluir que a azeitona não é genotóxica.
· Streptomidina + azeitona: diminuição da percentagem de mutantes com o aumento da concentração de azeitona.
Micronúcleos
· O micronúcleo é constituido por uma pequena massa nuclear delimitada por membrana e separada do núcleo principal. Os micronúcleos são formados durante a telófase da mitose ou meiose, quando a membrana nuclear é reconstituída ao redor dos cromossomos das células filhas. São resultantes de fragmentos cromossómicos acêntricos ou de cromossomos inteiros que não foram incluídos no núcleo principal. Assim sendo, o micronúcleo representa perda de cromatina em consequência de dano cromossómico estrutural (fragmento) ou dano no aparelhomitótico. 
· Pode ser feito in vivo ou in vitro
· Muitas vezes usado com o Teste do Cometa: são diferentes, no cometa os danos podem ser reparados e neste caso são danos estabelecidos não podem ser reparados, logos estes testes são complementares.
· Ensaio em células sanguíneas que deteta quebras cromossómicas, na mitose os fragmentos acentricos depois da divisão celular vão fromar m micronúcleo (nas celulas-filhas, podem ter mais que um) -> significa que houve rutura cromossómica. 
· Contar quantos micronúcleos em cada 1.000 núcleos: quanto mais, maior é o dano genotóxico.
 (
X – idade / Y – células com micronúcleos por 1.000
Reta de tendência: ao longo da idade, mulheres têm mais danos genotóxicos.
Possível explicação: uso de cosméticos, 
anti-contracetivos
., ambiente hormonal.
Maior
 
taxa
 
de
 
micronúcleos:
 
pode
 
ser
 
devido
 
à
 
perda
 
de
 
eficácia
 
dos
 
mecanismos
 
de
 
reparação
 
do
 
DNA
;
 
acumulação
 
de
 
mutações
 
devido
 
à
 
perda
 
do
 
comprimento
 
dos
 
telómeros
.
)
Mecanismos de reparação do DNA
Principais mecanismos de reparação de DNA:
· Base excision repair (BER)
· Nucleotide excision repair (NER)
· DNA mismatch repair
· Single stranded break repair
· Double strand break and inter strand crosslink repair
· Nenhum dos sistemas de reparação do DNA, bem como o seu conjunto, é totalmente eficaz na eliminação dos danos produzidos, tanto induzidos como espontâneos. 
· Haverão, inclusivamente, mutações atribuídas a erros ocorridos durante os processos de reparação. 
1
0
2,5
5
without streptonigrin - group I
with streptonigrin - group II
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
percentage mosaic 
eyes
g olive fruit/100 mL medium