Livro - Métodos para análise de Alimentos 2 edição

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M 
Metodos pam 
ATalTse deAlimetos 
INCT CIENCIAANMAL 
2a Edição 
Métodos para Análise de 
Alimentos 
2 edição 
INSTITUTO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE3 
CIENCIA ANIMAL 
Organizadores 
Edenio Detmann 
Luiz Fernando Costa e Silva 
Gabriel Cipriano Rocha
Malber Nathan Nobre Palma 
João Paulo Pacheco Rodrigues
2021 
INCT Ciência Aninmal 
Exemplares deste livro podem ser adquiridos na: 
Livraria UFV on-line 
www.editora.ufv.br 
Televendas: (31) 3612-2064/2067 
Diagramação e Montagem: 
Edson Agostinho Pereira: 31 3612-4623 
Ficha catalográfica preparada pela Seç�ão de Catalogação e 
Classificação da Biblioteca Central da UFV 
Métodos para análise de alimentos/Organizadores Edenio 
Detmann... [ et al.]. - 2. ed.- Visconde do Rio Branco, 
MG: Suprema, 2021.
350 p.:il.;21cm. 
M593 
2021 
ISBN 978-65-995122-2-3 
Inclui bibliografia. 
1. Nutrição animal. 2. Animais- Alimentos. 3. Alimentos- 
Qualidade. I. Detmann, Edenio, 1974-. II. Silva, Luiz 
Fernando Costa e, 1985-. 1I. Rocha, Gabriel Cipriano, 1983-. 
V. Palma, Malber Nathan Nobre, 1990-. V. Rodrigues, João 
Paulo Pacheco, 1988-. VI. Universidade Federal de Viçosa. 
Departamento de Zootecnia. VII. Instituto Nacional de 
Ciencia e Tecnologia de Ciência Animal (Brasil). 
CDD 22. ed. 636.08552 
Bibliotecária responsável: Renata de Fátima Alves CRB6/2578
E permitida a reprodugäo parcial desde que citada a fonte. 
2 
Métodos para Análise de Alimentos-2" Edição
Métodos para Análise de 
Alimentos 
2 ediçãoo
Organizadores 
Edenio Detmann Luiz Fernando Costa e Silva 
Zootecnista, M.Sc., D.Sc. 
Research Manager 
Zootecnista, M.Sc., D.Sc 
Professor Titular, DZO-UFV 
Pesquisador 1A do CNPq 
Pesquisador do INCT-Ciência Animal 
Alltech 
Gabriel Cipriano Rocha 
Zootecnista, M.Sc., D.Sc 
Professor Adjunto, DZ0-UFV 
Pesquisador do INCT-Ciência Animal 
Malber Nathan Nobre Palma 
Zootecnista, M.Sc., D.Sc 
Bolsista PNPDICAPES 
DZO-UFV 
João Paulo Pacheco Rodrigues 
Zootecnista, M.Sc, D.Sc 
Professor Adjunto, UNIFESSPA 
Pesquisador do INCT-Ciência Animal 
2021 
3 
INCT Cência Animal 
"But man does not limit himself to seeing; he thinks and insists on learning the 
meaning of the phenomena whose existence has been revealed to him by 
observarion. So. he reasons, compares facts, puts questions on them, and by the 
answers which he extracts, test one by another. This sort of control, by means of 
reasoning and facts, is what constitutes experiment, properly speaking; and it is 
the nature of things outside us. 
In the philosophic sense, observation shows, and experimemt teaches." 
Claude Bernard
(1813-1878) 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
Prefácio
(Primeira Edição) 
Após um "longo e tenebroso inverno", Conseguimos 
disponibilizar a primeira edição dos Métodos para Análise de Alimentos 
do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Ciência Animal (INCT 
CA). 
Durante o estabelecimento do INCT-CA definiu-se como uma 
de suas metas prioritárias a criação de uma Rede Nacional de Pesquisa 
em Avaliação e Análise de Alimentos. O intuito primário deste ato 
calcou sobre a real necessidade de se conhecer como as diferentes 
instituições avaliavam os alimentos e como se podería, da melhor forma 
possível, contrastar ou cotejar com exatidão e precisão os resultados de 
experimentos obtidos em diferentes instituições. 
Em um primeiro momento de avaliações descobrim0s que 
estávamos falando línguas bem diferentes e que necessitávamos
estabelecer um idioma comum para que nossa comunicação se tornasse
mais próxima do universal. Assim nasceu a idéia deste manual. 
Durante o período em que o mesmo foi elaborado, muitas 
avaliações conjuntas foram novamente realizadas, nas quais pudemos
perceber que nos aproximamos mais de um "idioma analítico" 
comum. 
Contudo, muito ainda precisa ser percorrido. 
Parte dos parâmetros analíticos de alimentos presentes neste 
manual não pôde ser adequadamente avaliada em ensaios de variação 
5 
INCT Ciêncio Animal 
interlaboratorial. Isto constitui uma meta da Rede de Avaliação de 
Alimentos. Assim, algumas decisões que resultaram no estabelecimento 
de padrões de procedimentos foram estabelecidas com base em 
experimentos conduzidos em uma única instituição ou, em pequenos
pontos, na experiência pessoal de membros do INCT-CA. Contudo, em 
um futuro próximo, desejamos que isto não seja mais do que história, pois 
almejamos a avaliação científica/empírica de tudo o quanto aqui se expõe, 
além da expansão do domínio de métodos abordados e divulgados. 
Desta forma, estabelece-se claramente que esta primeira versão
constitui somente um chamamento aos usuários da análise de alimentos. 
Apliquem os métodos aqui estabelecidos. Identifiquem seus equívocos e 
suas deficiências. Comuniquem ao INCT-CA. Identifiquem os métodos 
que não foram, mas que deveriam ter sido abordados. Juntos, poderemos 
trabalhar para que este manual possa se tornar uma referência de comum
acordo com todos aqueles que necessitem ter a análise de alimentos como 
ferramenta básica para o desenvolvimento de suas atividades de ensino,
pesquisae extensão. 
Os Organizadores 
6 
N 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
Prefácio 
(Segunda Edição) 
Após quase dez anos, não sem muito trabalho, conseguimos 
disponibilizar a segunda edição do "Métodos para Análise de Alimentos" 
do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Ciência Animal (INCT 
CA). 
Durante esse tempo,1 percebemos os erros cometidos na primeira 
edição e tentamos, na medida do possível, corrigi-los e aperfeiçoar as 
informações que disponibilizamos anteriormente. 
Podemos assumir, sem grande culpa, que esse aperfeiçoamento 
não foi fácil. Muitos assumem que o trabalho na área de análise de 
alimentos é muitos simples, pois restringe-se ao laboratório. Ledo 
engano. Muito foi feito, destacando-se o esforço de muitos estudantes de 
graduação e pós-graduação e bolsistas de pós-doutoramento. 
Certamente, a perfeição não atingimos. Contudo, coletivamente, 
alcançamos algo maior do que o que foi atingido na primeira edição. 
Melhorias sempre. A perfeição, infelizmente, nunca será alcançada. 
Contudo, esperamos que a nova edição do Métodos para Análise de 
Alimentos do INCT-CA venha minimizar as dificuldades que possam 
existir nos laboratórios de análise de alimentos para animais das 
instituições brasileiras. 
Muitos dos métodos com os quais trabalhamos constituem 
métodos empíricos, os quais definem os resultados per si. Nesses casos, 
7 
N 
Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição 
INCT Ciencia Animal 
seguir uma linguagem comum é fundamental para que possamos Agradecimentos conversar entre nós e projetar algo maior que a simples soma das partes.
Esperamos que a revisão e ampliação da primeira ediç�o possa Ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Ciência abranger algo maior do que fizemos há nove anos. No entanto, as críticas Animal (NCT-CA), pelo suporte financeiro e físico dado para a esugestões continuam bem vindas para que, em uma terceira edição, elaboração dos estudos, das reuniões de trabalho e para a execução de possamos nos aproximar ainda mais do objetivo de uma linguagem ações que culminaram com a feitura deste manual.comum. 
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e 
Tecnológico (CNPg), pelo constante apoio financeiro na forma de bolsasCordialmente,
de pesquisa e de financiamento direto para a realização de ações
pertinentes às informações geradas para feitura deste manual. 
Edenio Detmann 
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais Coordenador da Rede de Avaliação de Alimentos 
(FAPEMIG), pelo apoio financeiro na forma de bolsas e de INCT-CA 
financiamento direto para conduç�ão de ensaios laboratoriais.
A CAPES, por prover bolsas de estudo para estudantes de pós- 
graduação, bolsas de pós-doutoramento (PNPD) e recursos financeiros,
sem os quais muito do que aqui é apresentado não poderia ter sido 
realizado.
Ao Departamentode Zootecnia da Universidade Federal de 
Viçosa, por ceder suas instalações para realização de grande parte dos 
testes laboratoriais necessários para ajustamento de métodos de análise de 
alimentos. 
As instituições componentes da Rede de Avaliações de 
Alimentos do INCT-CA, por aceitarem o desafio e participarem nas ações8 
9 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição INCT Ciência Animal 
que culminaram nesse manual. Nossos enos nos mostraram a necessidade Codificação INCT-Ciência Animal
de encontrar um caminho conum. Esse foi nosso grande estorço e nossa 
grande contribuição. A codificação dos métodos estabelecidos para análise de 
Aos pesquisadores ligados ao INCT-CA, por contribuírem para 
N 
alimentos segue o que foi estabelecido na primeira edição do Manual. O 
a condução de ações pertinentes à elaboraç�o deste manual. objetivo principal da mesma é de estabelecer uma linguagem universal 
Aos Drs. Luiz Femando Costa e Silva, Gabriel Cipriano Rocha, N para 
todos aqueles que desejarem aplicar os fundamentos aqui 
Malber Nathan Nobre Palma e João Paulo Pacheco Rodrigues, que estabelecidos e, quando necessáio, referencia-los em relatórios e artigos 
atuaram como bolsistas de pós-doutoramento CAPES/PNPD ligados cientifico. 
diretamente à elaboração da segunda edição deste Manual. A interpretação do código dos métodos de análise de alimentos é 
A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a exposta a seguir. 
concretização deste novo esforçn e que, por motivos alheios à nossa 
vontade, não foram citados aqui nominalmente. Estrutura do Código: Método X-YYY/Z 
Campo X 
Muito Obrigado! Estabelece qual a área em que o método específico se enquadra 
dentro da análise de alimentos 
Código de Area Area 
Métodos de anáises gerais
Métodos de análises para compostos 
nitrogenados 
Métodos de análises para compostos fibrosos 
Métodos de anádises para compostos minerais 
G 
N 
F 
M 
11 10 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição INCT Cineii Anima 
SumárioCampo 
Estabelece o número do método dentro de cada área para o Página Capítulo Tema INCT-CA. 
15 1 Obtenção e processamento de amostras ************** Campo Z 
55 2 Secagem definitiva e matéria seca. ******** ********** Estabelece qual a versão do método que está sendo exposta Matéria mineral. 65 ******** ************************ Todos os métodos constantes na primeira edição deste Manual foram 
Nitrogênio (proteína bruta). 75 *************** *** *** identificados nesse campo pelo número "1", pois constituíam a primeira Frações nitrogenadas proteica e não proteica . 97 ******* versão do método em si. Para aqueles que sofreram alterações, o valor do 
Gordura bruta.. 107 campo Z foi alterado sequencialmente (vide, quando cabível, seção Fibra 127 1 *********** *********************************** "Aualizações" em cada Capítulo). 
173 8 Amido... ** ****************************** 
Carboidratos não fibrosos e matéria orgânica 
residual. 
9 
185 
************°****** 
203 10 Lignina .. ****************************************************** 
231 11 Fibra indigestível. ****************************** ********* 
249 12 Solução mineral ***************"°***********"************** 
259 
13 Fóstoroinorgânico total.******* *** ****°** ********* 
269 
14 Cromo..
285 L. 
15 Nitrogênio amoniacal em tluidos biológicos .. 
301 
16 Titânio . 
Digestibilidade n vitro da maténa 
seca para 
ru ntes . 
17 313 
*********° ************** 
Protocolos para condução de ensaios
de degradação 
in situ em ruminantes .. 
329 18 
13 2 
Métodos para Análise de Alimentos-2" Ediçäão 
Capítulo 1 
Obtenção e processamento de amostras 
Definições básicas em amostrageme inferência em alimentos 
A análise de alimentos constitui área relevante no ensino das 
Ciências que estudam alimentos, pois fornece ferramentas e subsídios 
para vári0s segmentos do controle de qualidade, do processamento e 
do armazenamento, além das informações básicas acerca de seu 
potencial e efetividade de utilização por animais e humanos. 
Nesse ramo do conhecimento s�o estudados os alimentos; sua 
composição química; sua ação no organismo; seu valor nutritivo 
(algumas vezes também o valor alimentício); suas propriedades 
fisicas, químicas, microbiológicas, sensoriais, toxicológicas; e 
também adulterantes, contaminações, fraudes, etc. Assim, a ciência 
análise de alimentos relaciona-se com tudo aquilo que, de alguma 
forma, éalimento para os seres humanos e animais, desde a produção, 
coleta e transporte da matéria-prima, até a venda como alimento 
natural ou industrializado. Também é função da análise de alimentos 
verificar se o alimento se enquadra nas especificações legais, 
detectando a presença de adulterantes e aditivos prejudiciais à saúde. 
Em resumo, relaciona-se com todos os diferentes aspectos que 
envolvem um alimento, permitindo juízo sobre a qualidade do mesmo. 
15 
INCT Ciéncia Anima Métodos para Análise de Alimentos-2 Fdição
Nesse sentido, os alimentos devem ser submetidos a análises 
Em termos gerais. inferir significa tirar conclusão. Estatisticamente, a 
de controle de qualidade e composiçâo química, as quais sâo 
inferéncia conecta dois elementos chave no processo de avaliaçäo de 
igualmente importantes na contabilização de propriedades nutritivas dados: a população ea amostra. Segundo definições da ABNT (2010). 
particulares. Assim. essas análises represcntam complementos
a populaçãco consiste da totalidade dos itens considerados, ao passo 
importantes aos ensaios de alimentação. aos experimentos nutricionais que a amostra corresponde a uma das partes individuais em que uma 
(Van Soest. 1967). à indústria e aos sistemas de produção. população é dividida. Assim, em termos gerais. a populaç�ão constitui 
Para controlar a qualidade dos alimentos e aceitação dentro de o todo, sendo a amostra uma fração deste. Para a realizaçio segura do 
limites satisfatórios, torna-se importante monitorar as características processo de inferència faz-se necessárno que a fração (amostra) seja 
das matérias-primas. ingredientes, dietas e alimentos processados. um representante fidedigno de todas as caracteristicas do todo. pois 
Isso pode ser feito através da avaliação de todos os alimentos ou isso possibilita que. ao entendermos a fração. podemos concluir (i.e.. 
ingredientes de um lote específico, o que, no entanto, além de inferir) sobre o todo. Em estatistica, chamamos essa caracteristica de 
impraticável. inviabilizaria sua utilização posterior. Assim, o caminho representatividade. Por sua vez, a representatividade. em análise de 
factível consiste em selecionar uma porção do produto total e assumir alimentos, é denominada de integridade de analito. a qual. portanto. 
que a qualidade da porção selecionada é representativa de todo o lote indica a qualidade da amostra tomada do todo. 
(Proctor & Meullenet. 1998). Esse procedimento é denominado de O termo populaçio, em análise de alinentos, não faz muito 
amostragem. sentido, ua vez que nem sempre desejamos inferir sobre todo o milho
Assim, por definição, a amostragem é o conjunto de operações ou tarelo de soja existentes, mas apenas sobre lotes especiticos 
com os quais se obiém, do material em estudo, uma porção dquiridos ou utilizados em determinado momento e/ou local. Assim, 
relativamente pequena, de tamanho apropriado para o trabalho no o "todo" em análise de alimentos constitui um conceito populacional 
laboratório, mas que ao mesmo tempo represente corretamente todo o mais restrito, sendo denominalo de unidade de decisão,
a qual 
conjunto da amostra (Cecchi, 2003). 
representa o ateral a partir do qual 
uma amostra é coletada e ao qual 
A resultante do processo de amostrugem de alinentos 
uma interencia deve ser projetada. A unidade de 
decisão pode ser 
constitui em habilitar o analisla a rcalizar um processo de inleréncin. 
17 
todas para Ariip d Aiimernting fri 
INCT Cn ii Animal 
onstituida por uma carrcta de gråo ou farelo, um silo,a enreçio feal veres, desavisadamente, ohserv.amos resultados que julgamos nO total de um animal. um lote de feno, um piquete solb pastejo, cte. Condizentes e. instintivamente, os qualificamos como resultante de 
Nesse contexto, o processo de amostragem de alimentos se crros no método de análise (e.g.. imprecisio do analista. "problemas" 
resume em tomar uma parte da unidade de decisão que preserve a no cquipamento elou reagentes). Contudo, o erro global de estimaçã0 
integridade de analito. ou seja. que preserve a earacterística ou representa mais do que isso. pois possun dois componentes distintos 
concentração do objeto de interesse como encontrada na unidade de (Figura 1.). O primeiro componente e. infelizmente. algumas vezes 
decisão. julgado como único, é o erro analitico total. que representa a soma 
Contudo. o conccito de amostra em análise de alimentos de todas as interferèncias geradas pelo método de análise em sie todos 
possui algumas diferenças marcantes em relação ao que ocorre na os elementos envoltos em sua aplicaçio (e.g.. preparo de reagentes. 
estatística. Em muitas situaçõces de análise de dados, as amostras manutenção e operação de equipamentos; treinamento, pericia e zelo 
produzem conjuntos numéricos finitos que, após o devido tratamento do analista). 
matemático/probabilístico. produzem os elementos que suportam a Todavia. o erro global de estimação é também atetado pelo 
inferéncia. No entanto, na análise de alimentos a amostragem não é erro total de amostragem (Figura 1.), o qual representa o erro 
estática como na simples avaliação de dados. O processo de cometido durante qualquer estidio da reduçào de massa que causa 
amostragem em análise de alimentos é dinâmico e formado por desvios na integridade de analito da amostra avaliada em relaçdo à 
diversas instáncias, iniciando-se na unidade de decisão e terminando unidade de decisdo. Com grande probabiliukade, o erro total de 
no momento da análise em si. Cada ctapa é crucial para manutenção amostragem intluencia mais o erro global de estimaçdo do que o erro 
da integridade de analito e passível de imputar diferentes erros sobre analitico total. Dois prineipais moüvos suportam tal atirmativa. Em 
o resultado final. primeiro lugar, o erro total de amostragem representa um processo 
Quando obtemos um resultado em laboratório, esse vemn continuo composto por várias etapus, as quais, individualmente, erros 
acompanhado de um erro global de estimação, que representa 
a poem ser cometidos e. consequentemente. propagados (Figura l.2).
divergéncia entre o valor da característica ou concentração expresso m segunko lugar, os erus de anwstragem são, em sua grande 
pcla amostra e o valor real concernente à unidade de 
decisdo, Muitas iwr, uegligenciaules e. por isso, polem agir silenciosamente sobre 
J8 
Meodos pra Analise de Alimentos 2" Ediçio
INCT Ciência Animal 
o ero global de estimação. Se um ero analitico ocorrer. podemos 
Erro Global de repetir a anáise. Se um ero de amostragem ocorrer, na maioria
Estimação massiva dos casos, não há retorno, pois as unidades de decisão ficar:am 
no passado e não há como re-amostrá-las. 
Dessa forma. o conceito de amostra representativa em análise
Erro Total de Erro Analitico de alimentos é essencial e, em si, plural, pois percorre dinamicamente Amostragem Totalum processo longo e melindroso a fim de preservar a integridade de 
analito. 
Erros não devidos a 
processos de seleção
A primeira instância do processo de amostragem resulta na 
Erros devidos a amostra primária, a qual é formmada por diferentes incrementos processos de seleção 
tomados da unidade decisão de acordo com um protocolo de 
amostragem. Por definição, um incremento é a porção individual de 
Figura 1.1. Erro global de estimação e seus componentes (Adaptado
material coletada por uma operação de amostragem simples que, emn 
de AAFC0, 2015; 2018). conjunto, compõem a amostra primária. Por exemplo, em uma carreta 
de grãos, o incremento representa cada ponto de amostragem de um Comumente, a amostra primána possui massa superior ao calador de parede dupla. A amostra formada por todos os pontos de necessário para envio ao laboratório. Nesse ponto introduzimos dois amostragem constitui a amostra primária. O mesmo raciocínio é feito conceitos. Primeiro, o de amostra laboratorial, que representa o para pontos de amostragem em uma fatia de um silo ou em amostras material enviado ao e/ou recebido pelo laboratório. Essa amostra fecais pontuais (i.e., amostras grab) em um animal em experimento de normalmente representa uma amostra dividida, a qual indica um metabolismo. 
porção da amostra primária obtida sem nenhum viés. As operações de 
divisões de amostras visando à manutenção da integridade de analito
são normalmente denominadas de quarteamento. 
21 
20 
Mélodos para Análise de Alimentos - 2" Edição INCT Ciência Animal 
Resultado da Análise Erro Analitico 
A amostra laboratorial nem sempre poOssui características que 
a habilitam à análise. Assim, a mesma deve passar por processamento 
físico (i.e., secagem parcial e/ou moagem) que a adeque para a análise. Porção TesteDesse processo, produzimos a amostra analítica. 
A amostra analítica, por sua vez, fornecerá pequenas alíquotas 
Amostra Analítica que serão submetidas à análise em si, as quais são denominadas de 
porções teste. No momento em que uma porção teste é selecionada 
Amostra Laboratorial 
(e.g., uma alíquota de 200-300 mg da amostra analítica para avaliação 
1 
da concentração de nitrogênio), o processo de amostragem é 
encerrado. Isso evidencia que a amostragem em si constitui processo
Amostra Primária contínuo, com múltiplos estádios e que, em cada estádio, erros podem 
ser cometidos os quais comprometerão a integridade de analito, o 
Unidade de Decisão processo de inferência e a confiabilidade dos resultados. Logo, atribuir
aos erros analíticos a ampla responsabilidade por resultados julgados
Figura 1.2. Fluxograma de influência de erros e da realização de 
inferência em análise de alimentos (setas azuis indicam a 
realização de inferência; setas vermelhas constituem ação 
de erros de amostragem, a seta negra indica a 
interterência causada por erros na análise em si). 
como não condizentes pode ser uma atitude não tão racional assim.
Além das definições de amostra que seguem a dinâmica do 
processo de amostragem (Figura 1.2). existem definições adicionais 
de amostra que devem fazer parte do vocabulário do analista de 
alimentos. São essas: amostra dividida, amostra replicada e 
amostra composta. O conceito de amostra dividida foi previamente 
23 22 
Mélodos para Análise de Alimentos - 2" Edição INCT Ciencia Animal 
na amostra composta. Nesse cas0, OS incrementos (e.g.. pontos discutido. Amostras replicadas significam frações de uma amostra
colcta cm uma carreta de farelo) devem ser equivalentes; ou seja. tomadas sob condições comparáveis em qualquer ponto do pucesso 
devem apresentar o mesmo peso na formação da amostra composta de amostragem. Esse conceito é comumente aplicado em duas 
i.C., a amostra primária). instancias em nossa área de atuação. Primeiro, quando envia-se uma 
amostra laboratorial, é prudente que uma contra-prova seja Contudo, 
a formação de amostras compostas nem sempre 
segue esses preceitos. Um exemplo simples pode ser construído a armazenada no local de origem. para os casos de perda da amostra
laboratorial no transporte ou contestação dos resultados obtidos. Em partir da coleta fecal de ruminantes em experimentos de metabolismo. 
Caso procedamos à coleta fecal pontual (i.e. amostras grab, tomadas segundo lugar. quando realizamos repetições em laboratório, 
pressupõe-se que cada porção teste represente uma amostra replicada em pequenas frações em momentos especificos). nossa amostra 
da amostra analítica. composta deverá ser equivalente à cada coleta (nesse caso, 
O conceito adicional final de amostra é o de amostra comumente, a amostra composta será formada por massa iguais de 
composta, o qualconstitui aquela amostra que, em qualquer instância amostra seca ao ar tomadas em cada tempo de amostragem). Por outro 
do processo de amostragem, é obtida pela mistura de amostras antes lado, caso realizemos coletas totais de fezes durante três ou mais dias, 
da análise em si, com objetivos de ampliar a eficiência analítica (i.e., a amostra composta será formada por alíquotas proporcionais a cada 
reduzir custos ou o número de procedimentos analíticos). A dia. Em outras palavras, para os dias de maior exereção, a alíquota
interpretação incorreta do conceito de amostra composta constitui componente da amostra composta deverá ter maior peso na amostra
algumas vezes um comprometimento primordial do processo de final. Isso éé o que denominamos de amostra composta proporcional 
inferência, sobretudo quando sua aplicação compromete o conceito de aos seus incrementos. 
unidade experimental. Isso não deve ocorrer e atenção deve ser Considerando que a amostragem constitui processo contínuo 
dirigida a isso. com múltiplos estádios. os erros se manifestarão de forma plural 
Dessa forma, o conceito de amostra composta deve ser durante sua execuç+o. De tornma geral. os erros de amostragem se 
aplicado corretamente. Com um raciocínio simples, entendemos que enquadrarão em dois grupos principais: serão ou não causados por 
uma amostra primária, ao ser formada por incrementos, compreende processos de seleção de elementos (Figura 1.1).
24 
Mctodos para Analise de iunentos c 
INCT Ci�nia Animal
Erros devidos|
|a processos de 
seleção 
Por definição, elementos são os componentes indivicduais quc 
formam um dado material. podendo ser gràos ou partículas para 
materiais sólidos. moléculas para materiais líquidos ou uma mistura
de ambos para materiais pastosos. Os materiais podem ser Erros 
Erros
Sistemáticos 
classificados como materiais de elementos finitos ou infinitos. Os Aleatórios 
primeiros são formados por elementos que podem ser identificados e 
Erro por 
delimitação del 
incremento 
Erro 
selecionados individualmente ao acaso, como o caso de lotes de grãos
fundamental integrais ou frutos. Os segundos, por sua vez, sâo formados por de 
amostragem 
elementos que näo podem ser identificados e selecionados 
Erro por 
extração de 
incremento 
individualmente ao acaso, como o caso de farelos, materiais em pó ou 
Erro por material líquido, como óleos e outros líquidos (e.g., leite, urina,
agrupamento 
e segregação melaço líquido). 
Erro na 
A partir dessas definições, estabelece-se que os erros
ponderação de 
incrementos 
associados a processos de seleção decorrem de equívocos ou 
influências na retirada dos elementos de um material. Esses erros 
Figura 1.3. Erros de amostragem devidos a processos de seleção e 
seus componentes (Adaptado de AAFCO. 2018).
podem ocorrer de forma aleatória ou sistemática (Figura 1.3).
Os emos aleatórios são aqueles que ocomem por causas 
inprevisiveis e que fogem ao controle do analista. Resumidanmente, isso 
indica que um ineremento ou porção teste analisada terà uma 
L 
caracteristica ou valor diterente do incremento ou porção teste anterior 
(conceitos adaptados de JCGM, 2008; INMETRO, 2014). Cada novo erro 
aleatório poderå possuir módulo e/ou direção totalmente diferente do 
27 26 
1étodos para Análise de Al1mentes-2 Edi 
ometido no ineremento ou ponçåo teste que v poccdeu, Como såo 
honogeneos. Uma mistura concentrada contendo farelos e grios inteios
caractenisticos de cada avaliação, apereepydo do emo aleatório é dada por 
ou uma silagem de milho possuem alta heterngeneidade de composição, 
medidas de variabilidade (c.g.. variância amostral). Quanto maior o eo 
pois seus clementos variam muito entre si. 
aleatório, menor será a precisão do processo ou da análise. Adicionalmente, existe a heterngeneidade de distribuição. a 
Por outro lado, os emos sistemáticos se manifestam de forma qual se origina da distribuição não-aleatóra (embora incorra em erro 
constante sobre incrementos, anmostras e porções teste, fazendo com que alcatório) espacial e/ou temporal dos elementos dentro de uma unidade 
todos os resultados obtidos se desloquem em mesmo sentido e módulo de decisão. A heterogeneidade de distribuição espacial ocorme, por 
em relação à característica ou à concentração real. Esse deslocamento é exemplo, quando transporta-se uma carga de gräos ou farelos em caretas. 
também denominado viés. Em boa parte dos casos, os erros sistemáticos Com a trepidação durante o transporte, diferentes estratos horizontais são 
possuem causa conhecida. o que pemite que sejam corigidos com fomados. Partículas menores e mais densas se concentram na parte
reinamento, boas práticas ou, em último caso, por intermédio de fatores inferior da carga. ao passo que particulas maiores e menos densas 
de começão. Contudo, a questão parece ser mais complicada em predominam no estrato superior. Com a estratificação horizontal. produz- 
amostragem. pois equívocos nos procedimentos dependem imensamente se uma heterogeneidade de distribuição vertical. Por outro lado. a 
do fator humano, o qual nem sempre reconhece a realização de práticas heterogeneidade de distribuição temporal ocome. por exemplo, com o 
capazes de incorrer em erros sistemáticos na formaçãão das diferentes armazenamento de silagem de milho em longos silos trincheira. A 
amostras. Quanto maior o erro sistemático, menor será a exatidão na forragem retirada na entrada do silo será diferente daquela retirada no 
expressão final de uma característica ou concentração. centro ou na parte posterior. pois foram depositadas em momentos 
Os eros aleatórios devido à seleção de elementos ocorrem distintos (i.e., ficaram expostas ao ar por tempos diferentes, foram 
basicamente devido à ocorrência de heterogeneidades no material, as cortadas de campos distintos ou, se cortadas no mesmo campo, foram
quais ocorrem por dois motivos. A heterogeneidade de composição cortadas em dias distintos). 
origina-se de diferenças na composição entre elementos individuais em O primeirw emo aleatório apresentado na Figura l.3 é o erro 
uma unidade de decis�ão. Materiais como farelo de soja, por exemplo, tundamental de amostragem, o qual ocorme devido à heterogeneidade 
possuem baixa heterogeneidade de composição, pois seus elementos silo 
28 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição INCT Ciência Animal
de composição da unidade de decisâo. Sua descrição quantitativa, dada O segundo erro aleatório apresentado na Figura 1.3 é o erro por 
por intermédio de uma variância amostral, < (AAFCO, 2015; 2018): agrupamento e segregação, o qual decorre da heterogeneidade de 
distribuição dos elementos na unidade de decisão. De fornma simplificada, HCxd 
SEFA 
sua descrição quantitativa é dada por (AAFCO, 2018): 
m 
HD em que: s EFA = Variância do erro fundamental de amostragem; HC = 
EAS 
n 
heterogeneidade de composição; dnás = diàmetro máximo dos elementos; 
e m= massa do incremento. em que: SEAS = Vvariância do erro por agrupamento e segregação; 
Pela equação é possível deduzir algumas medidas a serem HD = heterogeneidade de distribuição; e n = número de increment0s. 
adotadas no processo de amostragem em uma unidade de decisão. A aplicabilidade direta a ser retirada da equação acima é: quanto 
Primeiro, quanto maior a heterogeneidade de composição, maior será o maior a heterogeneidade de distribuição, maior deve ser o número de 
ero aleatório passível de ocorrer. Para que um controle seja feito, duas- incrementos que comporão a amostra primária. 
decisões podem ser tomadas. Primeiro, aumentar a massa de cada Os erros sistemáticos ligados a processos de seleção (Figura 1.3) 
incremento na formação da amostra primária. Segundo, reduzir o podem ocorrer em três instâncias distintas, embora não haja pleno consenso 
diâmetro dos elementos. Essa segunda medida nem sempre é possível na na literatura. A primeira instância é denominada de erro na ponderação 
prática, pois nem sempre é possível processar mecanicamente o material deincrementos, o qual resulta do uso de incrementos desproporcionais 
antes da amostragem. A lógica dessa relação nos diz que seria mais (em massa ou volume) em relação a sua verdadeira importância em umna 
adequado amostrar o milho moído em relação ao milho em gr�o. Se for amostra primária ou composta. A segunda instäncia é denominada de erro 
factível, beneficios seriam obtidos em relação à precisão. Contudo, essa por extração de incremento, o qual resulta de remoção imprópria de um 
equação nos será muito útil para justificar a aplicação do processamento incremento, resultando em perda de material durante a remoção. Por 
mecânico ie., moagem) para formação de amostras analíticas e porções dtümo, temos o erro por delimitação de incremento, que é causado,
teste, o que veremos em um momento posterior deste Capítulo. principalmente, do uso de instnumentos de amostragem inadequados para a 
situação em questão. Exemplos podem ser verificados em AAFC0 (2018). 
30 31 
Métodos para Análise de Alimentos 2 EdiçãoINCT Cincia Aninat 
de moinhos indevidamente limpos (ou não limpos) entre uma moagem e Por outro lado. todos os emos de amostragem que não cstão
outra.assaciados a praxessos de seleção são de natureza sistenmática (Figura 1.4).
O primeiro desses é o erro de integridade de analito, o qual resulta de 
Erros não devidos a processos| 
de seleão
mudanças de concentração ou em características da amostra durante o 
processo de amostragem. Na nossa área de atuação a ocomência desse erro CEros sistemáticos) 
é comum durante o processanmento físico da amostra, notadamente durante 
a redução parcial da umidade de amostras. O uso de temperaturas 
Erro por material estranho inadequadas (i.e., excessivamente altas) ou ambientes de secagem 
inadequados (e.g., algumas vezes secagem em estufa, quando a 
amostra/análise demanda liofilização) podem levar a alterações 
Erro de recuperaçäo de 
massa
ireversíveis na amostra que comprometem a integridade de analito. Perdas 
por volatilização ou modificação das características químicas por reações 
Erro por introdução de 
contaminação 
não-enzimáicas são as causas mais comuns para o erro de integridade de 
analito. 
O erro por introdução de contaminação ocorre devido à 
Erro de integridade de introdução não intencional de contaminantes, os quais podem incorrer em 
anaito
concentração ou diluição do analito, introdução de materiais indesejados na 
Figura 1.4. Erros de amostragem não devidos a processos de seleção
e seus componentes (Adaptado de AAFCO, 2018). 
amostra ou introdução de elementos causadores de interferências analíticas 
de uma foma geral. Esse enro se assemelha à contaminação cruzada em 
fábricas de rações e decorre, comumente, do uso de instrumentos de 
Por sua vez, o chamado erro de recuperação de massa decomeamostragem utilizados sem a devida limpeza, o que carreia elementos de 
da perda (mais comunm) ou ganho de massa de uma amostra durante o um processo para o outro. Outra forma comum de imputar esse erro às 
processo de amostragem, afetandoa integridade tinal do analito. Na nossa amostras Ocorre durante o processamento mecânico da amostra com o uso 
32 
33 
Mélodos para Análise de Alimentos - 2" EdiçãoINCT Cincia Animal 
CSColha Como incremento, sua amOstra primária passará a ter uma alta area, esse erro é mais comumente cometido durante o pocessamento 
mecânico das amostras. Moinhos mal conservados levam à perda de fração 
de material mofado. Durante o uso da silagem. possivelmente esse 
material por trestas durante a moagem, a qual pode comprometer a pequeno "pedaço" será desprezado. Por que inclui-lo na amostra? 
integridade de analito. Por outro lado, processos de moagem mal Um aspecto final dos problemas associados à amostragem foi 
conduzidos principalmente pelo uso de tempo aquém do necessário, com devidamente abordado pela AAFCO (2015: 2018): os denominados 
o aproveitamento apenas do material moído nos primeiros minutos, blunders. Esses correspondem a equívocos ou, algumas vezes. acidentes 
causarão viés na integridade do analito. Lembrem-se: amostras possuem que resultam em perda ou comprometimento da informação, os quais
heterogeneidade de composição. 0 fato de uma fração da amostra levar podem ocorrer em qualquer estádio do processo de amostragem (e.g. 
mais tempo para moer, indica que na amostra existe uma estratificação quebra de frascos, rotulagem incorreta, erTOS de anotação, falhas de 
física (1.e., uma fração é mais resistente å moagem que outra). equipamento, escolha de métodos incorretos). Os blunders, por sua 
Estratificações físicas são, na maioria massiva dos casos, decorrentes de natureza, não podem ser considerados na avaliaç�o do erro total de 
heterogeneidades de composição causadas por características químicas. amostragem, devendo ser prevenidos ao máximo com o devido preparo e 
Por fim, temos o erro por material estranho. Durante a retirada atenção do amostrador/analista e com cuidados em todos os procedimentos 
de uma amostra é comum encontrarmos materiais estranhos que não Sua ocorência, pode, algumas vezes. comprometer todo o processo, 
pertencem naturalmente à unidade de decisão. Esses materiais são levando à necessidade, se possível. de se repetir todo o processo de 
normalmente desprezados no uso do material e, de certa forma, não amostragem. 
possuem representatividade frente à unidade de decisão como um todo. No Um dos principais comprometimentos gerados pelos blunders 
entanto, ao permitir que o mesmo componha, por exemplo, uma amostra ocoTe sobre a integridade de evidencia Essa representa a segurança que 
primária, sua participação na amostra será indevida e exagerada, nenhuma evidência tenha sido perdida ou comprometida desde o processo 
comprometendo a integridade de analito da mesma. Como exemplo, de amostragem até a obtenção de resultados analíticos. A integridade de 
suponhamos que você esteja amostrando um silo trincheira. De frente para evidência possui ampla relação com aspectos éticos ou legais da análise de 
a fatia, você se depara com um pequeno nicho de material mofado. Esse alimentos e sua aplicação busca assegurar a integridade da amostra desde a 
pequeno nicho não tem representatividade no silo. Contudo, caso você o 
construção de ua amostra primára até a expressão numérica do 
resultado 
34 35 
Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição 
final AARO, 2015). Como os resultados podem ser usados para 
Wagner, 2015: Wagner & Ramsey. 2015). O primeiro conhecimento será 
diferentes fins. o conceito de integridade de evidência pode variar em 
acerca das propriedades do material a ser amostrado quanto à sua 
funão dos mesmos. heterogeneidade (de composição e de distribuição). 0 segundo 
Os mateniais avaliados em análise de alimentos para aniais sâo 
conhecimento é denominado de critérios de qualidade de amostragem, 
Cxtremamente plurais em natureza. origem, local e forma de OS quais demandam do analista conhecimento claro do propósito da 
amazenamento e finalidade de aplicação. Usamos forragens, concentrados amostragem e da qualidade necessária dos dados a serem produzidos. Com 
e suplementos minerais: avaliamos alimentos ofertados e sobras; avaliamos a junção funcional de ambos conhecimentos. a teoria de amostragem é 
digestas e fezes coletadas sob diferentes protocolos; monitoramos matérias aplicada, a qual fomecerá as ferramentas cientificas para realização de uma 
primas e produtos finais: tomamos amostras de sacos, carretas, silos amostragem capaz de preservar a representatividade da amostra. Contudo, 
forrageirose graneleiros; etc. Dessa formna, seria praticamente impossível deve ser ressaltado que a aplicação da teoria de amostragem produzirá 
definir procedimentos de amostragem padrão em apenas um Capítulo deste efeitos nulos caso o conhecimento sobre a heterogeneidade do material e 
Manual. Embora sugestões gerais tenham sido apresentadas na primeira Os critérios de qualidade de amostragem não sejam definidos e conhecidos. 
edição domesmo, o comitê organizador desta nova edição optou por A partir da fusão de todos os aspectos. o analista se tormará apto a definir os 
removê-los e deixar a cargo do usuário a busca por protocolos de protocolos de amostragem adequados (Figura 1.5).
amostragem adequados aos seus objetivos. Sugestões de procedimentos 
amostrais podem ser encontrados, por exemplo, em Butolo (2002), FAO Processamento físico de amostras 
(2004), SINDIRAÇÕES (2017) e AAFCO (2018), além de trabalhos 
O processamento fisico da amostra constitui a adequação de um científicos específicos de cada área. Suporte teórico adicional ao aqui 
discutido pode ser obtido em FAO (2013) ou no número especial sobre essa 
amostra laboratorial para as análises em si, convertendo-a em amostra
temática publicado pelo Journal of AOAC International (2015; v.98, n.2). 
analitica. Como a própria definição diz, essa etapa de processamento deve 
Contudo, torna-se imprescindível destacar que, em qualquer restringir-se 
ao campo tisico, sem promover alterações quínicas na 
situação, a definição de um protocolo de amostragem deverá se bascar em amostra (ou. pelo menos, com o mínimo de alteração possível), buscando- 
dois conhecimentos básicos e no uso de uma ferramenta (Ramsey & 
se preservar a integridade de aualito frente ao observado na unidade de 
decisão. O processanento tisico engloba dois gupos distintos de ações, as 
37 36 
NC7iia Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
quais paiem ou nãocomer enm conjunto (e, nonnalhmente, em sequência): 
A desidratação parcial da amostra laboratorial possui alguns
desidratação parcial. também denominada de "pné-sceagem", e objetivos centrais. Em primeiro Iugar. parte das amostras laboratoriais 
processamento mecânico. também denominado de moagem. possuem teor de umidade elevado, o que facilitaria sua deterioração e. 
consequentemente, comprometeria a integridade de analito. Esse 
Confiabilldade 
pertil de amostras laboratoriais é comumente observado para 
Representatlvidade 
forragens in natura, silagens. digestas. material fecal, etc. A 
deterioração poderia, ao menos em tese. ser contornada pela 
CQA TA manutenç�o da amostra sob congelamento. Contudo. esse manejo gera PA 
outro inconveniente, que surge da necessidade de contínuos ciclos de 
descongelamento e recongelamento a cada vez que alíquotas precisam
Erro ser tomadas para realização de algum procedimento analítico. 
Materiais com teor de umidade inferior a 15%, normalmente, não 
necessitam de acondicionamento sob refrigeração, salvo casos 
Heterogeneldade especiais. Dessa forma. reduzir o teor de umidade da amostra
laboratorial facilita o manejo e armazenamento nas rotinas 
laboratoriais. A partir dessas considerações, entende-se que a 
PM desidratação parcial não constitui um procedimento essencial para 
todos os materiais, pois. por exemplo. grãos, farelos e fenos já 
Figura 1.5. Representação sistemática para obtenção de amostras
possuem naturalmente baixo teor de umidade. representativas (CQA, critérios de qualidade de 
amostragem; TA, teoria de amostragem; Por outro lado, materiais úmidos não são propícios 
ao 
PM, 
propriedades do material amostrado; PA, protocolos de 
amostragem). Adaptdado de Ramsey & Wagner (2015) e 
Wagner & Ramsey (2015). A direção das selas coloridas 
processamento mecânico. pois tendem a ser flexíveis e 
resistentes à 
moagem por corte ou por impacto. Obviamente, 
existem processos de 
indica aumento no critério indicado. 
moagem de materiais in natura,
como a moagem criogênica, na qual 
38 39 
iNCT Ciëncia Anial Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição
material congelado a baixíssimas temperaturas passa a adquirir ntegridade de analito em comparação à secagem por frio (Ribeiro et 
resistência fisica suficiente para o processamento mecânico. Contudo, al., 2001; Pelletier et al., 2010;. Jacobs et al.. 2011: Morris et al. 2019). 
entende-se que tais casos constituem exceções nas rotinas Esse comprometimento na integridade de analito ocorre, 
laboratoriais. Assim. a desidratação parcial atribui resistência ffsica normalmente, por duas vias: volatilização e reações não enzimáicas. 
que habilita a amostra laboratorial ao processamento mecânico. A intensidade de volatilização dependerá de duas variáveis principais: 
A desidratação parcial de amostras laboratoriais pode ser concentração de compostos passíveis de volatilizaç�ão e temperatura 
realizada por intermédio de secagem por frio ou por calor. de secagem. Em ambos os casos haverá uma relação diretamente 
Inicialmente, o que devemos entender é que o objetivo é apenas de proporcional com a intensidade do erro de integridade de analito.
reduzir o teor de umidade original do material a níveis que se Por outro lado. as reaçoes não enzimáticas são diretamente 
enquadram nos objetivos descritos anteriormente. Não há, e nem deve mediadas por calor e, comumente, envolvem a junção de compostos 
haver, intenção de retirar toda a água do material. O conceito final de aminoacídicos e de carboidratos não estruturais. Os compostos 
desidratação parcial é normalmente definido por uma amostra seca resultantes de tais reações são denominados de artefatos. Sua 
em equilíbrio com a umidade relativa do ar ou, simplesmente, formação, em geral, resulta em perda de integridade de analito devido 
amostra seca ao ar (ASA). A noção clara desse conceito deve ser à alteração química do pertil de compostos nitrogenados (i.e.
preservada para que os procedimentos adotados na desidratação aminoácidos s�o transtormados em compostos nitrogenados 
parcial sejam aplicados sem equívocos. insolúveis e contabilizados como nitrogênio insolúvel em detergente 
A escolha por frio ou calor dependerá basicamente dos neutro), aumento de compostos insolúveis (os quais podem acarretar
objetivos da análise final, o que definirá o grau de tolerância ao erro aumento da fibra em detergente neutro e lignina) e decréscimo da 
de integridade de analito, e à disponibilidade de infra-estrutura e digestibilidade da anmostra. A ocorrência de reações n�o enzimáticas 
é 
equipamentos. 
ampliada sob temperaturas maiores que 
60°C (Van Soest, 1994), 
A secagem por calor é mais simples e possui menor custo e sendo este o limite máximo do calor a ser recomendado paraa
maior acessibilidade ao aparato necessário. Contudo, a submissão da 
procedimentos de desidratação parcial. 
amostra a calor pOssui maior probabilidade de ocasíonar erro de 
40 
1 
INCT Ciência Aninnal Mélodos para Andlise de Alimentos -2" Edição 
As formas de secagem por calor são variadas, indo desde tamanho do cristal de gelo formado no interior da amostra. Por sua vez, 0 
secagem à sombra em camada delgada até o uso de micro-ondas. tamanho do cristal de gelo é diretamente proporcional à temperatura de 
Contudo, a forma mais rigorosa e indicada consiste no uso de estufa com congelamento. Logo, congelamentos por intermédio de freezeres
circulação forçada de ar, a qual permite o melhor controle das variáveis convencionais não propiciam condições adequadas ao processo de 
fisicas envolvidas na redução do teor de umidade. Embora o forno de liofilizaç�ão, sendo necessários processos mais adequados, como o uso de 
micro-ondas seja atrativo, devido à acessibilidade e rapidez, o controle da nitrogênio líquido ou ultra-freezeres. Isso demanda maior custo e, 
temperatura no interior da amostra não é feito como na estufa. Assim, a consequentemente, maior investimento no processo.
secagem parcial por calor recomendada neste Manual baseia-se no uso de Embora a liofolizaç�o não isente as perdas por volatilização 
estufa com circulação forçada de ar. A base física deste processo de (Morris et al., 2019), é improvável que comprometimentos da integridade 
secagem consiste em imprimir à amostra temperatura superior à do de analito ocorram por reações não enzimáticas. Logo, presume-se que a 
ambiente, mas inferior à temperatura de ebuliç�o da água (i.e., 50-60°C). liofilização seja o padrão ouro do processo de desidrataçãoparcial de 
Isso causa aumento da excitação das moléculas de água, formando um amostras. Contudo, balizamentos entre a tolerância ao erro de integridade 
micro-clima de alta umidade sobre a amostra. Essa umidade é retirada de analito e o custo do processo devem orientar a escolha do método 
com o auxilio da corente de ar e, gradativamente, a água migra do interior adequado neste quesito.
para o exterior da anmostra. O ciclo de migração e retirada da água é Uma vez que a desidratação parcial foi executada (ou não, 
repetido por tempo suficiente para que o teor de umidade demandado seja dependendo da amostra em si), passamos à segunda etapa do 
alcançado. processamento f+sico, o que denominamos de processamento mecânico.
Por outro lado, a secagem por frio trabalha com uma propriedade Os objetivos dessa etapa são claros: reduzir a influencia da 
específica da molécula de água que, sob baixíssimas temperaturas e sob heterogeneidade de composição e adequar a superfície específica da 
vácuo, é capaz de sublimar, ou seja, migrar diretamente do estado sólido amostra analítica ao processo de análise em si. 
para o estado gasoso. Contudo, esse processo, em termos instrumentais, No primeiro caso, temos uma observação clara do objetivo da 
exige o congelamento da amostra sob temperaturas muito baixas (40°C). moagem da amostra. Por exemplo, a análise do teor de nitrogênio por 
A eficiência do processo de liofilização é inversamente proporcional ao intermédio do método de Kjeldahl não detemina nenhum tamanho de 
42 43 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
partícula em especial. Como a amostra será totalmente digerida por um moagem, realize o quarteamento da amostra, reserve uma parte moIda a 
procedimento ácido. não há necessidade de moagem específica em si. 2 mm e destine outra parte para uma nova moagemal mm. 
Contudo, raciocinemos. O que escolher em uma amostra de silagem de Embora haja diversos tipos de moinhos., dois tipos são mais 
milho? Meio grão. uma folha e uma parte de uma sabugo? Obviamete utilizados na análise de alimentos para animais. O primeiro engloba 
que não. Com a moagem. a amostra se torna mais homogênea e muito da alguns modelos de equipamentos que são de forma geral denominados de 
influência devido à sua heterogeneidade de composição é contornado,o moinhos de facas. Suas principais características são: um conjunto de 
que permite a obtenção de porções teste adequadas. lâminas localizadas no rotor central. denominadas de facas: um conjunto 
Por outro lado, há muitas análises que determinam superfícies de lâminas localizadas na parede da câmara de moagem. denominadas de 
específicas para que seus resultados sejam considerados adequados. Por contra-facas; e um mecanismo seletor de tamanho. denominado 
exemplo, a análise de fibra em detergente neutro exige que as amostras peneira. Os moinhos de facas desintegram as amostras por corte. uma vez 
sejam moidas com peneiras de porosidade de 1 mm. Por outro lado, as que o encontro das facas e contra-facas executam ação similar à de 
incubações in situ para ruminantes demandam moagem em peneiras de tesouras. O mesmo foi projetado para materiais macios. como forragens 
porosidade de 2 mm. Assim, antes de se executar o processamento e farelos, não sendo indicada a moagem direta de materiais duros. como 
mecânico, faz-se necessário um correto planejamento considerando-se oSsos e catilagens.
todo o espectro de análises que serão realizadas. Haverá, normalmente, Por outro lado, os moinhos tipo "bola" são compostos por uma 
dois tipos de decisões a serem tomadas. Primeiro, a moagem se baseará câmara de moagem de aço que é deslocada em movimento retilíneo do 
naquela análise que define um tamanho de partículas particular. Segundo, tipo vai-e-vem" contendo uma esfera de aço em seu interior. Com o 
caso haja duas exigências distintas, a moagem deve ser executada em movimento, a esfera se choca com a amostra, reduzindo o tamanho de 
múltiplos estádios. Suponha que seu espectro envolva análises de fibra partículas por impacto. Como não há mecanismo seletor, não há como 
em detergente neutro, incubações in situe proteína bruta por Kjeldahl. A controlar o tamanho final de moagem. Esse tipo de equipamento é 
primeira exige I mm, a segunda 2 mm e a terceira não possui exigências. utilizado na moagem de materiais duros, como ossos, ou na moagem de 
Assim, a primeira instância da moagem será realizada a 2 mm. Após a 
materiais comuns para fragmentação inicial em grão duros para que o 
término do processo de moagem seja realizado em um moinho de facas.
44 45 
Métodos pura Análise de Alimentos -2" EdiçãoINCT Ciência Animal 
Sacos de papel podem ser utilizados como recipientes para Um detalhe relevante no processo de moagem é direcionado a 
amostras com menor teor de umidade como forragens frescas.materiais de alta concentração de gordura. O processo de moagem gera 
Forragens colhidas íntegras (e.g., capins) devem ser previamente calor, causando a fusão de parte da gordura, que forma placase impede a 
seccionadas em fragmentos de 2a3 cm para otimizar a perda de água moagem em ambos os tipos de moinhos. Assim, materiais com mais de 
durante o processo. Para o caso de amostras fecais, de digesta ou 10% de extrato etéreo devem ser parcialmente desengordurados para que 
forragens de alta umidade (e.g., cana-de-açúcar). os recipientes devem
o processamento mecânico seja factível. No caso de grãos de oleaginosas 
(eg., caroço de algodão, grão de soja), os mesmos devem ser 
ser bandejas, as quais, sugere-se, serem cobertas com filmes plásticos 
parcialmente fragmentados em um almofariz e submetidos a um processo (sacolas), que previnem que as amostras fiquem aderidas nas bandejas 
de extração intermitente da gordura (e.g., extraç�o de Soxleth) por seis a para o caso de bandejas de alumínio, previne-se também a 
oito horas. Não se deve esquecer de contabilizar a gordura extraída nesse contaminação da amostra). 
processo para a correta expressão das concentrações a posteriori.
Procedimentos
Redução do teor de umidade em estufa com circulação forçada de ar 
1. Lave os recipientes e deixe secar na estufa a 50-60°C. Se utilizar 
(Método G-001/2) 
saco de papel deixe-o secar por oito horas. Retire da estufa e espere 
Aparatos entrar em equilíbrio com a umidade relativa do ar. Esse 
procedimento é importante para que não haja alteração da tara 
- Balança semi-analítica com precis�o de 0,1 a 0,01 g durante o processo de secagem. pois estamos trabalhando com 
- Bandejas de plástico ou alumínio 
amostras secas em equilibrio com a umidade relativa do ar. 
Sacos de papel 
Sacos plásticos 2. Pese os recipientes e registre os pesos.
- Estufa com circulação forçada dear 
3. Adicione uma amostra em cada recipiente e registre os pesos dos 
recipientes com as amostras. Para o caso de sacos, o volume de 
amostra não deve ultrapassar 50% da altura do saco. A secagem em 
47 46 
NCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
bandejas deve ser realizada conm a amostra em camada delgada (i.e., - Estufa com circulação forçada de ar 
altura da amostra n�o deve ultrapassar 2 cm). - Liofilizador 
Sistema de congelamento (ultra-freezer ou nitrogênio líquido)4. Agite os recipientes com as amostras com suavidade, para 
uniformemente distribuir as amostras e expor o máximo de área à 
Procedimentos 
secagem. 
1. Lave os recipientes e deixe secar em estufa a 50-60°C. Retire da 
5. Coloque os recipientes com as amostras na estufa a 50-60°Ce deixe
estufa e espere entrar em equilíbrio com a umidade relativa do ar. 
secar por 24 a 72 horas. Se o recipiente utilizado for sacos de papel, 
este deve ser disposto com inclinação de 45°, perfurado na face 2. Pese os recipientes e registre os peso0s.
superior (3 a 4 furos feitos com um instrumento perfurante)) e 
permanecer aberto na estufa para otimizar a perda de umidade da 
3. Adicione uma amostra em cada recipiente de modo a obter uma 
camada delgada (alturamácima de 1 a 2 cm). Para o caso de 
amostra.
forragens colhidas íntegras (e.g., capins) devem ser previamente 
6. Retire os recipientes com as amostras da estufa e espere 30 a 40 seccionadas em fragmentos de 2 a 3 cm para otimizar a perda de 
minutos para entrar em equilíbrio com a umidade relativa do ar. água durante o processo. 
Pese-os e registre os pesos. 
4. Registre os pesos dos recipientes com as amostras. 
Redução do teor de umidade por liofilização 5. Agite oS recipientes com as amostras com suavidade, para 
(Método G-002/2) uniformemente distribuir as amostras. 
Aparatos 6. Coloque os recipientes com as amostras em ultra-freezer 
com a 
temperatura igual ou inferior a -40°C e deixe por 8 a 12 horas, 
de 
- Balança semi-analítica com precisão de 0,1 a 0,01 g 
modo a promovera formação de pequenos cristais de gelo.
Parao
Recipientes (bandejas) 
48 49 
INCT Ciencia Animal Métodos para Análise de Alimentos 20 Edição
caso do uso de nitrogênio líquido. propiciem um "banho" sobre 
Seca em equilíbrio com a umidade relativa do ar (g); e %ASA = 
material de forma a obter o congelamento rápido. percentual de "amostra seca ao ar"; 
7. Retire a amostra do ultra-freezer ou após o congelamento em Exemplo de cálculo 
nitrogênio líquido e coloque imediatamente no liofilizador por, no 
mínimo, 24 horas. Considerando a aliquota 1 da tabela a seguir, tem-se o cálculo 
da estimativa da "amostra seca ao ar 8. Retire as amostras do liofilizador, espere 40 minutos para entrar em 
equilíbrio com a umidade relativa do ar, pese e registre os pesos. MN=(T+MN)-T=314,71-9,60=305,11g 
Cálculo da concentração de "amostra seca ao ar" ASA=(T+ASA) -T=104,63-9,60=95,03 g 
Para o cálculo da concentração de amostra seca ao ar, use as 6ASA=x100 x100=31,15% 
305,11 
ASA 95,03 
MN equações: 
MN=(T+MN)-T Alíquota 
Item 
ASA=(T+ASA)-T Tara (g) 9,60 9,36 9,14 
Tara +MN (g) 314.71 385,74 372,10 
ASA 
%ASA=TX100 MN () 305,11 376,38 362,96 
Tara + ASA (g) 104.63 130,03 122,97 
em que: MN = massa de amOstra em termos de matéria natural (g); T 
ASA (g) 95.03 120.67 113,83 
%ASA 3115 32,06 31,36 = tara ou peso do recipiente utilizado (g); ASA = massa de amostra
%ASA (média) 31,52 
50 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição INCT Ciência Animal 
JOINT COMMITTEE FOR GUIDES IN METROLOGY - JCGM. JCGM Literatura Citada 100:2008. Evaluation des données de mesure -Guide pour l'expression 
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53 52 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" EdiçãoINCT Ciência Animal 
Capítulo 2 
Secagem definitiva e matéria seca 
Definições básicas 
O teor de umidade residual de uma amostra manejada em 
laboratório representa a umidade remanescente em um alimento 
úmido após sua desidratação parcial em estufas com ventilação 
forçada ou liofilizadores, ou a umidade total de alimentos com baixo
teor de umidade, como grãos e farelos. Essa umidade érotineiramente 
representada, por seu complemento, denominado "amostra seca em 
estufa" (ASE), em virtude da maior facilidade dos cálculos posteriores 
para quantificação dos teores dos componentes químicos nas 
amostras. 
Os teores de ASE de alimentos são normalmente obtidos no 
Brasil por intermédio da secagem em estufas isentas de ventilação 
forçada sob temperaturas iguais ou superiores à temperatura de 
ebulição da água (Silva & Queiroz, 2002). Contudo, diferentes 
binômios tempo x temperatura podem conduzir a diferentes 
resultados, com alta possibilidade de interação com amostras de 
diferentes origens e composições (Thiex & Richardson, 2003). 
54 55 
Métodos para Análise de Alimentos -2" Ediçdo
INCT Ciência Animal 
Tabela 2.1. Exemplo teórico da influéncia das variações do teor de A quantificação da ASE é uma das medidas mais importantes ASE na composição química de alimento volumoso
e utilizadas na análise de alimentos. pois a umidade de um alimento
Composição Laboratório" Diferencial está relacionada com sua estabilidade. qualidade e composição, 
Item teórica (% (2-1:%)
podendo afetar a estocagem, a embalagem e o processamento dos 
ASE 89,79 95.00 +5.8 alimentos (Cecchi. 2003). 
PB 8.91 8.42 -5,5 Em termos de rotina laboratorial, o correto conhecimento do 
EE 3.34 3.16 -5.4 teor de ASE nas amostras se mostra adicionalmente relevante, uma 
FDNcp 55 61.25 57.89 -5. vez que estas são manejadas na base seca ao ar, ou seja, ainda contendo
MM 5.57 5.26 -5.6 umidade. Desta forma, devido à impossibilidade de manejo de 
CNF3 20,93 25,2 +20,7 amostras totalmente secas, o teor de ASE é utilizado para correta
ASE, "amostra seca em estufa": °B. proteína bruta: EE. extrato etéreo;
FDNcp, fibra em detergente neutro corrigida para cinzas e proteína: MM, 
matéria mineral; CNF, carboidratos não fibrosos. Composição assumida
hipoteticamentecom base na amostra seca ao ar para uma amostra de silagem
de milho. CNF = 100-(PB + EE + FDNcp + MM). Composição ajustada 
para a matéria seca. Os cálculos consideram as diferenças entre dois 
laboratórios quanto à estimativa de ASE. Para maiores detalhes, favor
consultar Souza et al. (2015).
expressão dos teores obtidos com base na matéria seca (MS) da 
amostra. Assim, por constituir denominador comum a todos os demais 
procedimentos laboratoriais, erros cometidos na quantificação dos 
teores de ASE tornam-se vícios ou eros sistemáticos em todas as 
avaliações, propagando-se, desta forma, ao entendimento global de 
todas as demais características do alimento (Mertens, 2003; Souza et 
al., 2015; Tabela 2.1). Observa-se que diferenças entre os teores de ASE se projetam 
em magnitudes similares, mas em direções opostas, sobre os 
componentes químicos analisados diretamente (Tabela 2.1). Contudo, 
os vícios imputados sobre estes componentes são potencializados 
sobre o teor do componente estimado por diferença, neste caso 
carboidratos não-tibrosos. uma vez que este absorverá todos os erros 
associados com os teores dos componentes químicos analisados 
56 57 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" EdiçãoINCT Ciência Animal 
3. Coloque-os em dessecador devidamente preparado (máximo de 20 diretamente em mesma intensidade, mas com direção oposta 
(Detmann & Valadares Filho, 2010). unidades por procedimento), a fim de esfriá-los. A principal função 
de um dessecador é permitir o resfriamento das amostras após o 
Secagem em estufa sem ventilação forçada de ar período de secagem sem absorver umidade, via uso de um 
(Método G-003/1) dessecante, como a sílica gel. De forma particular, a sílica-gel é 
Aparatos sugerida devido ao seu baixo custo, à facilidade de manejo e à 
possibilidade de reciclagem e reuso. Assim, o dessecador deve estar
- Balança analítica com precisâo de 0,0001g sempre limpo, seco e possuir sílica gel na tonalidade azul escuro
- Dessecador 
em seu interior. A área de contato entre o corpo do dessecador e sua 
- Pesa-filtros 
tampa deve ser levemente lubrificada com graxa de silicone de 
- Estufa sem circulação forçada de ar 
forma a permitir um deslizamento adequado e melhorar a vedação 
Procedimentos durante o período de resfriamento. 
1. Use balança analítica aferida pelo INMETRO, com precisão de 
4. Após estabilização com a temperatura ambiente (normalmente em 
0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente torno de 30 minutos), pese os recipientes, removendo um de cada 
climatizado (20-25°C ou de acordo com as especificações do vez do dessecador. As tampas são pesadas em conjunto com os 
fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua recipientes. 
estabilização. 
5. Adicione aos pesa-filtros aproximadamente 2 gramas da amostra
2. Lave os pesa- filtros e deixe secar em estufa a 105°C por 16 horas 
seca ao ar (preferencialmente moída em peneira de porosidade 1 
("uma noite"); caso estes estejam limpos, deixe por 2 horas na mm). Agite os recipientes com as amostras com suavidade paraa 
estufa a 105°C. Atentar para que os pesa-filtros permaneçam distribuir uniformemente as amostras e expor o máximo de área à 
sempre abertos quando colocados na estufa e com as tampas quando secagem.
no dessecador. 
58 59 
Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição INCT Ciencia Animal 
Exemplo de cálculo
6. Leve os pesa-filtros com amostras e pesos conhecidos à estufa 
a 
105°C por 16 horas ou "uma noite" com a tampa aberta. 
Considerando a aliquota 1 da tabela abaixo, têm-se o cálculo
da estimativa da "amostra seca em estufa":7. Após a permanência na estufa, coloque os conjuntos pesa-filtro 
+ 
amostra novamente no dessecador e aguarde a estabilização com a 
temperatura ambiente, pese e registre os pesos. Durante a ASA=(PF+ASA)-PF=36,0057-33,9467=2,0590 g 
permanência no dessecador e a pesagem os pesa-filtros devem 
permanecer fechados. ASE=(PF+ASE)-PF=35,9195-33,9467=1,9728 g 
ASE 
%ASE=CAXL0 2.0590 
1,9728 x100-95,81% Cálculo da concentração de "amostra seca em 
estufa" 
ASA 
Para o cálculo da concentração de "amostra seca em estufa", 
use as equações: Aliquota 
Item 
ASA=(PF+ASA)-PF 
PF (g) 33,9467 34,1165 32.6543 
ASE=(PF+ASE)-PF PF+ASA (g) 36,0057 36,1062 34.5888
PE+ ASE () 35,9195 36,0244 34.5090
%ASE=c x100 
ASA 
ASE ASA (g) 2,0590 1,9897 1.9345
ASE (g) 1.9728 1,9079 1.8547 
%ASE 95,81 95,89 95.87
em que: ASA = massa de amostra seca ao ar (g); PF 
= peso do pesa 
%ASE (média) 95,86filtro (g); ASE = massa de "amostra seca em estufa" (g); %ASE 
= 
percentual de "amostra seca em estufa". 
60 61 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
INCT Ciencia Animal 
Considerando-se as médias de %ASA (Capítulo 1) e de %ASE 
Cálculo da concentração de matéria seca 
obtidas nos exemplos, temos: O cálculo da concentração da matéria seca (MS) é realizado 
%ASAX%ASE 31,52x95,86 
considerando-se o número de etapas envolvidas na secagem das amostras. 
6MS= = 30,22%
100 100 
Para amostras com baixo teor de umidade, como é o caso de 
grãos. farelos e fenos, a umidade é avaliada somente por intermédio 
Literatura Citadada ASE. Logo, o teor de MS corresponde ao teor de ASE; ou seja: 
CECCHI, H.M. Fundamentos teóricos e práticos em anáise de alimentos. 
2 ed. Campinas: Editora da Unicamp, 2003. 207p.
%MS=%ASE 
DETMANN, E.; VALADARES FILHO, S.C. On the estimation of non- 
fibrous carbohydrates in feeds and diets. Arquivo Brasileiro de Medicina 
Veterináriae Zootecnia, v.62, p.980-984, 2010. 
em que: %MS = percentual de matéria seca; %ASE = percentual de 
"amostra seca em estufa". 
MERTENS, DR. Challenges in measuring insoluble dietary fiber. Journal
of Animal Science, v.81, p.3233-3249, 2003. 
Amostras com alto teor de umidade, como é o caso de 
SILVA, D.J.; QUEIROZ, A.C. Análise de Alimentos. Métodos químicos e 
biológicos. 3 ed. Viçosa: Editora UFV, 2002. 235p. 
silagens, forragens frescas, etc., a umidade do material é retirada em, 
ao menos, dois procedimentos de secagem (estufa com ventilaç�o 
SOUZA, M.A.; DETMANN, E.; VALADARES FILHO, S.C.; FRANCO, 
M.O.; ROCHA, G.C.; CABRAL, L.S. Estudo colaborativo para avaliaç�ão 
dos teores de matéria seca em alimentos. Revista Brasileira da Saúdee
Produção Animal, v.16, p. 617-631, 2015. 
forçada ou liofilizador e estufa sem ventilação forçada). Logo, o teor 
de MS é dado pela ponderação dos resultados obtidos nos 
THIEX, N.; RICHARDSON, C.R. Challenges in measuring moisture content
of feeds. Journal of Animal Science, v.81, p.3255-3266, 2003. 
procedimentos sequenciais de secagem, ou seja:
%ASAx%ASE 6MS=- 
100 
em que: %MS = percentual de matéria seca; %ASA = percentual de 
"amostra seca ao ar" (ver Capítulo 1); %ASE = percentual de "amostra
seca em estufa". 
63 62 
INCT Ciência Animal
Métodos para Análise de Alimentos -20 Ediç lição 
Capítulo 3 
Matéria mineral
Definições básicas 
A matéria mineral (MM), ou cinzas, é constituída pelo resíduo
inorgânic0 obtido após a queima ou ignição da matéria orgânica,a 
qual é convertida em CO2, H20, SO2, N02, etc; e eliminada em 
conjunto com as substâncias voláteis decompostas pelo calor 
(Harbers, 1998). O método consiste basicamente na incineração do 
alimento em altas temperaturas por temp0 suficiente para que ocorra 
combustão total da matéria orgânica (Silva & Queiroz, 2002; Cecchi,
2003). 
Sendo a matéria seca total do alimento formada pelas frações
orgânica e inorgânica, o teor de MM em alimentos constitui estimador 
totais.organicosS indireto do conteúdo de componentes 
Adicionalmente, o conhecimento do teor de MM se faz necessário 
para se conhecer a proporção dos componentes quantificados por 
diferença em alimentos, como o extrativo não nitrogenado, os 
carboidratos não-fibrosos e a matéria orgânica residual (ver Capítulo
9) 
6 64 
INCT Cí
ncia Animal Métodos para Análise de Alinentos - 2" Edição 
Atualizações Método da queima em mufla
(Método M-001/2)
O método anterior (M-001/1) foi modificadono tocante a dois 
aspectos. Primeiro, devido à possibilidade de volatização de minerais Aparatos
(e.g.. Na. K. Mn. Zn) e. consequentemente, subestimação da MM 
- Balança analítica com precisão de 0,0001g(Rowan et al. 1982: Thiex et al., 2012), procedeu-se à reduç�ão da 
- Dessecador 
temperatura de ignição e ajustamento do tempo total de queima. 
- Cadinhos de porcelana (abertura mínima sugerida de 18-20 cms) Adicionalmente. a busca por maior eficiência no processo de 
Estufa sem circulação forçada de ar 
quantificação demandou a padronização qualitativa do resíduo obtido. 
- Forno mufla com temperatura controlada 
Assim. o resíduo considerado adequado após ignição deve se 
apresentar claro, sem indicações claras de retenção de carbono 
Procedimentos 
residual (Thiex et al., 2012). Nesse sentido, caso o material apresente 
se com colaração cinza escuro ou enegrecido após o primeiro período 1. Use balança analítica aferida pelo INMETRO, com precisão de 
de queima, introduziu-se etapa adicional que envolve a aeração do 0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente 
ambiente (i.e., entrada de oxigênio) interno da mufla, seguida de um climatizado (20-25°C ou de acordo com as especificações do 
segundo período de queima, o qual espera-se auxiliar na eliminação fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua 
dos resíduos de matéria orgânica. Este procedimento constitui uma estabilização. 
adaptação das sugestões apresentadas por Thiex et al. (2012). 
2. Lave os cadinhos de porcelana e os deixe secar em estufa a 105°C
por 16 horas ("uma noite"). Caso os cadinhos de porcelana sejam 
novos ou não sejam utilizados exclusivamente para avaliação de 
MM é recomendável que os nmesmos passem por procedimento de 
incineração previamente ao seu uso (ver passos 6a 8). 
66 67 
INCT Ciicia Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2* Edigão 
3. Coloque-os em dessecador devidamente preparado (máximo de 20 que se garanta resíduo mensurável de acordo com a sensibilidade 
unidades por procedimento). a fim de esfriá-los. A principal função analítica. 
de um dessecador é permitir o resfriamento das amostras após o 
6. Acondicione os cadinhos contendo as amostras na mufla. Após ligar periodo de secagem sem absorver umidade, via uso de um 
o equipamento, aguarde que o mesmo alcance a temperatura de dessecante. como a sílica gel. De forma particular, a sílica-gel é 
550°C. E desejável uma rampa de aquecimento de I hora para que sugerida devido ao seu baixo custo, à facilidade de manejo e à 
a temperatura de ignição seja alcançada. possibilidade de reciclagem e reuso. Assim, o dessecador deve estar 
sempre limpo, seco e possuir sílica gel na tonalidade azul escuro 7. Proceda à queima por 3 horas a 550°C. Após este termpo, desligue a 
em seu interior. A área de contato entre o corpo do dessecador e sua mufla e deixe que a mesma resfrie fechada. A temperatura de retirada
tampa deve ser levemente lubrificada com graxa de silicone de deve estar entre 150 e 200°C. 
forma a pernmitir um deslizamento adequado e melhorar a vedação 
durante o período de resfriamento. 8. Caso os resíduos após ignição estejam claros, coloque os cadinhos de 
porcelana no dessecador, deixe estabilizar com a temperatura 
4. Após estabilização com a temperatura ambiente (normalmente em ambiente. Siga as instruções gerais de uso do desseacador descritas no 
tormo de 30 minutos), pese os cadinhos, removendo-0S um de cada passo 3. Pese e registre os pesos. 
vez do dessecador, mantendo-o fechado entre as remoções dos 
9. Em caso de resíduos cinza escuro ou enegrecidos, mantenha a porta da 
recipientes. 
mufla aberta por alguns minutos para garantir um suprimento de ar 
5. Adicione nos cadinhos aproximadamente 2 gramas de amostra seca freseo e repita o procedimento de queima por 3 horas. Deixe resfriar 
ao ar (preferencialmente moída em peneira de porosidade I mm). mova-os para o dessecador e pese como descrito nos passos 7 e 8. 
A massa de amostra pode variar em função da sensibilidade 
analítica. Materiais com alto teor de minerais podem ser avaliados 
com menor massa de amostra, ao passo que materiais com baixo
teor de minerais deverão ser avaliados com maiores alíquotas para 
69 
A 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição INCT Ciência Animal 
Cálculo da concentração de matéria mineral 
MM 0,1100 
oMIMASA=ACAX100=02X100=5,25% 
Para o cálculo da concentração de matéria mineral, siga as 
cquações /%MM ASA100 95,36 5,25 
x100=5,48% %MMMs %ASE 
MM=(CAD+MM)-CAAD 
AlíquotaMM 
96MMASAASA100 Item 2 
CAD() 36,6347 37,5441 37,7170
96MMMs= %MMASAx100 CAD ASA (g) %MMMs %%ASE 38,7285 39,9254 39,7216 
ASA (9) 2,0938 2,3813 2,0046 
CAD+MM (g) 36,7447 37,6701 37,8223 em que: MM = massa de matéria mineral (g); CAD = peso do cadinho 
MM (g) 0,1100 0,1260 0,1053 
(g); oMMASA = percentual de matéria mineral com base na amostra
%MMASA 5,25 5,29 5,25 
seca ao ar; ASA = massa de amostra seca ao ar (g); 6MMus = 
oASE 95,86
percentual de matéria mineral com base na matéria seca; %ASE = 
ToMMMs 5,48 5,52 5,48 
percentual de ""amostra seca em estufa". 
TOMMMs (média) 5,49 
Exemplo de cálculo 
Considerando a aliquota 1 da tabela a seguir, tem-se o cálculo 
da estimativa da matéria mineral: 
ASA=(CAD +ASA)-CAD=38,7285-36,63472,0938 g 
MM=(CAD+MM)-CAD=36,7447-36,6347=0,1100 g 
70 
71 
Mélodos para Análise de Alimentos 2" Edição 
INCT Ciência Animal
Literatura Citada 
Cálculo da concentração de matéria orgânica
CECCHI, H.M. Fundamentos teóricos e práticos em análise de alimentos. 2 ed. Campinas: Editora da Unicamp. 2003. 207p.
Por definição, o teor de matéria orgânica (MO) de um 
HARBERS, L.H. Ash analysis. In: NIELSEN S.S. (Ed.). Food analysis. 2 ed. West Lafayette: Aspen Publishers. 1998. p.141-150. 
alimento corresponde ao complemento da porção inorgânica deste, a 
qual é representada pela MM; logo: 
ROWAN, C.A.; ZAJICEK. O.T.: CALABRESE. E.J. Dry ashing vegetables for the determination of sodium and potassium by atomic absorption 
spectrometry. Analytical Chemistry. v.52. p. 149-151. 1982. 
%MOMS=100-6MMMs 
SILVA, D.J.: QUEIROZ. A.C. Análise de alimentos. Métodos quimicos e 
biológicos. 3 ed. Viçosa: Editora UFV, 2002. 235p. 
em que: TMOMs = percentual de matéria orgâânica com base na 
THIEX, N.; NOVOTNY. L.: CRAWFORD. A. Determination of ash in 
animal feed: AOAC official method 942.05 revisited. Journal of AOAC 
matéria seca; %MMns = percentual de matéria mineral com base na 
matéria seca. 
International, v.95. p. 1392-1397, 2012. Para o caso do valor médio obtido previamente, tem-se:
Literatura Adicional 
%MOMS 100-%MMMS=100-5,49-94,51% 
SOUZA, M.A.; DETMANN. E.: BATISTA. E.D: FRANCO. M.O. 
VALADARES FILHO. s.C.: PINA. D.S.: ROCHA. G.C. Estudo 
colaborativo para avaliação dos teores de matéria mineral em alimentos.
Revista Brasileira de Saúde e Produção Animal, v.18. p.62-75, 2017.
73 12 
Mélodos para Análise de Alimentos 2" Edição NUT Cncia Animal
Capítulo 4 
Nitrogênio (proteína bruta) 
Definiçoes básicas
A nutrição proteica de animais de produção deve ser baseada
no provimento de aminoácidos (i.e.. proteína) em quantidades 
suficientes e em proporções adequadas no intestino delgado de forma
a suprir a demanda destes compostos para síntese e para renovação de 
tecidos n0 organismo animal. Assim, a aplicação dos conceitos de 
nutrição proteica envolve simultaneamente a definição de parâmetros 
químicos (i.e., concentração e composição da proteína dos alimentos) 
e biológicos (i.e., eficiência dos eventos de absorção e utilização 
metabólica). Considerando-se as características químicas da nutrição 
proteica, define-se por questões lógicas que as avaliações dos 
alimentos devem ser centradas sobre a quantificação das 
concentrações e proporções dos aminoácidos, principalmente 
daqueles considerados essenciais aos animais (Detmann et al., 2014).
Os métodos analiticos para avaliação de aminoácidos em 
alimentos são relativamente recentes, tendo sido consolidados nasúltimas décadas do século XX. No entanto, apesar da evolução
apresentada pela química instrumental, tais métodos possuem ainda
75 
NCT Ciencia Animal Mélodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
difusão limitada devido à complexidade e ao alto custo. Assim, A PB permanece atualmente como forma modal de avaliação 
considerando-se tais limitações, faz-se necessária a utilização de proteica aplicada às diferentes espécies animais. Isso se dá 
métodos alternativos, os quais. mesmo não produzindo informações principalmente em virtude de sua simplicidade conceitual e da 
perfeitamente refinadas frente àquelas demandadas para a aplicação praticidade e rapidez na obtenção de estimativas em laboratório 
dos principios de nutrição proteica. podem produzir resultados com (Detmann et al., 2014). No entanto, o conceito PB possui limitações 
maior rapidez e menor custo para tomar possível a inserção de um que devem ser compreendidas para o estabelecimento de limites para 
alimento em um sistema de produção. sua aplicaç�o em sistemas de alimentação animal. Em primeirolugar
Uma das principais características químicas que distingue os embora a correlação original (quanto mais proteína mais N) seja 
compostos proteicos de carboidratos e lipídeos é a presença de um quimicamente perfeita, sua forma inversa (quanto mais N mais 
grupamento amino ligado ao carbono oa dos aminoácidos. Em outras proteína) não sustenta a perfeição na associação. A presença de N 
palavras, define-se a presença obrigatória do elemento nitrogênio (N) constitui propriedade química comum a diversos compostos orgânicos 
nas cadeias peptídicas. Dessa forma, pode se afirmar que há uma e inorgânicos. Desta forma, embora todas as proteínas possuam N em 
correlaç�o forte e positiva entre a concentração proteica e a sua composição, nem todo N presente na amostra se origina de 
concentração de N em alimentos. Com base na forma reversa desta compostos proteicos. 
correlação foram estabelecidos os princípios da avaliaç�o proteica de A avaliação da concentração de N é modalmente realizada 
alimentos no século XIX, nos quais a concentração de N poderia ser pelo método de Kjeldahl, o qual é amplamente utilizado devido à sua 
utilizada como preditor da concentração proteica. Assim, procede-se simplicidade e baixo custo. Este método foi desenvolvido por Johann 
à quantificação da concentração de N, a qual permite expressar a Kjeldahl, na Dinamarca em 1883, quando estudava proteína em grãos 
concentraç�ão de proteína na forma de equivalentes proteicos, os quais (Pomeranz & Meloan, 1978). O método original sofreu diversos 
são comumente conhecidos como proteína bruta (PB). O conceito de aperfeiçoamentos, possuindo atualmente diversas variações 
de 
PB foi incorporado àos pressupostos de composição de alimentos procedimentos (Windham, 1998; Silva & Queiroz, 2002; 
Faithfull, 
previamente estabelecidos pelo sistema de avaliaão proximal de 2003; Chang, 1998; Buftler, 2017). Contudo, de 
forma geral, este se 
Weende. 
76 11 
CTCineid Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
baseia cm tres etapas analiticas distintas: digestão, destilaçãooe Atualizações 
titulação. 
As atualizações estabelecidas para a avaliação do N total A digestão baseia-se no aquecimento da amostra com ácido 
envolveram basicamente a otimização no uso de reagentes, o que sulfürico até que os compostos orgânicos sejam oxidados. 0 
permite redução de custos e de resíduos produzidos. Especificamente nitrogênio da proteina (orgânico) é retido na forma de sulfato de 
os trabalhos conduzidos por Rodrigues et al. (2018) e Costa et al. amônia (inorgânico). que constitui substância estável em meio ácido.
(2019) visaram a avaliação de ajustes na quantidade e concentraç�ão de 
porém não facilmente quantificável. Nessa etapa utiliza-se uma 
reagentes nas etapas de destilação e titulação do método de Kjeldahl. 
mistura digestora. composta de um sal (sulfato de sódio ou de 
Adicionalmente. a etapa de digestão foi avaliada por Silva et al. 
potássio). com a finalidade de elevar o ponto de ebulição do ácido
(2016), cuja principal contribuição consistiu em verificar efeitos
sulfúrico permitindo a decomposição da matéria orgânica, e um 
negativos do excesso de cobre sobre a quantiticação do N total em 
catalizador metálico que aumen' :0 poderde oxidação do meio (Silva 
tecidos animais. Reconhecidamente. o método de Kjldahl possui
& Queiroz. 2002: Thiex et al.. 2002). Em seguida, adiciona-se 
limitações inerentes associadas à liberação do N associado a estruturas 
hidróxido de sódio concentrado e aquece-se para a liberação da 
orgânicas heterocíclicas (Simmone et al.. 1997; Etheridge et al., 1998). 
amônia em solução de ácido bórico, formando borato ácido de amônio,
Alguns compostos nitrogenados heterociclicos podem ser formados a 
que constiui composto nitrogenado de fácil volatilização, mas 
partir de reações não-enzimáticas envolvendo creatina, aminoácidos facilmente mensurável. 0 borato de amônia formado é titulado com 
livres e monossacarideos. A digestão pode ser tornar ainda mais dificil 
uma solução padronizada de ácido clorídrico, permitindo, assim, a 
quando amostras com alto teor de gordura são aquecidas (Johansson 
mensuração do N oriundo da amostra (Silva & Queiroz, 2002) e a 
&Jigerstad, 1996; Skog. et al., l1998). lons cobre e ferro podem atuar
expressão da proteína da amostra na forma de equivalentes proteicos. 
como catalizadores de reaçöes para formação de compostos como 
pirazinas e piridinas, as quais são precursores de compostos 
heterocíelicos (Parihar et al.. 1981; Jügerstad et al.. 1998).
Adicionalmente, a liberaqão de radicais livres (o que ocorre com 
a 
adição de cobre ao meio de digestão) pode 
inerementar a formação de 
79 18 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
compostos nitrogenados heterocíclicos (Johansson & Jägerstad, Reagentes 
1996). Assim, a redução de cobre melhora a recuperação do N a partir
- Acido sulfúrico (H2SO4) concentrado P.A. 
de amostras de origem animal. sem comprometer a recuperação em 
- Ácido clorídrico (HCI) 37% P.A. 
outros tipos de amostras e conm impacto mínimo sobre o tempo de Acido bórico (H,BO,) P.A. 
digestão (Silva et al.. 2016). 
- Carbonato de sódio (NaCO;) anidro P.A. 
- Hidróxido de sódio (NaOH) em escamas ou micropérolas P.A. Método de Kjeldahl 
Sulfato de sódio (Na,SO.) ou potássio (KSO) P.A. (Método N-001/2) 
Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4. 5H:0) P.A. 
Aparatos Verde de bromocresol P.A. 
Vermelho de metila P.A. 
- Conjunto para digest�o e destilação - bloco digestor e destilador por Álcool etílico (CH,CH:OH) anidro P.A. (etanol absoluto) 
arraste de vapor 
- Capela com exaustão
Soluções
Balança analítica com precisão de 0,0001 g 
Solução-padrão de ácido clorídrico a 0.005 N 
- Tubos de digestão em borossilicato com orla 
Dilua 0,414 mL (4,14 mL) de HC1 37% P.A. em balão volumétrico 
Bureta de 50 mL com graduação de 0,1 mL 
de 1 L (10 L), contendo em média 500 mL (5 L) de água destilada. 
Erlenmeyers de 250 mL 
Deixe esfriar, complete o volume e homogenize a solução.- Pipetas 
Balões voluméiricos 
Solução-padrão de ácido clorídricoa 0,02 N 
Bicosde papagaio com reservatório - Dilua 1.66 mL (16,6 mL) de HCl 37% P.A. em balão volumétrico de 
Erlenmeyer de 4 L 
IL (10 L), contendo em média 500 mL (5 L) de água destilada. 
Deixe esfriar, complete o volume e homogenize a solução.
80 
INCT Ctência Anima Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
Solução-padrão de ácido clorídrico a 0,05 N Em um pote de polietileno adicione o sal (sulfato de sódio ou 
Dilua 4.14 mL (41.4 mL) de HCI 37% P.A. em balão volumétrico de potássio) eo catalizador metálico (sulfato de cobre) na proporção de 
1L (10 L). contendo em média 500 mL (5 L) de água destilada. 20 para 1, respectivamente (i.e., para cada 1000 g de sulfato de sódio
Deixe esfriar, complete o volume e homogenize a solução. ou potássio use 50 g de sulfato de cobre). Misture até a completahomogeneização. O material deve ser armazenado em pote com 
Solução alcoólica de vermelho de metila (1 g/L) 
tampa. 
- Em um balão de 100 mL com cerca de 60 mL de álcool etílico 
absoluto, dissolva 0,l g de vermelho de metila. Complete o volume Solução de ácido bórico (20 g/L) 
com etanol e homogenize a solução. - Dissolva em um balão volumétrico de 1 L (10 L), contendo cerca de 
Solução alcoólica de verde de bromocresol (1 g/L) 
500 mL (5 L) de água destilada, 20 g (200 g) de ácido bórico P.A. 
- Em um balão de 100 mL com cerca de 60 mL de álcool etílico 
Adicione 12,5 mL (125 mL) da solução alcoólica de vermelho de 
metila e 6 mL (60 mL) da solução alcoólica de verde de bromocresol. 
absoluto, dissolva 0,1 g de verde de bromocresol. Complete o 
volume com etanol e homogenize a soluç�o.
Agite até a completa solubilização e complete o volume com água 
destilada. 
Solução de hidróxido de sódio (400 g/L) 
Padronização da solução-padrão de ácido clorídrico 
- Em frasco erlenmeyer de 4 L adicione 2 L de água destilada. 
Adicione 1600 g de NaOH P.A. Agite a solução e adicione mais 1 L Devido à natureza volátil do ácido clorídrico concentrado e a 
de água destilada. Agite até a completa solubilizaç�o. Deixe em erros na mensuração do volume exato de ácido no preparo das 
repouso até que resfrie e então complete o volume para 4 L. soluçöes, desvios da normalidade esperada do ácido diluído ocorrerão. 
Dessa forma, a cada partida de ácido preparada, há necessidade 
Mistura digestora (catalítica) 
imperiosa de conhecer os erros cometidos de forma a evitar que os 
- Em separado, peneire (peneira com porosidade de 1 mm) o sulfato mesmos se propaguem para a quantificação do N presente na amostra. 
de sódio ou potássio P.A. e o sulfato de cobre pentahidratado P.A. 
3 82 83 
INCT Ciência Animnal 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
Acido cloridrico 0,02N 
Esse processo é conhecido como padronização das soluções de ácido
clorídrico. 
Os procedimentos são os mesmos descritos anteriormente, apenas modificando-se a concentração da solução de carbonato de sódio 
Acido cloridrico 0,005 N 
(1,06 g/L). A titulação é feita como ácido clorídrico 0.02N. 
- Acondicione o carbonato de sódio P.A. em placa de petri e mantenha 
Acido clorídrico 0,05 N 
em estufa não ventilada a 105°C por 4 horas. Retire e acondicione 
em dessecador até o resfriamento. 
- Os procedimentos são os mesmos descritos anteriormente. apenasApós o resfriamento, pese 0,.265 g de carbonato de sódio P.A. e modificando-se a concentração da solução de carbonato de sódio 
2,65 g/L). A titulação é feita com o ácido cloridrico 0,05 N. 
transfira para um balão volumétrico de 1000 mL contendo
aproximadamente 500 mL de água destilada. Agite até a completa 
Embora a padronização de uma solução de ácido clorídrico solubilização. Complete o volume e homogenize. 
possa ser feita com qualquer uma das soluções de carbonato de sódio, Usando uma pipeta volumétrica, transfira 20 mL desta solução de 
sugere-se o uso de soluções específicas para cada ácido a fim de carbonato de sódio em um erlenmeyer de 250 mL e adicione cinco 
facilitar os cálculos e interpretações. Nesse sentido, usando-se as gotas de solução alcoólica de verde de bromocresol. 
soluções específicas para cada concentração de ácido clorídrico. o - Titule com a solução de ácido clorídrico 0,005 N até a viragem (de 
cálculo da normalidade verdadeira da solução de ácido clorídrico é azul para amarelo). 
dado por: Aqueça erlenmeyer até a ebulição a fim de eliminar o CO 
Vc x Nc dissolvido no meio. Caso haja o retorno à coloração azul, continue 
Nv: = 
Va a titulaç�o até a coloração amarela. Repita essa operação até que a 
Nv 
coloração amarela seja permanente. 
fNe Aconselha-se que ao menos três alíquotas sejam feitas. O resultado 
final (volume de ácido demandado na titulação) será dado pela 
em que: Nv = normalidade verdadeira da solução de ácido clorídrico: 
média das alíquotas avaliadas. 
Ve = volume da solução de carbonato de sódio (no cas0 deste
85 84 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
INCT Ciência Animal
Procedimentos procedimento 20 mlL): Nc = normalidade da solução de carbonato de 
sódio (no caso deste procedimento, as soluções específicas de 1. Use balança analítica aferida pelo INMETRO. com precisão de 0.0001carbonato de sódio possuem a normalidade esperada da solução de 
g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente climatizado ácido clorídrico, ou seja. 0.005: 0.02 e 0.05 N. respectivamente): Va (20-25°C ou de acordo com as especificações do fabricante). Ligue a = volume da solução de ácido clorídrico gasto na titulação da solução balança e aguarde 30 minutos para sua estabilização. de carbonato de sódio (mL); f= fator de correção da normalidade do 
2. Lave os tubos de digestão e deixe secar em estufa não ventilada. ácido cloridrico (i.e. fator multiplicativo que converte a normalidade 
esperada em normalidade verdadeira); e Ne = normalidade esperada 3. Pese de 150 a 300 mg de amostra seca ao ar e acondiciene em tubo de 
da solução de ácido clorídrico (i.e., a normalidade que se espera obter ensaio devidamente identificado. A massa de amostra varia em função 
ao preparar a soluç�ão: 0,005; 0,02 ou 0,05 N). 
do teor de N da mesma. Materiais com baixo teor de N deverão ser 
avaliados com alíquotas de maior massa (mais próximo a 300 mg). ao 
Exemplo de cálculo
passo que materiais com alto teor de N poderão ser avaliados 
utilizando-se alíquotas de menor massa (mais próximo a 150 mg). Considerando um volume médio da solução de ácido
clorídrico (0,02 N) gasto na titulação da solução de carbonato de sódio 
4. Adicione 2 gramas da mistura digestora e 5 ml de ácido sulfúrico 
de 21,3 mL, têm-se: 
P.A. concentrado. 
5. Coloque os tubos em bloco digestor e aqueça lentamente até atingirVcx Nc 20 x 0,0L 0.0188NNv= 
21,3 a temperatura de 400°C. Mantenha nesta temperatura até que 
aa Va 
solução fique translúcida. A coloração poderá 
variar de verde a 
azul. O bloco digestor deve permanecer em capela com o 
exaustor0,0188 
fNe 
Nv 
= 0,939 
0,02 
ligado durante toda a digestão. 
S1 
86 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos 20 Edição 
6. Retire os tubos e os deixe esfriar no interior da capela. de ácido clorídrico a ser utilizada (0,005; 0,02 ou 0,05N) será 
escolhida ponderando-se os aspectos de sensibilidade analítica e 
7. Quando a temperatura dos tubos estiver abaixo de 100°C, adicione
de praticidade dos procedimentos. Soluções mais diluídas de ácido
uma pequena porção de água destilada (aproximadamente 10 mL) 
clorídrico devem ser usadas em materiais com baixo teor de N 
e homogenize para evitar ou minimizar a cristalinização da soluç�ão. 
(e.g., fluidos biológicos, efluentes) para que se garanta 
Caso a cristalização se manifeste na forma de uma placa sólida, 
sensibilidade analítica e poder de discriminaç�o entre amostras. 
deve-se adicionar mais uma pequena porção de água destilada 
Soluções mais concentradas de ácido 
clorídrico devem ser 
(aproximadamente 10 mL) e utilizar um agitador (vortex) a fim de 
utilizadas para se avaliar materiais 
com alta concentraç�o de N 
que os cristais formados se dissolvam antes da etapa de destilação. 
(e.g, carcaças, glutenose), pois 
tomam mais práticos os 
8. Adicione em erlenmeyer de 250 mL, 10 mL de solução de ácido procedimentos devido ao menor
volume de ácido utilizado e 
bórico (20 g/L). Adapte o erlenmeyer ao conjunto de destilação para evitam problemas de identi"icação do ponto
final de titulação 
receber toda a amônia destilada de modo que a saída do destilador devido à diluição excessiva do indicador 
com grande volume de 
esteja imersa na solução de ácido bórico. ácido. A titulação 
deve ocorrer logo após a destilação. Tempos 
muito longos entre esses procedimentos podem
permitir a 
9. Transfira o tubo digestor com a amostra digerida para o conjunto de 
perda de nitrogênio por volatilização. 
destilação e adicione 25 mL de solução dehidróxido de sódio (400 g/L).
12. Faça ao menos dois tubos
em "branco" (sem amostra) passando
10. Destile por arraste, mantendo o terminal do 
condensador 
por todos os processos 
(digestão, destilação e titulação) 
com o 
mergulhado na solução receptora até que toda a amônia seja 
objetivo de quantificar e 
eliminar interferências. 
Tubos em 
liberada. O volume total do destilado deve ser de 100 mL. O 
"branco" devem ser avaliados 
em todas as partidas de digestão. 
volume final de destilação deve ser constante entre alíquotas. 
11. Retire o erlenmeyer e titule com a solução de ácido clorídrico até 
a mudança de cor do indicador (verde para rosa claro). A solução 
89 
88 
Métodos para Análise de Alimentos -2" EdiçãoINCT Ciência Animal
em que: BNus = percentual de nitrogênio com base na matéria seca: Cálculo da concentração de nitrogênio 
%ASE = percentual de "amostra seca em estufa": %PBvs = percentual 
de proteína bruta com base na matéria seca; fc = fator de conversäo da Utilize uma das duas equações abaixo:
concentração de nitrogénio em equivalentes proteicos, sendo
recomendado o valor de 6.38 para leite e derivados e 6.25 para os 
(V-B) x Ne x fx 14x 100 %NASA ASA 
demais materiais. 
(V-B) x Nvx 14 x 100 
ASA Exemplo de cálculo 
96NASA
Considerando a aliquota 1 na tabela a seguir, têm-se os em que: GNASA = percentual de nitrogênio com base na amostra seca 
cálculos para estimativa da proteína bruta: ao ar; V = volume da solução de ácido clorídrico utilizado na titulação 
(mL); B = volume de ácido clorídrico utilizado na titulação do 
(V- B) x Ne x fx 14 x 100 
%N ASA ASA 
"branco" (mL); Ne = normalidade esperada da solução de ácido
clorídrico;f= fator de correção da normalidade do áido clorídrico 
(9,4-0,1) x 0,02 x 0,939 x 14x 100 
251,6 
-= 0,97% 
Nv = normalidade verdadeira do ácido clorídrico; ASA = massa de 
6N ASA amostra seca ao ar (mg).
Proceda à correção da amostra para umidade residual e a 
0,97 %NASA 100g5 86 %NMs/%ASE 95.86 100 = 1,01% 
conversão em equivalentes proteicos: 
6N ASA 100 6NMS %ASE 
%PBMs = %NMs X fc = 1,01 x 6,25 = 6,31%
%PBMs %NMs X fcC 
91 90 
INCT Ciência Aninal 
Métodos para Análise de. imentos -2" Edição 
Alíquota 
Literatura Citada Item 
3 
BUFFLER, M. Kjeldahl knowledge base. Decode the mysteries of the nitrogen and protein determination according to Kjeldahl. Flawil: Büchi Labortechnik, 2017. 76p. 
ASA (mg 251,6 250,9 254,7 
V (mL) 9,4 9,3 9,5 
CHANG, S.K.C. Protein analysis. In: NIELSEN S.S. (Ed.). Food analysis. 2 ed. West Lafayette: Aspen Publishers, 1998. p. 237-250. 
B (mL) 
0,1 
COSTA, G.P.; SILVA, T.E.; RODRIGUES, J.P.P.; DETMANN, E. Avaliação da concentração dos componentes da solução de destilação sobre a quantificação do nitrogênio total pelo método de Kjeldahl. Revista Agrária Acadêmica, v.2, p. 151-159, 2019. 
Ne (N) 
0,02 
0,939 
%NASA 0,97 0,96 0,97 
DETMANN, E.; FERREIRA, A.S.; SCOTTÄ, B.A. Métodos para avaliar a qualidade proteica dos alimentos. In: SAKOMURA, N.K.; SILVA, 
J.H.V.; COSTA, F.G.P.; FERNANDES, J.B.K.; HAUSCHILD, L. (Eds.). 
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%ASE 
95,86 
ToNASA 1,01 1,00 1,01 
Fc 6,25 
ETHERIDGE, R.D.; PESTI, G.M.; FOSTER, E.H. A comparison of nitrogen values obtained utilizing the Kjeldahl nitrogen and Dumas combustion 
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oPBMs 6,31 6,25 6.31 
T%PBMs (média) 6,29 
FAITHFULL, N.T. Methods in agricultural chemical analysis. A practical 
handbook. New York: CABI Publishing, 2002. 266p. 
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93 92 
INCT Cincia Animnal
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
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AOAC (Ed.) Official Methods of Analysis of AOAC 
95 
94 
INCT Ciência Anima Métodos para Análise de Alimentos -2" Fdiçd
Capítulo5 
Frações nitrogenadas proteica e não proteica 
Definições básicas 
Uma das alternativas aplicáveis ao aprimoramento fornecido 
pelo conceito de proteína bruta (PB) reside sobre seu fracionamento, 
ou seja, sobre o entendimento dos diversos compostos nitrogenados 
agrupados como PB (e.g., Krishnamoorthy et al., 1982: Sniffen et al.. 
1992). Uma das formas de fracionamento da PB com provável
aplicação na alimentação de animais não ruminantes e com aplicação 
consistente na nutrição de animais ruminantes consiste da separação 
entre compostos nitrogenados proteicos (NP) e não proteicos (NNP). 
Em termos teóricos, a separação dos compostos nitrogenados não 
proteicos permitiria a eliminação dos vieses causados pela 
incorporação de componentes, como ácidos nucléicos e outros,
inclusos como proteína bruta (PB). 
As avaliações laboratoriais mais comuns da proteína 
verdadeira (PV) de um alimento, constituída essencialmente pelo NP, 
se baseiam na precipitação da fração proteica por intermédio da ação 
de um ácido, sendo os mais conmuns o ácido wolfrâmico ou tunguístico 
(AT) e o ácido tricloroacético (TCA: Licitra et al., 1996). Neste caso, 
96 
97 
INCT Cincii Animal Métodos para Análise de Alimentos -2" Ediçio 
o meio ácido é utilizado para reduzir o pH da solução, de forma que ressaltar que os alimentos normalmente utilizados na alimentaçao 
as proteinas solúveis da amostra atinjam seu ponto isoelétrico, animal não possuem concentrações relevantes de pequenospeptideos. 
precipitando-se (Malafaia & Vicira. 1997). tornando pequena a diferença entre as estimativas obtidas com o ATe 
O conceito analítico de NP baseado na precipitação de o TCA. Isto representa importante vantagem prática. pois o TCA 
proteina em meio ácido apresenta pequena divergência em rel. ão ao apresenta custo inferior. Presenças significativas de pequenos 
conceito teórico de proteína verdadeira. Em termos de nutrição peptídeos somente seriam esperadas em alguns alimentos de origem 
animal. um aminoácido livre passível de absorç�o no intestino delgado animal, como farinha de carne e ossos e farinha de peixe. por exemplo, 
constitui NP. Contudo, quimicamente, os agentes precipitantes nos quais a utilização do AT poderia acarretar em estimativas mais 
normalmente empregados não alcançam tal discernimento. A exatas do teor de NP em comparação à utilização do TCA. 
precipitação do NP será resultante das propriedades químicas dos 
Atualizações diferentes agentes precipitantes, as quais determinam a forma como 
estes interagem com as cadeias polipeptídicas, que por sua vez é 
Nenhuma atualizaç�o direta foi realizada sobre os métodos
definida em função do perfil de aminoácidos. De forma geral, o TCA 
aplicados à separação entre NP e NNP. Apenas ressalta-se que as 
écapaz de precipitar cadeias peptídicas superiores a 10 aminoácidos, 
modificações introduzidas por intermédio do método N-001/2 devem 
ao passo que o AT precipita cadeias peptídicas superiores a 3 
ser aplicadas aqui. 
aminoácidos (Licitra et al., 1996). Assim, devido à ação peculiar dos 
reagentes, aminoácidos livres e pequenos peptídeos são mensurados 
como NNP, gerando pequena divergência entre o conceito teórico e o 
conceito analítico de PV. 
Dadas as características dos agentes precipitantes, a precipitação 
de NP como AT seria mais eficiente em relação àquela obtida com o 
TCA, pois a divergência entre o conceito teórico e as estimativas de 
NP obtidas analiticamente seria minimizada. Contudo, há de se 
99 98 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição
Método do ácido tricloroacético (TCA) Solução de ácido tricloroacético (10 g/L) 
(Método N-002/2) Em um balão de 100 mL com cerca de 60 mL de água, dissolvalg 
de TCA P.A. Complete o volume e homogenize a solução. Aparatos
Após o preparo, as soluções de TCA devem ser transferidas 
- Balança analítica com precisão de 0,0001 g 
para recipientes adequados e mantidas sob refrigeração. 
- Becker 
- Funil raiado Procedimentos 
- Papel filtro quantitativo, livre de cinzas e de filtração rápida
1. Use balança analítica aferida pelo INMETRO, com precisão de 
- Tubos de digestão macro Kjeldahl em borossilicato 
0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente
- Conjunto para digestão e destilação - bloco digestor e destilador por 
climatizado (20-25°C ou de acordo com as especificações do 
arraste de vapor 
fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua 
- Bureta de 50 mL com graduação de 0,1 mL ou inferior 
estabilização. - Erlenmeyer de 250 mL 
Balões volumétricos 2. Acondicione aproximadamente 0,5 g de amostra seca ao ar 
(preferencialmente moída em peneira de porosidade l mm) em um 
Reagente 
becker de 100 mL. 
- Acido tricloroacético (CClCoOH) P.A. 
3. Adicione 50 mL de água destilada. 
Soluções 4. Agite levemente e deixe em repouso por 30 minutos. 
Solução de ácido tricloroacético (100 g/L) 5. Adicione 10 mL de solução de TCA 100 g/L e agite levemente. 
Em um balão de 100 mL com cerca de 60 mL de água, dissolva 10 g 
6. Deixe em repouso por 30 minutos. 
de TCA P.A. Complete o volume e homogenize a solução.
100 101 
INCT Ciencia Animal Métodos para Anlise de Alimentos - 2" Edição 
7. Filtre em papel filtro quantitativo livre de cinzas (ashless) colocado %NMS-%NITLAMSx 100 = 100- %NPN %NNP em funil raiado e previamente umedecido com água destilada. ONMs 
8. Lave sequencialmente com solução de TCA 10 g/Le água destilada. em que: ONPN = percentual de nitrogênio proteico com base no 
nitrogênio total da amostra; %NITCAMs = percentual de nitrogênio 
9. Transfira o papel filtro com o resíduo para um tubo macro Kjeldahl. insolúvel em ácido tricloroacético com base na matéria seca; %Nus = 
10.Submeta à digest�ão, destilação e titulação, como descrito para o percentual de nitrogênio total da amostra com base na matéria seca; e 
método N-001/2, considerando as sugestões a seguir. Primeiro, 
ONNPN = percentual de nitrogênio não proteico com base no 
devido à análise de N ser realizada com o papel filtro em conjunto
nitrogênio total da amostra. 
com a amostra, sugere-se que as quantidades de ácido sulfúrico e 
mistura digestora adicionadas para a digestão sejam dobradas. Método do ácido wolfrâmico ou tunguístico 
Segundo, para evitar interferências, o "branco" deve ser realizado (Método N-003/2) 
com papel filtro. O percentual de N deve ser calculado como 
Aparatos 
descrito para o método N-001/2. Este percentual representa o NP 
da amostra. Para a correta avaliação, análises do teor total de N do Balança analítica com precisão de 0,0001 g 
Beckermaterial devem ser conduzidas em paralelo.
- Funil raiado
Medidor de pH Cálculo da concentração de nitrogênio proteico e não-proteico 
- Papel filtro quantitativo, livre de cinzas e de tilração rápida
O nitrogênio insolúvel após o tratamento com ácido Tubos de digestão macro Kjeldahl em borossilicato 
tricloroacético é considerado de origem proteica; assim: - Conjunto para digestão e destilação - bloco digestor e destilador por 
arraste de vapor 
ONITCAMSx 100 6NPN Bureta de 50 mL com graduação de 0.1 mL ou inferior
%NMs 
Erlenmeyer de 250 mlL 
102 103 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
INCT Ciência Animal 
4. Deixe em repouso por 30 minutos (20-25°C). 
Reagentes 
5. Ajuste a solução para pH 2,0 adicionando ácido sulfúrico 0.5 M 
Tungstato de sódio (Na.04W) P.A. 
(monitorar com medidor de pH). 
- Ácido sulfúrico (H;SO,) concentrado P.A. 
6. Deixe em repouso por uma noite em temperatura ambiente. 
Soluções
7. Filtre em papel filtro quantitativo livre de cinzas (ashless) colocado
Solução de tungstato de sódio (100 g/L) 
em funil raiado e previamente umedecido com água destilada. 
Em um balão de 100 mL com cerca de 60 mL de água, dissolva 10 g 
de tungstato de sódio P.A. Complete o volume e homogenize a 8. Lave o precipitado com água destilada.
solução. 
9. Transfira o papel filtro com o resíduo para um tubo macro Kjeldahl. 
Acido sulfúrico (0,5M) 10.Submeta à digestão, destilação e titulação considerando as 
- Em um balão volumétrico de 1000 mL contendo 300-500 mL de 
recomendações feitas no método N-O02/2. 
água destilada, adicione 30 mL de ácido sulfúrico P.A. Homogeneíze 
e complete o volume com água destilada. 
- Amostras de baixo teor proteico (menos de 20% de proteína bruta) 
Procedimentos 
1. Proceda de forma similar às amostras com alto teor proteico, 
Amostras de alto teor proteico (mais de 20% de protena bruta) utilizando 5 mL de solução de tungstato de sódio (100 g/L). 
1. Acondicione 0,5 g de amostra seca ao ar (preferencialmente moída
O cálculo das concentrações de compostos nitrogenados
em peneira de porosidade 1 mm) em um becker. 
proteicos e não proteicos é realizada de forma similar ao descrito no 
2. Adicione 50 mL de água destilada. método N-002/2. 
3. Adicione 8 mL de solução de tungstato de sódio (100 g/L). 
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Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição INCT Ciência Animal 
Literatura Citada Capítulo 6 
KRISHNAMOORTHY, U.; MUSCATO, T.V.: SNIFFEN, C.J.; Van 
SOEST, P.J. Nitrogen fractions in selected feedstuffs. Journal of Dairy 
Science, v.65, p.217-225, 1982. 
Gordura bruta 
Definições básicas LICITRA, G.; HERNANDEZ, T.M.; Van SOEST, P.J. Standardization of 
procedures for nitrogen fractionation of ruminant feeds. Aninmal Feed 
Science and Technology, v.57, p.347-358, 1996. 
A gordura bruta constitui conceito analítico que envolve as 
MALAFAIA, P.A.M.; VIEIRA, R.A.M. Técnicasde determinação e 
avaliação dos compostos nitrogenados em alimentos para ruminantes In: 
SIMPOSIO 
RUMINANTES, Lavras, 1997. Anais... Lavras: FAEPE, 1997. p.29-54.
substâncias apolares insolúveis em água, mas solúveis em solventes 
INTERNACIONAL DE DIGESTIBILIDADE EM orgânicos, denominados extratores (e.g. éter etlico, éter de petróleo. 
clorofórmio, benzeno, etc). De forma geral, o conhecimento do teor de 
SNIFFEN, CJ.; O'CONNOR, J.D.; Van SOEST, P.J.; FOX, D.G.;
RUSSELL, J.B. A net carbohydrate and protein system for evaluating 
cattle diets: ILCarbobydrate and protein availability. Journal of Animal 
Science, p.3562-3577, 1992. 
gordura é relevante na análise de alimentos e na nutrição animal, pois 
constitui a fração de maior energia dos alimentos, podendo fornecer, 
em média, 2,25 vezes mais energia que os carboidratos (Silva & 
Queiroz, 2002).
Contudo, como ressaltado acima, o resíduo analiticamente 
obtido é, na verdade, uma fração heterogênea, constituída por uma 
fração graxa (e.g., galactolipídeos, triglicerídeos) e por uma fração não 
graxa, formada por todos os demais compostos apolares que possam 
ser extraídos pelo solvente, como esteróis, pigmentos, vitaminas 
lipossolúveis, ceras, etc. (Barbosa et al.. 2017). Por isso, o resíduo 
extraído é corretamente denominado de gordura bruta em função da 
divergência entre o conceito analíitico e o conceito bioquímico de 
lipídeos (Silva et al., 2011). 
A avaliação quantitativa de lipídeos em alimentos constitui 
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INCT CiCneia Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Ediçio 
H procedimento importante para avaliações nutricionais e de avaliação da concentração de EE em amostras sólidas (e.g.. extrações
processamento de alimentos/rações. pois altos teores de gordura podem continuas, semi-contínuas), os quais, entre outros aspectos, distinguem- 
demandar ações específicas para seu processamento/armmazenamento, se entre si pela forma como o extrator interage com a amostra. 
uma vez que esta fração mostra-se bastante susceptível à deterioração O método de Goldfish utilizado para quantificação de EE 
por racindez hidrolítica e/ou oxidativa. Por outro lado, a concentração consiste de um processo de extração continuo no qual o solvente em 
de gordura nas dietas ofertadas a animais numinantes possui caráter ebulição é condensado e flui por gotejamento continuamente sobre a 
restritivo i.e. com limites máximos de inclus�o), haja vista a baixa amostra (Xiao, 2010; Jiang et al., 2014). Este método apresenta tres 
capacidade oxidativa do ambiente rnuminal, a qual restringe a produção etapas distintas: extração, remoç�o e quantificação. Na primeira etapa. 
de energia a partir de compostos altamente reduzidos, e os efeitos procede-se à extração da fração apolar do alimento propriamente dita.
deletérios passíveis de ocorrer no rúmen devido a dietas excessivas em Sequencialmente, realiza-se a remoção do solvente por evaporação 
material graxo. (normalmente essa etapa é denominada de reciclagem). 
com posterior 
No entanto, torna-se importante ressaltar que a gordura bruta avaliação gravimétrica da massa de compostos apolares 
extraída. Este 
constitui uma entidade analítica definida pelo método em si (Palmiquist método foi predominante no Brasil por muitos anos. Contudo, o 
mesmo
& Jenkins, 2003). Portanto, quaisquer alterações em termos de métodos encontra-se atualmente em desuso 
devido ao surgimento de alternativas 
ou procedimentos dentro de um mesmo método irão implicar na mais eficientes em termos, principalmente, 
de capacidade operacional. 
Logo, a O mesmo ainda faz parte do portifólio 
deste Manual, embora as 
quantificação de entidades diferentes. correta
descrição/aplicação do método e de seus respectivos procedimentos faz- recomendações gerais sejam 
de sua substituição pelo método de 
Randall. 
se necessária para a identificaç�o adequada da entidade mensurada e 
O método de Randall (também chamado de Soxtec
ou método
para o cotejamento adequado de resultados. 
Entre os extratores utilizados para quantificação, os éteres são de submersão), também
utilizado para avaliação do teor de EE, 
constitui
eo método previamente aplicado para alimentos à 
base de came. O método 
considerados modais, o que atribui o acrônimo comum de extrato « 
(EE) ao resíduo de gordura bruta obtido (i.e., resíduo extraído por éter). foi 
inicialmente proposto como alternativa 
ao antigo método de extração
Por outro lado, existem diversos métodos de extração distintos para semi-contínua de Sonhlet devido
à sua baixíssima capacidade 
109 
108 
INCT CiCncia Animal Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição
operacional. Contudo. atualmente, o método de Randall é tannbém Nenhuma atualização foi proposta para o método de Goldfish, 
recomendado para quantificação do teor de gordura bruta em rações, pois, como previamente indicado, o mesmo encontra-se em desuso
grãos e forragens (Thiex et al., 2003a). devido a limitações de sua capacidade operacional e, em alguns casos.
O método de Randall também constitui método de extração menor interação do solvente com os compostos apolares. Esses 
contínua, mas difere parcialmente do método de Goldfish na forma aspectos são melhor explorados pela aplicação do método de Randall.
como o solvente orgânico interage com a amostra. Durante parte da O método de Randall foi devidamente avaliado para amostras 
extração, a amostra encontra-se submersa no solvente, aumentando o de forragens e amostras fecais pelo grupo do INCT Ciência Animal
contato do solvente com os compostos apolares e, consequentemente, a (Barbosa et al., 2017). Contudo, avaliações adicionais foram 
taxa de extração dos mesmos. Portanto, existe uma etapa adicional em conduzidas visando a adequação dos tempos das etapas de submersão 
relação ao método de Goldfish, no qual a amostra é imersa no solvente e gotejamento (Oliveira et al.. 2018).
em ebuliçao, o que acelera otimiza o processo de extração de Um método de hidrólise ácida foi incluído como preparatório 
compostos apolares. para análise de EE para o caso de amostras ricas em sabões de cálcio, 
Nesse sentido, o método de submersão diminui os quais são utilizados como fontes de gordura protegida para animais 
consideravelmente o tempo de extração necessário para concluir a ruminantes, podendo também ser formados no intestino de animais de 
análise. Esse aumento na taxa de extração é desejável na busca de produção, processo acentuado quando ocorme inclusão de gordura nas 
tempos de anáise menores e maior capacidade operacional (Thiex et al., dietas. Os sabões de cálcio são insolúveis em éter. Portanto, a presença
2003b). Entre os métodos aplicados para a quantificação de EE significati va desses compostos na amostra pode levar à subestimação 
atualmente, o método de Randall é considerado modal. A maioria dos do teor de gordura bruta caso os mesmos não sejam hidrolisados 
equipamentos produzidos atualmente é baseada nesse método. Cabe previamente aos procedimentos de extração, principalmente em 
ressaltar que os equipamentos produzidos para realização da extração amostras fecais. Cabe ressaltar que, como o EE é definido pelo 
de Randall podem ser usados na extração de Goldfish (basta omitir a método, a inclusão de hidrólise ácida deve ser considerada como uma 
etapa de imersão). Contudo, o contrário não se faz verdadeiro. modificação do método de extração subsequente. Assim, sugere-se, 
Atualizações caso o conjunto de amostras seja oriunda de um ensaio de digestão
110 111 
INCT CiRcia Animal 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
(i.e.. ofertado. sobras, digesta e material fecal), que a hidrólise seja Procedimentos 
aplicada a todas as amostras, visando o uso de uma entidade única no 
. Use balança analítica aferida pelo INMETRO. com precisão de cômputo dos coeficientes de digestibilidade aparente. O método de 
0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente hidrólise ácida aqui proposto é composto de adaptação do métodoadotado pelo Instituto Adolfo Lutz (1AL, 2008), com modificações 
climatizado (20-25°C ou de acordo com as especificações do 
sugeridas por Rodrigues et al. (2017). fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua 
estabilização. 
Método de Goldfish 
2. Pese aproximadamente 2 gramas de amostra seca ao ar 
(Método G-004/1) (preferencialmente moída em peneira de porosidade mm) emn 
cartucho de celulose ou em papel de filtro qualitativo. Neste último 
Aparatos 
caso, uma folha de papel filtro é utilizada para receber a amostra e 
Balança analítica com precisão de 0,0001 g 
outra é utilizada como envoltório, produzindo-se um cartucho. 
- Dessecador 
Ressalta-se que a massa de amostra pode variar em função da 
- Estufa sem circulação forçada de ar sensibilidade analítica. Materiais com alto teor de EE podem ser 
- Aparelho para extração de gordura tipo Goldfisch equipado com avaliados com menor massa de amostra. ao passo que materiais 
suporte para cartuchos de vidro e tubos coletores de éter 
com baixo teor de EE deverão ser avaliados com maiores alíquotas 
- Copos próprios para extração de gordura (seguir especificação do 
para que se garanta residuo mensurável de acordo com a 
equipamento) 
sensibilidade analítica. 
-Cartucho extratorde celulose ou de papel filtro qualitativo 80 g/m? 
3. Numere os copos, lave-os e seque-os por 16 horas ("uma noite") em 
Reagente estufa a 105°C. 
Eter de petróleo P.A. (benzina) 
4. Coloque-os em dessecador devidamente preparado (máximo de 20 
unidades por procedinmento), a fin de estriá-los. A principal função 
112 
13 
INCT Ciêneia Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Ediçäo 
de um dessecador é permitir o restriamento das amostras após o 8. Adicione cerca de 50 a 100 mL de éter de petróleo em cada copo. periodo de secagem sem absorver umidade, via uso de um O éter não deve entrar em contato direto com o cartucho. A 
dessecante. como a sílica gel. De forma particular, a sílica-gel quantidade de éter poderá variar de acordo com o tamanho do copo 
sugerida devido ao seu baixo custo, à facilidade de manejo e à de extração (veja as especificações de seu equipamento). 
possibilidade de reciclagem e reuso. Assim, o dessecador de. estar 
sempre limpo, secoe possuir sílica gel na tonalidade azul escuro 9. Acopleo copo no extrator. 
em seu interior. A área de contato entre o corpo do dessecador e sua 10. Inicie o aquecimento e a circulação de água no condensador. 
tampa deve ser levemente lubrificada com graxa de silicone de 
forma a permitir um deslizamento adequado e melhorar a vedação
11.Após se iniciar a ebulição do éter, verifique se n�ão há vazamento 
durante o período de resfriamento. deste durante sua ebulição e condensação. 
5. Após estabilizaç�o com a temperatura ambiente (normalmente em 12. Extraia por 4 horas com taxa de condensação de 5 a 6 gotas por 
torno de 30 minutos), pese os copos, removendo-os um de cada vez segundo. Verifique se as gotas estão passando por dentro dos 
do dessecador, mantendo-o fechado entre as remoções dos 
cartuchos. 
recipientes. 13. Após a extração, proceda à retirada do éter pelo esquema de 
6. Acondicione os cartuchos em seus respectivos copos e mantenha- reciclagem característico de cada equipamento até que uma 
os em estufa não ventilada a 105°C por 2 horas. Se a extração não 
camada delgada (aproximadamente 1 mm) de éter permaneça no 
fundo do copo. Ocorrer imediatamente após este procedimento de secagem, 
mantenha os cartuchos dentro de seus respectivos copos em 
14. Coloque os copos em estufa não ventilada a 105°C por 30 minutos
dessecador. 
para terminar a evaporação do éter. Cuidado, se os copos forem 
7. Acople os cartuchos no extrator. colocados na estufa com excess0 de éter poderá ocorrer 
explosão. 
114 115 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
15. Acondicione enm dessecador até que ocora equilfbrio 
com a Exemplo de cálculo
temperatura ambiente e proceda à pesagem. Siga 
as instruções 
Considerando a aliquota I na tabela abaixo, têm-se os cálculos 
gerais de uso do dessecador descritas nos passos 
4 e 5. A diferença 
para estimativa da gordura bruta ou extrato etéreo:
entre este último peso e o do copo vazio corresponde 
ao peso da 
gordura bruta extraída. 
EE (copo+EE)-copo=115,6822-115,6318=0,0504 g 
Cálculo da concentração de gordura bruta
EE 0,0504
%EEasaASA 100 2,0038 x 100 2,52%
Para o cálculo da gordura bruta ou extrato etéreo, utilize 
sequencialmente as equações: 
2,52 %EEAS 100 = x 100 2,62% 95,86 %EEMs %ASE 
EE=(copo+EE)-copo 
Alíquota 
EE 
3 6EEASAA ASA x100 Item 
ASA (g) 2,0038 2,0363 2.0010 
6EEASA 100 %EEMS9%ASE Copo (g) 
115.6318 147,0963 109.1055
Copo+EE (g) 115,6822 147,1469 109,1554
EE () 0,0504 0.0506 0,0499 
em que: EE = massa de extrato etéreo (g); copo 
= massa do copo de 
249 T%EEASA 2,52 2.48 
extração (g); %EEASA = percentual de extrato 
etéreo com base na 
T%ASE 95,86
amostra seca ao ar; ASA = massa de amostra seca ao ar (g); %EEMs 
= 
2,60 T%EEMs 2,62 2,59 
percentual de extrato etéreo com base na matéria seca; 
%ASE = 
%EEMs (média) 2,60 
percentual de "amostra seca em estufa". 
116 17 
m 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
Método de Randall . Pesc aproximadamente 2 gramas de amostra seca ao ar 
para equipamentos Gerhardt Soxtherm 2000., Tecnal TE-044, (preferencialmente moída em peneira de porosidade I mm) em 
Marconi MA491/6 ou similares) cartucho de celulose ou em papel de filtro qualitativo. Neste último 
(Método G-005/2) caso, uma folha de papel filtro é utilizada para receber a amostra e 
outra é utilizada como envoltório, produzindo-se um cartucho. Aparatos 
Ressalta-se que a massa de amostra pode variar em função da 
Balança analítica com precisão de 0,0001g sensibilidade analítica. Materiais com alto teor de EE podem ser - Dessecador 
avaliados com menor massa de amostra, ao passo que materiais 
Estufa sem circulação forçada de ar com baixo teor de EE deverão ser avaliados com maiores alíquotas 
- Aparelho para extração de gordura tipo Randall, equipado com para que se garanta resíduo mensurável de acordo com a 
suporte para cartuchos de vidro e tubos coletores de éter sensibilidade analítica. 
- Copos próprios para extração de gordura (seguir especificação do 
3. Numere os copos, lave-os e seque-os por 16 horas ("uma noite") em equipamento) 
estufa a 105°C.
-Cartucho exrator de celulose ou papel filtro qualitativo 80 g/m? 
4. Coloque-os em dessecador devidamente preparado (máximo de 20 Reagente 
unidades por procedimento), a fim de esfriá-los. A principal função 
Eter de petróleo P.A. (benzina) de um dessecador é permitir o restriamento das amostras após o 
Procedimentos período de secagem sem absorver umidade, via uso de um 
dessecante, como a sílica gel. De forma particular, a sílica-gel é 1. Use balança analítica aferida pelo INMETRO, com precisão de 0,0001 
sugerida devido ao seu baixo custo, à facilidade de manejo e à 
g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente climatizado
possibilidade de reciclagem e reuso. Assim, o dessecador deve estar 
(20-25°C ou de acordo com as especificações do fabricante). Ligue a 
sempre lumpo, seco e possuir sílica gel na tonalidade azul escuro 
balança e aguarde 30 minutos para sua estabilização. 
em seu interior. A área de contato entre o corpo do dessecador e sua 
118 119
INCTCn a Anima Métndos para Análise de Alimmentos 2" Fdiçin 
tampa deve ser leve ente lubrificada com graxa de silicone de 10. Após se inicar a ebulição do éter. verifique se não ha vazamento 
forma a pemitir um deslizamento adequado e melhorar a vedaçâo deste durante sua ebulição e condensação 
durante o período de resfriamento. 
11. Mantenha os cartuchos submersos no solvente em ebulição por 20 
5. Após estabilização com a temperatura ambiente (nomalmente em minutos. 
tormo de 30 minutos). pese os copos, removendo-os um de cada vez 
12. Suspenda os cartuchos (ou reduza o volume de éter: isso dependeráda 
do dessecador. mantendo-o fechado entre as remoções dos 
marca e modelo do cquipamento)e extraa por 80 minutos com taxa 
recipientes. 
de condensação mínima de 3 a 5 gotas por segundo. Assegure-se que 
6. Acondicione os cartuchos em seus respectivos copos e mantenha-os as gotas estão passando por dentro dos cartuchos. 
em estufa não ventilada a 105°C por 2 horas. Se a extração não 
13. Após a extração, prnceda à retirada do éter pelo esquema de reciclagem 
ocorrer imediatamente após este procedimento de secagem,
característico de cada equipunento até que uma camada delgala
mantenha os cartuchos dentro de seus respectivos copos em 
(aproximadamente I mm) de cter pemaneça no tundo do copo. 
dessecador. 
14.Coloque os copos em estufa n�o ventilauda a l05°C por 30 minutos 
7. Adicione éter de petróleo em cada copo. . quantidade deve ser 
para teminar a evaporação do éter. Cuidado, se os copos forem 
suficiente para permiir a realização da extração na fase de 
colocados ma estufa com excesso de éter poderá ocorrer explosão. 
submersãoe pode variar em funç�o do equipamento. 
15. Acondicione em desseeador té que ocora cyulbrio com a 
8. Coloque os cartuchos no local indicado no equipamento (i.e.,
lemperatura ambiente e prucela à pesagem. Siga as instruções gerais 
suporte) e acople o copo no extrator. Posicione os cartuchos 
de uso do dessecador deseritas nos passos 4 e 5, A diterença entre este 
imersos no éter. 
iltimo peso e o do copo vazio cornesponde iao peso da gordura 
9. Inicie o aquecimento e a circulação de água no condensador. extraida. 
121 120 
Métodos para Análise de limentos-2" Edição INCT Ciência Animal 
Os cálculos da concentração de EE são realizados de forma 
- Em capela, adicione 1000 ml de água destilada ao frasco erlenmeyer 
similar ao descrito no método G-004/1. de 2000 mL. Com cuidado, acrescente 500 mL de ácido clorídrico 
P.A. Aguarde o resfriamento. 
Hidrólise ácida pré-extração de gordura 
(Método G-006/1) Procedimentos 
Aparatos 1. Use balança analítica aferida pelo INMETRO. com precisão de 
Balança analítica com precisão de 0,0001g 0,0001 g, sobre bancadaespecial de laboratórioe em ambiente 
climatizado (20-25°C ou de acordo com as especificações do Chapa aquecedora ou banho de areia
fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua - Estufa sem circulação forçada de ar 
- Capela com exaust�ão estabilização. 
- Frascos erlenmeyer 250 mL 2. Pese aproximadamente 4 gramnas de amostra seca ao ar 
Frasco erlenmeyer 2000 mL 
(preferencialmente moída em peneira de porosidade I mm) e 
- Vidros de relógio acondicone em frasco erlenmeyer de 250 mL. 
- Papel de filtro qualitativo 80 g/m 
- Béqueres 500 mL 3. Em capela, adicione sobre a amostra 40 mL 
da solução de ácido 
- Funis raiados clorídrico 1:2 e cubra com o vidro de relógio.
- Papel indicador de pH 
4. Coloque o erlenmeyer com a amostra e coberto com o vidro de 
Reagente relógio sobre a chapa aquecedora 
ou banho de areia, que deverá 
estar no interior da capela.
Acido clorídrico (HCI) 37% P.A. 
Solução 5. Aqueça 
o equipamento até a temperatura de 110 a 120°C. Aguarde 
até a ebulição. Mantenha nessas condições por 30 minutos. 
Solução de ácido clorídrico 1:2 
122 123 
Mtodos para Análise de Almentos2" Ediçio 
INCTCcna Animal 
Literatura Citada 
o. Retie os erlennmeyers da chapa aquccedora ou banho de arcia e 
deixe esfriar no interior da capela. BARBOSA. M.M DETMANN. E. VALADARES FILHO. SC 
DETMANN. K.S.C. FRANCO. M0: BATISTA, E.D.; ROCHA, G.C. 
Fvaluation of methods for the quantification of ether extract contents in 7, Filtre o conteúdo em papel de filro qualitativo 80 g/hn' com o 
forage and cattle feces. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 
auxilio de funil raiado e de um béquer de 500 ml que receberá o v.89. p.1295-1303. 2017. 
sobrenadante a ser descartado. Lave o interior do erlenmeyer com INSTITUTO ADOLFO LUTZ - IAL. Métodos fisico-químicos para 
análise de alimentos. 4 ed. So Paulo: Instituto Adolfo Lut/, 2008. água destilada quente (temperatura igual ou superior a 90 °C) para 
1020p
garantir a transferência quantitativa do resíduo para o papel de JIANG. B.: TSAO. R.: LI. Y.: MLAO. M. Food safety: food analysis 
technologies/techniques. In: Van ALFEN. N.K. (Ed.) Enclyclopedia 
of 
agriculture and food systems. 2 ed. Amsterdan: Elsevier. 2014, p.273
288. 
filtro. 
8. Proceda à lavagem do resíduo retido no papel de filtro com água 
SILVA. D.J.: QUEROZ, A.C. Análise de alimentos. Métodos quimicos 
e 
biológicos. 3 ed. Viçosa: Editora UFV, 2002. 235p. destilada quente (temperatura igual ou superior a 90°C). Monitore
o pH constantemente com o papel indicador. A lavagem deve ser SILVA. P.T.: DETMANN, E.: VALADARES FILHO. S.C.: DETMANN, 
K.S.C.: BARROS. L.V.: MARTINS, S.C.V.; MORAIS, L.E.:
COSTA.
conduzida até a neutralização (i.e., pH = 7,0). 
V.A.C. Evaluation of total and non-tatty ether extract in feeds and cattle 
feces using two analytical methods. Animal Feed 
Science and 
Technology. v. 163. p.111-17, 2011.9. Retire o papel contendo o resíduo e acondicione sobre um vidro de 
relógio. Conduza à estufa sem ventilação forçada (105°C) por 16 OLIVEIRA. 
A.C.R.: DETMANN. E.: RODRIGUES. J.P.P.:
GARCIA.
A.M.M.: TEIXEIRA. I.C.: RODRIGUES. A.N. Efcitos dos tempos
de 
imersão e de gotejamento sobre a estimativa de gordura bruta pelo 
método 
de Randall. In: SIMPOSIO DE INTEGRAÇÃO ACADEMICA, 2018.
Anais... 
horas ("uma noite"). 
UFV. 2018. Disponivel em Viçosa: 
https://www.3.dti.utv.br/sia/vicosa/2013/trabalhos/ 
10. Acondicione o material em cartuchos de celulose ou confeccione 
PALMQUIST, D.L.: JENKINS T.C. Challenges 
with fats and fatty acid 
methods. Journal of Animal Science. v.81. p.3250-3254, 
2003.
cartucho com papel de filtro qualitativo 80 g/m. 
RODRIGUES, J.P.P.: PAULA, R.M; RENNO, L.N.; FONTES, 
M.M.S.: 
MACHADO, A.F.: VALADARES FILH0, S.C.;
HUHTANEN, P.; 
MARCONDES, M.l. Short-term etfects ot soybean oil supplementation 
on pertormanee, digestion, and metabolisnm in dairy 
cows fed sugarcane- 
based diets. Journal of Dairy Science, v. 100. p.4435-4447, 
2017.
11. Proceda à extração da gordura conforme o método G-005/2.
Os cálculos da concentração de EE são realizados de forma 
similar ao previamente descrito. 
125 
124 
INCT Ciencia Animal Métodos para Análise de Alimentos - 20 Edição 
THIEX, N.; ANDERSON, S.; GILDEMEISTER, B. Crude fat, hexanes
extraction, in feed, cereal grain, and forage (Randal/Soxtec/Submersion 
method): collaborative study. Journal of AOAC International, v.86,
p.899-908, 2003a.
Capítulo 7 
FibraTHIEX, N.; ANDERSON, S.; GILDEMEISTER, B. Crude fat, diethyl ether
extraction, in feed, cereal grain, and forage (Randall/Soxtec/Submersion 
method): collaborative study. Journal of AOAC International, v.86, 
p.888-898, 2003b.
7.1. Fibra insolúvel em detergentes neutroe ácido
Definiçoes básicas XIAO, L. Evaluation of extraction methods for recovery of fatty acids 
from marine products. 121f. Dissertação de Mestrado, University of 
Bergen, Noruega, 2010. Embora o termo fibra seja de uso comum no vocabulário 
associado nutrição animal, a definição exata de seu significado 
constitui processo extremamente complexo em virtude da necessidade 
de se compatibilizar aspectos nutricionais e analític0s. Em termos 
gerais, a fibra constitui um termo exclusivamente nutricional que 
compreende os compostos indigestíveis ou de lenta digestão que 
ocupam espaço no trato gastrintestinal dos animais (Undersander et 
al., 1993). Sob um ponto de vista químico, estes componentes 
constituem mistura de celulose, hemicelulose, lignina, pectina e ate 
mesmo outros compostos como proteína, lipídeos, minerais e alguns 
carboidratos não fibrosos indigestíveis (Detmann, 2010).
A partir desta definição nutricional geral de fibra, estabelece-
se a premissa que esta somente pode ser verdadeiramente 
mensurada 
pelo animal (Undersander et al., 1993). 
Contudo, embora 
nutricionalmente embasada, definição anteriormenteapresentada 
representa empecilho primário aos nutricionistas, 
os quais demandam
127 
126 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição 
vias práticas e rotineiras para mensuração da fibra dos alimentos com dctergente neutro (DN). com digestibilidade verdadeira alta e 
o objetivo de aplicação ao desenvolvimento ou construção de dictas aproximadamente constante entre alimentos. da fração insolúvel em 
que suportem o nível de produção planejado para determinado sistema DN, com digestibilidade menor e variável entre alimentos (Huhtanen 
(Detmann. 2010). et al., 2006). Contudo, embora o conceito aparente ser simples. a 
Em termos teóricos, os métodos laboratoriais para análise de Cxtração em DN mostra-se totalmente complexa. com alto nivel de 
fibra em alimentos deveriam ser desenvolvidos para se ajustarem a um possíveis interferèncias, o que demanda alta complexidade na soluç�o 
conceito nutricional e não o contrário. Contudo, torna-se praticamente de DN. 
impossível que algum método baseado em mensurações laboratoriais Por outro lado. a extração em detergente ácido (DA) mostra 
químicas ou enzimáticas possa reproduzir todos os efeitos nutricionais se mais simples e com menor número de interferências advindas de 
da fibra no animal (Mertens, 2003). Assim, embora a fibra da dieta outros compostos presentes na matriz orgânica dos alimentos (Van 
devesse ser definida por conceitos nutricionais (e não analíticos), esta Soest & Robertson. 1985). Contudo. o resíduo obtido a partir da 
constitui na práica uma mensuração empírica que é definida pelo extração em DA não se associa a nenhum conceito nutricionalmente 
método de análise em si. válido de fibra (Van Soest. 1994). Assim, a extração em DA deve ser 
Os métodos de análise denominados fibra insolúvel em vista principalmente como um passo preparatório para redução das 
detergente neutro (FDN) e fibra insolúvel em detergente ácido (FDA) interferências sobre a quantificação posterior da concentração de 
foram originalmente desenvolvidos por P.J. Van Soest na década de lignina em alimentos ou dietas.
1960 e estão baseados na recuperação do resíduo fibroso insolúvel em 
meio neutro ou ácido, empregando-se extração em meio aquoso Atualizaçõdes 
mediada por calor e pela ação de um detergente aniônico (lauril sulfato 
Essencialmente, as aualizações aqui adotadas centram-se 
de sódio) ou catiônico (brometo de cetil trimetilamônio), sobre três pontos. Primeiro, sobre omissõies de descrições da primeira
respectivamente (Van Soest& Robertson, 1985). 
edição: segundo, sobre modificações dos métodos anteriormente 
A FDN constitui aproximação química à fibra insolúvel do 
adotados; e, terceiro, sobre o retorno efetivo do uso de cadinhos
alimento/dieta e permite a separação entre a porção solúvel em 
filtrantes como referdncia para análise. principalmente, de FDN. 
128 129 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
Durante a feitura da primeira edição deste Manual, já havia por proeminentes são observados sobre os valores de FDN, cuja extração é 
parte da AOAC International (AOAC) um método oficial de análise de mais complexa e, assim, mais susceptível a interferências nas mudanças
FDN, o qual se baseava no uso de extrator de fibras e cadinhos filtrantes de parâmetros físico-químicos da extração. 
(Mertens, 2002). No entanto, a análise de alimentos em Zootecnia vivia o Deve ser ressaltado que as análises laboratoriais de fibra 
momento dos filter bags e seu instrumental de análise (i.e., autoclaves e aplicadas atualmente em Zootecnia são categorizadas como métodos do 
analisadores de fibras), cuja principal bandeira residia sobre o aumento tipo I de acordo com o Codex Alimentarius. Logo, os métodos permitem
de praticidade e capacidade operacional na análise de fibras. Dessa forma, acessar um determinado valor que é definido pelo método em si (Codex
o comite organizador da primeira edição deste Manual baseou suas Alimentarius Commission, 2018). Uma vez que não existem padrões ou 
recomendações focando tais métodos, embora mantivesse seu referências prmárias para este tipo de método, esses não podem ser 
conhecimento sobre os métodos tradicionais de análises de fibras. validados quanto a sua exatidão, ou seja. quanto à sua capacidade de 
Contudo, durante e após a elaboração da primeira edição deste produzir resultados convergentes ao "valor real" para a entidade analítica 
Manual, novas evidências foram levantadas em trabalhos científicos que em questão. Assim, para se minimizar erros sistemáticos entre 
levaram o comitê organizador a reavaliar suas prioridades. Assim, a maior laboratórios, os métodos ditos empíricos (i.e. métodos tipo I) devem ser 
modificação a ser adotada nesta nova edição é a introdução de métodos seguidos exatamente como descrito nos protocolos padrões, pois mesmo
de análise de FDN (e, por conseguinte, FDA) baseados no uso de a menor variação nos procedimentos pode acarretar na mensuração de 
cadinhos filtrantes ao invésde filter bags, os quais são considerados como uma entidade analítica distinta da originalmente proposta (Mertens, 
referências intermacionais (Mertens, 2002; Barbosa et al., 2015; Silva et 2003). 
al., 2018). Considerando as colocações do parigrafo anterior, faz-se
Embora não haja dúvida de que o uso de filter bags aumente a extremamente necessário a completa descrição dos procedimentos usados
praticidade ea capacidade operacional do método, evidências tem sido para análise dos compostos fibrosos. Caso um método especítico seja 
apresentadas de que sua utilização pode incorrer em vícios e erros sobre seguido, sua referenciação deve ser adequada. No caso de um método ser 
o processo de quantificação de componentes fibrosos (Gomes et al., 2011; seguido, mas com alguma modificação, mesmo que mínima, esta 
deve 
Barbosa et al., 2015; Silva et al., 2018). Nornmalmente, os problemas mais 
130 131 
INCT Concia Animal Métodos para Análise de Alimentos 2" Ediin 
ser plenamente descrita para que os resultados, caso necessário, sejam Alguns detalhes adicionais devem ser irisados para avaliação 
interpretáveis e passíveis de cotejamento inter-experimental não viesado. adcquada dos conteúdos de fibra em alimentos, principalmente FDN. Em 
O uso de filter bags pode restringir a circulação de extrator pela primeiro lugar, as partículas devem ser padronizadas a partir de moagem
amostra e comprometer a extração daquilo que seria solúvel em com peneira de porosidade I mm (Mertens, 2002: Valente et al.. 2011a). 
detergente neutro, principalmente com alinmentos concentrados (Barbosa Tamanhos de partículas superiores propiciam menor superticie especifica 
et al. 2015). Contudo, o método de extração com flter bags pode ser da porção teste. comprometendo o acesso da solução de detergente e 
considerado rústico e preciso e. portanto, útil para o cotejamento intra- também da a-amilase termoestável (Valente et al.. 201 la). 
experimental (Mertens. 1999; Silva et al, 2018). O principal ponto para Os resultados obtidos no Brasil sob as mesmas condições de 
garantir essas características reside sobre o uso de sistemas pressurizados extração indicam que tanto filter bags F57 (Ankom®) como aqueles 
de extração. O uso de equipamentos não pressurizados compromete a confeccionados com tecido não-tecido (TNT, 100 g/m) propiciam 
qualidade e a precisão dos resultados (Silva et al., 2018), um possível resultados similares de FDN e FDA (Casali et al. 2009: Valente et al. 
reflexo do acúmulo de bolhas no interior dos filter bags (Gomes et al., 2011a). A diferença básica entre ambos reside sobre a menor resistência 
2011), o que compromete a homogeneidade de contato entre o extratore a danos fisicos exibida pelos filter bags de TNT (Valente et al. 2011b), 
o 
o material a ser extraído. A pressurização amplia a temperatura de que detemina que não haja reutilização dos mesmos. 
ebulição do extrator e, consequentemente, evita a formação de bolhas no 
Amostras com alto teor degordura (i.e., extrato etéreo maior que 
interior dos filter bags. A maioria dos equipamentos nacionais para 10%, com base na matéria seca) não apresentarão extração adequada do 
extrações com filter bags opera sob condições não pressurizadas, não material solúvel em detergente neutro. Isso 
se dá pela tendência de 
sendo recomendada a sua utilização formação de uma solução bifásica durante a extração, 
levando à migração 
do detergente neutro paraa fase apolare comprometendo sua ação 
na fase 
polar (Van Soest & Robertson, 1985; Valente et al., 2011c). 
Assim, tais 
7Este é o motivo pelo qual a descrição do método inclui uma marca 
comercial de equipamentos, cujos modelos operam sob pressurização. Não 
há compromisso algum do comitê organizador deste Manual com a empresa
citada. Apenas priorizou-se a adequação do processo de extração à 
necessidade de um ambiente físico-químico específico que é propiciado por 
tais equipamentos. 
amostras devem ser parcialmente desengorduradas previamente 
à 
extração com acetona ou éter de petróleo 
de forma a reduzir sua 
133 
132 
INCT Ciencia Animal 
Métodos para Análise de Alimentos - 2° Edição 
concentração de extrato etéreo para aquém de 10% com base na matéria A utilização de a-amilase termoestável obrigatória para a Seca. 
avaliação de FDN independentemente do instrumental de análise. Embora o método referência da AOAC (Mertens, 2002) inclua a aquecimento em meio neutro promove a gelatinização do amido presente utilização de sulfito de sódio na análise de FDN, o comitê organizador do na amostra (Hall, 2007), o qual, em não sendo retirado, inflaria o valor do presente Manual não recomenda sua utilização. Em teoria, a principal precipitado superestimaria a concentração de FDN (Valente et al. função do sulfito de sódio seria reduzir a contaminação proteica do 2011c). Contudo, tona-se importante ressaltar que o uso de a-amilase resíduo insolúvel em detergente neutro por agir na clivagem de ligações termoestável é passo constituinte do método, não cabendo ao analista bissulfidicas (Van Soest & Robertson, 1985). Contudo, o sulfito pode aplicar seletivamente sua utilização em função da natureza da amostra. apresentar ações de clivagem de ligações fenólicas, reduzindo a Portanto, a mesma deve ser utilizada em toda e qualquer amostra visandoconcentração de lignina no resíduo insolúvel e, consequentemente. à homogeneidade de aplicação do método empírico. subestimando a concentração de FDN (Van Soest et al., 1991: Gomes et Existem divergências na literatura quanto à forma de utilização al., 2012). Há de se ressaltar que, embora possa reduzir a contaminação da a-amilase termoestável na análise de FDN. O método oficial da AOAC 
proteica sobre a FDN, o sulfito de sódio não é capaz de anulá-la inclui um processo de padronização de atividade da enzima, a qual é 
completanmente (Gomes et al., 2012). Somando-se a isso o fato da utilizada em duas instâncias: durante a extração e durante o processo de 
solubilização de lignina, entende-se que a utilização do sulfito de sódio é 
filtração (Mertens, 2002). Em trabalho conduzido pelo grupo de pesquisa 
controversa e capaz de gerar mais prejuízos do que benefícios. Logo, na gerenciado pelo comitê organizador deste Manual, verificou-se que a 
necessidade de correção para contaminação proteica, o presente Manual segunda adição de a-amilase (i.e., durante a filtração) n�o modifica o 
valor do resíduo insolúvel em detergente neutro (Barbosa et al., 2015), 
sugere a quantificaç�ão direta da proteína associada à fibra e seu desconto 
não sendo, assim, aqui recomendada. de forma aritmética. Para o caso de estudos que possuam interesse direto 
Adicionalmente, não há aqui recomendação para um processo de no valor da proteína associada à fibra ou da concentração de lignina (por 
padronização para a atividade enzimática. Isso se dá pelo fato de o métodoanálise sequencial), o sulfito de sódio não deve ser utilizado (Van Soest 
se basear no uso de enzimas industriais, cuja padrão de atividade faz parte 
et al., 1991).
das caracteristicas do produto (Gomes et al., 2014). Logo. o procedimento 
135 134 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
analítico se toma menos laborioso e rápido. A enzima sugerida - Aparelho analisador de fibras Ankom ou Ankom ou 
produzida pelo Bacillus licheniformis e comercialmente encontrada como AnkomDELTA ou autoclave 
Termamyl 2X ou Lyquozime Supra 2.2.X. A diferença entre ambas - Erlenmeyers (4 e 10 L) 
consiste basicamente do nível de atividade do produto ofertado n0 Coletores universais autoclaváveis 
mercado, que é de 240 e 300 KNU/g, respectivamente. Ambas são Panela de alumínio 
igualmente efetivas (Gomes et al, 2014), sendo que a segunda tende a - Bandejas de alumínio 
substituir comercialmente a primeira devido à sua maior atividade" - Fogão ou fogareiro 
7.1.1. Métodos para fibras utilizando filter bags Reagentes 
FDN utilizando analisador de fibras - Método F-001/2 - Sulfato láurico de sódio (NaCHas5O.) P.A. 
FDN utilizando autoclave - Método F-002/2 Etilenodiamino tetra-acético (EDTA) sal dissódico 
FDA utilizando analisador de fibras - Método F-003/2 (CioH1aNOs.2Na.2H:0) didratado P.A. ou EDTA ácido
FDA utilizando autoclave - Método F-004/2 (CoHNOs) P.A. e hidróxido de sódio (NaOH) P.A. 
- Tetraborato de sódio (Na.B.0.10H:0) decahidratado P.A. 
Aparatos 
- Fosfato de sódio dibásico anidro (Na-HPOs) ou heptahidratado 
Balança analítica com precisão de 0,0001 g (NaoHPO4.7H20) P.A. 
- Dessecador - Trietilenoglicol (CsH1sO:) P.A. 
- Estufa com circulação forçada de ar - -amilase termo-estável (Lyquozime Supra 2.2.X, Novozymes, 
- Estufa sem circulação forçada de ar Araucária, PR, Brasil)
Sacos FS7 (Ankom®) ou de tecido não tecido (TNT, 100 g/m) - Åcido sulfúrico (H:S0s) concentrado P.A. 
- Seladora - Brometo de cetil trimetilamônio (CH4:BrN) P.A. (cetremide ou CTAB)
- Acetona (C.HO) P.A. 
KNU significa kilo novo units e representa a quantidade de a-amilase que, Detergente neutro comercial 
sob condições padrões(pH 7,1;37°C), dextriniza 5,26 g de amido. 
136 137 
INCT Ciência Aninal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
Soluções Solução de detergente ácido 
- Em Erlenmeyer de 10 L, adicione 4 L de água destilada previamente I Solução de detergente neutro comercial 
aquecida. Adicione 200 g de CTAB P.A. e agite levemente. Adicione Em Erlenmeyer de 4 L, adicione 1 L de água destilada e 80 mLde 
lentamente 277 mL de ácido sulfúrico concentrado P.A. Agite atéé a detergente neutro comercial. Agite até a completa homogeneização 
solubilização e complete o volume com água destilada. 
e complete o volume com água destilada. 
Procedimentos 
Solução de detergente neutro
- Em Erlenmeyer de 10 L, adicione 4 L de água destilada previamente Use balança analítica aferida pelo INMETRO, com precisãoo 
aquecida. Adicione 300 g de sulfato 1áurico de sódio P.A., 186,1 g de 0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente 
de EDTA sal dissódico P.A. (ou 146,1 g de EDTA ácido P.A. e 40 g climatizado (20-25°C ou de acordo com as especificações do 
de hidróxido de sódio P.A.), 68,1 g de tetraborato de sódio fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua 
decahidratado P.A., 45,6 g de fosfato de sódio dibásico anidro P.A. estabilização. 
(ou 81,54 g de fosfato de sódio dibásico heptahidratado P.A.) e 100 
Preparação dos filter bags 
mL de trietilenoglicol P.A. Agite até a completa solubilização. 
Complete o volume com água destilada. O pH final da solução deve 1. Identifique os filter bags com marcador permanente. 
estar entre 6,95 e 7,05. Caso o pH final esteja abaixo de 6,50 ou 2. Acondicione os filter bags em panela de alumínio e adicione a solução 
acima de 7,50, descarte a solução. Para pH final de de detergente neutro comercial em volume suficiente para cobrir todo o 
6,50spH<6,95, ajuste para a faixa ideal com adição de pequenas material. 
porções de hidróxido de sódio. Para pH final de 7,05<pHS7,50 3.Leve o recipiente ao fogão ou fogareiro e aqueça. A solução deve 
ajuste para a faixa ideal gotejando ácido clorídrico concentrado. 
ser mantida em ebulição por 15 minutos.
Sob temperaturas ambientes baixas pode haver precipitação 4. Lave os filter bags com água corrente até a 
total retirada do 
parcial na solução armazenada. Nesses casos, aqueça levemente detergente. 
a solução e agite para a ressolubulização antes do uso. 
139 138 
INCT Ciência Animal Métodos paru Análise de Alimentos - 2" Edição 
5. Seque os filter bags em bandejas (canmada delgada sem 16.Acondicione os filter bags individualmente em coletores universais 
sobreposição), sequencialmente, em estufa com circulação forçada autoclaváveis e adicione solução de detergente neutro à 
de ar a 55°C por 24 horas e em estufa não ventilada a 105°C por 2 
temperatura ambiente. A relação detergente:amostra deve ser de, 
horas. aproximadamente, 100 mL/g.
6. Acondicione os filter bags em dessecador (máximo de 20 unidades
2. Adicione a-amilase termoestável (Lyquozime Supra 2.2.X) na 
por procedimento) e aguarde o equilbrio com a temperatura 
proporção de 500 uL/amostra. 
ambiente. 
7. Pese os filter bagse registre o peso. Esse será o peso da tara.
3. Aqueça a solução em aparelho analisador de fibras Ankom ou 
8. Acondicione as amostras nos filter bags seguindo-se a relação de 20 Ankom20 ou AnkomLT ou autoclave à temperatura de 105°Ce
mg de matéria seca por centímetro quadrado de superfície. Sacos F57 mantenha por 1 hora. O tempo de extraç�o é contabilizado após 
possuem aproximadamente 36 cm2 de superfície. Assim, seriam a temperatura ser atingida. 
necessários 720 mg de matéria seca ou, aproximadamente, 800 mg de 
4. Lave os filter bags com água destilada quente (temperatura >90°C) amostra seca ao ar. O mesmo raciocínio é seguido para os filter bags 
até a completa retirada da solução de detergente. 
confeccionados com TNT, cujas dimensões sugeridas são de 4,0 x 4,5 
cm. As amostras devem ser obrigatoriamente processadas em 5. Adicione os filter bags em um recipiente e cubra-os com 
acetona. 
moinho de facas com peneira de porosidade de 1 mm. Agite por 3 a 5 minutos.
6. Seque os filter bags em bandejas (camada delgada 
sem 
Extração 
sobreposição), sequencialmente, em 
estufa com circulação forçada 
la.Acondicione os filter bags em aparelho analisador de fibras de ar a 55°C por 24 horas e em estufa não 
ventilada a 105°C por 2 
Ankom2 ou Ankom ou AnkomIA e adicione soluç�o de horas. 
detergente neutro à temperatura ambiente. A relação 
detergente:amostra deve ser de, aproximadamente, 100 mL/g; ou 
141 
140 
Métodos ari Ari dicuo INCT Ciência Animal 
en jue. m:1s Sa d fibra insoluvel em detergente neutro ou ácido Acondicione os filter bags em dessecador (máximo de 20 unidades 
(gFB = tara ou peso do filter bag (g): %FaSA = percentual de fibra por procedimento) e aguarde o equilibrio com a temperatura 
insolúvel em detergente neutro ou ácido com base na amostra seca ao ambiente. 
ar; ASA massa de amostra seca ao ar (g): %Fus = percentual de 
fibra insolúvel em detergente neutro ou ácido com base na matéria 
8. Pese os filter bags e registre o peso.
seca, e %ASE = percentual de "amostra seca em estufa". 
A avaliação da FDA deve ser realizada sequencialmente à 
Exemplo de cálculo FDN repetindo-se os procedimentos 1 a 8, substituindo-se a solução
de detergente neutro por solução de detergente ácido e omitindo-sea 
Considerando a alíquota 1 da tabela a seguir, têm-se os 
adição de a-amilase termoestável. 
cálculos para as estimativas de fibra insolúvel em detergente neutro e 
em detergente ácido:
Cálculo da coucentração de fibra
FDN=(FB+FDN)-FB=0,7055-0,4041=0,3014 g Para o cálculo da concentração de fibra, utilize as equações: 
0,3014 
19x100=42,86% 
FDN 
96FDNASA ASA x100= 0.7033 F=(FB+F-FB 
o6FDNASA100q586 4281O0-44,71% 
F 
%FDNMs9/6ASE x100 %F ASA ASA 
FDA=(FB+FDA)-FB=0,5440-0,4041=0,1399 g /%F ASA 100 6 Fus 90ASE 
0,1399 FDA 
%FDAASA ASA x100= x100=19,89% 0,7033 
143 142 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
19,89 96FDAASA100-a5.86 7.1.2. Métodos para fibras utilizando cadinhos filtrantes 6FDAMs %ASE 95.86 *LO0=20,75% 
FDN utilizando extrator de fibras - Método F-012/1 
FDN utilizando autoclave - Método F-013/1Alíquota 
Item FDA utilizando extrator de fibras - Método F-014/1 2 
FB (g) 0,4041 0,5410 0,4130 
FDA utilizando autoclave - Método F-015/1
ASA (g) 0,7033 0,8168 0,7311 
FB+ FDN (g) 0.7055 0,8994 0,7332 Aparatos
FB+FDA (g) 0,5440 0,6865 0,5541 Balança analítica com precisão de 0.0001 g 
FDN (g) 0,3014 0,3584 0,3202 - Dessecador 
FDA ) 0,1399 0,1455 0,1411 Estufa com circulação forçada de ar 
T6FDNASA 42,86 43,88 43,80 Estufa sem circulação forçada dear 
oFDAASA 19,89 17,81 19,30 Cadinhos filtrantes em borossilicato com porosidade grossa (40-60 
%ASE 95,86 um) e 50 mL de capacidade 
oFDNMs 44,71 45,77 45,69 Aparelho extrator de fibras Marconi MA450 ou similar ou autoclave 
%FDAMs 20,75 18,5 20,13 - Béqueres 600 mL forma alta 
%FDNMs (média) 45,39 
- Erlenmeyers (4 e 10 L) 
oFDAMs (média) 19,82 -Coletores universais autoclaváveis 
- Forno mufla
- Bomba de vácuo acoplada, em linha, a um kitassato e a um suporte 
para cadinhos filtrantes 
- Pissetas de 500 ml em polietileno 
144 45 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
Reagentes Procedimentos 
- Sulfato láurico de sódio (NaC12H2sSO,) P.A. Use balança analítica aferida pelo INMETRO. com precisão 
- Etilenodiamino tetra-acético (EDTA) sal dissódico de 0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente 
(CioH1N 0s.2Na.2H.0) diidratado P.A. ou EDTA ácido climatizado (20-25°C ou de acordo com as especificações do 
(C1oH1N:Os) P.A. e hidróxido de sódio (NaOH) P.A. fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua 
- Tetraborato de sódio (NaB,07.10H0) decahidratado P.A. estabilização. 
- Fosfato de sódio dibásico anidro (Na2HPO.) ou heptahidratado Preparação dos cadinhos 
(NaHPO.7H:0) P.A. 
- Trietilenoglicol (CsH10.) P.A. 1 Acondicione os cadinhos filtrantes em formo mufla. Aqueça
- d-amilase termo-estável (Lyquozime Supra 2.2.X, Novozymes, lentamente a mufla até atingir a temperatura de 500°C e mantenha 
Araucária, PR, Brasil) sob esta condição por 2 horas.
Acido sulfúrico (H2SO4) concentrado P.A. 2. Desligue a mufla e aguarde seu resfiriamento, o qual deve ocomer. 
Brometo de cetil trimetilamônio (C9H42BrN) P.A. (cetremide ou preferencialmente, com o equipamento fechado. 
CTAB) 3. Retire os cadinhos da mufla, lave-os com um jato de água em 
- Acetona (C3H0) P.A. sentido contrário ao da filtração (da base para o topo) e deixe-os 
secar na bancada ou em estufa com ventilaç�ão forçada.
Soluções 4. Avalie a capacidade filtrante dos cadinhos submetendo-os a0 
seguinte teste: acondicione os eadinhos no suporte para filtraç�ão, 
As soluções de detergente neutro e dcido são produzidas como 
mas sem acionar a bomba de vácuo. Adicione 50 mL de água 
descrito anteriormente. 
destilada e mensure o tempo necessário para a água fluir pelo 
cadinho apenas por gravidade. O tempo ideal deve ser de 180+60
segundos. Cadinhos que se enquadrarem nessa característica estão 
aptos para análise. Caso o tempo de filtração seja menor que 120 
147 146 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
segundos, o cadinho deve ser descartado. CasO o tempo seja 2. Adicione aos coletores universais ou aos béqueres a solução de superior a 240 segundos, o cadinho deve ser submetido a um detergente neutro à temperatura ambiente. A relação 
processo de limpeza, cuja descrição pode ser encontrada em detergente:amostra deve ser de, aproximadamente, 100 mL/g. Mertens (2002). Após a limpeza, refaça o teste e verifique seo 
cadinho obedece às especificações para análise. Caso não isso não 
3. Adicione a-amilase termoestável (Lyquozi e Supra 2.2.X) na 
ocorra, o mesmo deve ser descartado. proporção de 500 uL/amostra. 
5. Os cadinhos que passarempelo teste de filtração devem ser 4a. Acondicione os coletores universais vedados em autoclave, aqueça acondicionados em estufa não-ventilada a 105°C por 16 horas. à temperatura de 105°C e mantenha por 1 hora. O tempo de 
6. Retire os cadinhos da estufa, acondicione em dessecador (máximo extração é contabilizado após a temperatura ser atingida. 
de 20 unidades por procedimento) e aguarde o equilibrio com a LD 
temperatura ambiente. 4b.Acondicione os béqueres no extrator de fibra, acione o 
7. Pese os cadinhos e registre o peso. Esse será o peso da tara. aquecimento 
e aguarde a ebulição da solução. Regule a temperatura 
e mantenha em ebulição moderada por 1 hora. Durante o processo
Extração de extração é comum que haja aderência de partículas nas paredes 
do béquer. Assim, a cada 15-20 minutos, com o auxílio de uma 
1. Pese, aproximadamente, 0,8 a 1,0 g de amostra seca ao ar e pisseta, lave as paredes internas do béquer com solução de 
acondicione nos coletores universais, para o uso de autoclave, ou detergente neutro de foma a trazer as partículas aderidas de volta
nos béqueres (600 mL), para o uso de extrator de fibras. para a soluç�o em ebulição. O tempo de extração é contabilizado 
Normalmente, alíquotas menores (próximas a 0,8 g) são usadas para após a ebulição ser atingida. 
o método com autoclave devido ao volume reduzido dos coletores 
universais (ver relação detergente:amostra no passo 2). As 
5. Após o tempo de extração, desligue os equipamentos. Os passos
amostras devem ser obrigatoriamente processadas em moinho
que seguem não devem ser executados após o resfriamento das 
de facas com peneira de porosidade de 1 mm. 
alíquotas. Assim, a operacionalização do método deve levar em 
148 149 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
conta a capacidade de condução do processo de filtração sem o 10. Retire os cadinhos, acondicione em dessecador (máximo de 20 
resfriamento das alíquotas. unidades por procedimento) e aguarde o equilibrio com a 
temperatura ambiente. 
6. Acople o cadinho no suporte de filtração. Com o auxílio de água 
destilada quente (temperatura > 90°C), transfira gradativamente o 11. Pese os cadinhos e registre o peso. 
conteúdo do béquer ou coletor universal para o cadinho. Durante a 
transferência, o vácuo deve estar desligado. Caso o volume do A avaliação da FDA deve, preferencialmente, ser realizada 
cadinho seja atingido, pare a transferência e acione o vácuo para sequencialmente à FDN. Os procedimentos são essencialmente os 
drenagem da solução. Após a drenagem, desligue o vácuo e mesmos, mas considerando-se os detalhes descritos abaixo.
continue a transferência. Repita esse procedimento até a Para o caso de extração em autoclave, insira o cadinho contendo 
transferência quantitativa do béquer ou coletor para o cadinho. o resíduo da FDN no coletor universal. Adicione sobre o cadinho a 
solução de detergente ácido na mesma proporç�o recomendada para a 
7. Com o vácuo desligado, lave o resíduo com água destilada quente
extração em detergente neutro (100 mL/g). Considere o peso da ASA e 
(temperatura 90°C). Acione o vácuo e drene. Repita esse 
não do resíduo de FDN. Feche o coletor e extraia como descritoprocedimento até que o material drenado não apresente mais 
anteriormente. Lembre-se de que não se adiciona a-amilase para extração espuma (monitore pelo que é drenado para o kitassato). 
com detergente ácido. Após o témino da extração, abra o coletor,
8. Com o vácuo desligado, direcione um jato de acetona usando uma suspenda o cadinho sobre o mesmo e lave seu exterior com água destilada 
pisseta sobre o resíduo de forma a revolvê-lo. Acione o vácuo e quente (temperatura >90°C), coletando a água da lavagem junto ao 
drene. Repita esse procedimento por três vezes. líquido contido no coletor. Acople o cadinho no suporte de filtração e faça 
a transferência quantitativa. Essa lavagem visa recolher algum resíduo
9. Leve os cadinhos com o resíduo à estufa não ventilada a 105°C por 
sólido que porventura tenha sido deslocado para o exterior do cadinho 
16 horas. 
durante a extração. 
150 151 
INCT Ciência Aninnal Mélodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
Para o caso do uso de extrator de fibra, acondicione o cadinho duas causas distintas: contaminação por erros de procedimento e 
contendo o residuo insolúvel em detergente neutro no interior do béquer contaminação inerente ao método (Detmann & Valadares Filho, 
e adicione a solução de detergente scido. Ao final do período de exiração, 2010). No primeiro caso, a contaminação surge por execução indevida
erga o cadinho com o auxílio de uma pinça e lave seu exterior com água ou por omissão de passos do procedimento. Um exemplo claro seria a 
destilada quente (temperatura 290°C), recolhendo a água no interior do omissão da a-amilase na avaliação de FDN, o que levaria o amido 
béquer. O objetivo é o mesmo descito anteriormente. gelatinizadoa contaminare superestimar o resíduo fibroso insolúvel. 
Para o caso de extrações de FDA não sequenciais (o que pode No segundo caso, os contaminantes são inerentes ao método
ser vantajoso para aqueles que simplesmente almejam acessar a mesmo que todos os procedimentos sejam acuradamente realizados. 
lignina), o processo de extração é similar ao descrito para FDN, apenas Entre esses contaminantes, destacam-se as frações dos compostos 
substituindo-se a solução de detergente neutro por solução de nitrogenados insolúveis em detergente neutro e em detergente ácido,
detergente ácido e omitindo-se o uso da a-amilase. conhecidas como proteína insolúvel em detergente neutro (PIDN) e 
proteína insolúvel em detergente ácido (PIDA), respectivamente. 
Cálculo da concentração de fibra Conceitualmente, a contaminação proteica constitui a maior fonte de 
contaminação das análises de resíduos insolúveis no sistema 
Os cálculos são realizados como descrito no item 7.1.1, apenas 
detergente e sua presença leva à superestimação dos teores de FDN substituindo-se o peso do filter bag pelo peso do cadinho filtrante. 
e FDA nos alimentOs. 
Como discutido anteriormente neste Capítulo, o sulfito de 
1.2. Proteina insolúvel em detergentes neutro e ácido 
sódio tem sido recomendado de forma particular na avaliação da FDN 
Definiçoes básicas com o intuito de reduzir a contaminação proteica sobre o resíduo 
insolúvel. Contudo, de forma controversa, o mesmo promove 
Todas as análises gravimétricas de resíduos fibrosos estão solubilização de lignina (Gomes et al., 2012), indicando ser dúbia a 
sujeitos à interferência por contaminantes. Por sua vez, os 
decisão de sua utilização. Assim, a quantificação direta da 
contaminantes associados aos resíduos fibrosos podem ocorrer por 
7.3 Veja mais detalhes no Capítulo 9. 
152 I53 
Métodos para Análise de Alimentos 2" EdiçaoINCT Ciencia Animal 
Atualizações 
contaminação proteica peimite sua consideração sobre 
o resíduo 
fibroso sem o inconveniente da ação sobre outros macrocomyponentes As duas principais atualizações aqui adotadas são indiretas. A 
da fibra insolúvel. primeira decorre das modificações realizadas a partir do método N-001/2.
Por outro lado. a avaliação da disponibilidade dos compostos 
o qual define a quantificação química do nitrogênio associado à fibra. A 
nitrogenados dos alimentos tem recebido atenção especial em segunda envolve a amostragem de resíduos a partir de cadinhos filtrantes, 
condições tropicais devido à elevada associação destes com a matriz originalmente não utilizados na versão anterior deste Manual. Os 
orgânica da parede celular vegetal; associação essa que interfere sobree procedimentos descritos a seguir são comuns para os resíduos insolúveis 
a a acessibilidade a estes compostos por parte dos microrganismos 
em detergente neutro e ácido. Logo, um único procedimento de 
ruminais (Henriques, et al., 2007). A separação da PIDN da PB dos 
amostragem é descrito, o qual é aplicado ao material obtido após a devida
alimentos amplia o entendimento nutricional funcional doscompostos 
extração com detergente. 
nitrogenados, pois permite a identificação de duas frações distintas: a 
primeira, formada pela proteína solúvel em detergente neutro, com PIDN Método N-004/2 
digestibilidade verdadeira elevada e constante entre alimentos; e a PIDA-Método N-005/2
segunda, formada pela PIDN, com digestibilidade verdadeira reduzida
e variável entre alimentos. Por outro lado, a PIDA, embora um Aparatos
componente da FDA e, portanto, englobando limitações nutricionais 
Balança analítica com precisão de 0.0001 g 
semelhantes, tem sido utilizada como elemento preditor de 
- Tubos de digestão em borossilicato com orla 
disponibilidade proteica por alguns sistemas nutricionais. Dessa 
Tesoura
forma, as frações PIDN e PIDA podem ser funcionalmente utilizadas 
-Espátula metálica 
sendo, em muitos casos, consideradas mais do que meros 
Espátula com ponta de silicone
contaminantes, justificando, uma vez mais, a importância de sua 
Dessecador 
quantificação. 
Estufa sem circulação forçada de ar 
154 55 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
Procedimentos utilizada para avaliação da PIDN ou PIDA. Use dessecador para 
realização das pesagens. A alíquota de fibra não deve ser pesada 1. Use balança analítica aferida pelo INMETR0, com precisão de 
diretamente. 0.0001g. sobre bancada especial de laboratório e em ambiente 
climatizado (20-25°C ou de acordo com as especificações do 3b.Retorne o cadinho filtrante para a estufa não ventilada a 105°C por 
fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua 2 horas e pese novamente, obtendo por diferença a amostra de 
estabilização. resíduo utilizada para avaliação da PIDN ou PIDA. Use dessecador 
para realização das pesagens. A alíquota de fibra näão deve ser 2a. Com cuidado, corte uma das arestas do filter bag contendo o 
pesada diretamente. 
resíduo fibroso. A aresta deve permanecer ainda ligada ao filter 
bag. Com o auxílio de uma espátula metálica, retire de 50 a 200 mg 4. Proceda à avaliação do teor de nitrogênio por intermédio do método 
do resíduo da FDN ou FDA e coloque em tubo de ensaio para N-001/2. 
digestão devidamente identificado. Antes de fazer o corte, 
movimente o filter bag ainda fechado para que a amostra se 
Cálculo da concentração de proteína însolúvel em detergente 
solte do tecido. 
neutro
2b.Com o auxílio de uma espátula com ponta de silicone, retire de 50 
Para o cálculo da contaminação do resíduo insolúvel em 
a 200 mg do resíduo da FDN ou FDA do interior do cadinho
detergente neutro, utilize as equações: 
filtrante e coloque em tubo de ensaio para digestão devidamente 
identificado. Espátulas metálicas não devem ser utilizadas para 
(V-B)xNexfx14x100 
amostragem em cadinhos filtrantes devido à possibilidade de %NIDNFDN FDN 
danos à malha filtrante. 
6PIDN FDN=%NIDNFDNX6,25 3a. Retorne ofilter bag para a estufa não ventilada a 105°C por 2 horas 
e pese novamente, obtendo por diferença a amostra de resíduo
156 157 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
INCT Ciência Animnal
Exemplo de cálculoem que: em que: GNIDNFDN = percentual de nitrogênio insolúvel em 
detergente neutro com base na FDN; V = volume da solução de ácitlo 
Considerando a aliquota 1 da tabela a seguir, têm-se os clorídrico utilizado na titulação (mL); B = volume de ácido clorídrico 
cálculos para as estimativas de proteína insolúvel em detergente utilizado na titulação do "branco" (mL); Ne = normalidade esperada 
neutro (Lembrete: para estimar a proteína insolúvel em detergente da solução de ácido clonídrico; f= fator de correção da normalidade 
ácido, deve-se proceder os mesmos cálculos somente substituindo do ácido clorídrico; e FDN = alíquota de FDN utilizada para avaliação 
NIDN pelo NIDA, a PIDN pela PIDA e a FDN pela FDA):(mg).
Em função das demandas do estudo, a concentração de PIDN 
(V-B) x Ne xfx14x 100 6NIDNFDNpode ser expressa em outras bases utilizando-se as equações: FDN 
(4,1-0,2) x 0,02 x 0,956 x 14 x 100 
%PIDNFDNX%FDNMs 200,26PIDNMs= 100
= 0,52%
6PIDNMSx100 %6PIDNpB6PBMS %PIDNFDN=%NIDNFDNX6,25=0,52x6,25=3,26% 
Considerando-se as médias de concentrações expressas na em que: %PIDNMs = percentual de proteína insolúvel em detergente 
tabela, fazemos a modificação das bases para expressão da PIDN: neutro com base na matéria seca; %FDNMs = percentual de fibra 
insolúvel em detergente neutro com base na matéria seca; %PIDNPB = 
6PIDNFDNX%FDNMs 3,26x45,39 percentual de proteína insolúvel em detergente neutro com base na 6PIDNMs =1,48% 00 100 proteína bruta; %PBus = percentual de proteína bruta com base na 
O6PIDNMS1001 x100=21,99% 
matéria seca. 
1,48 
%PIDNps 6PBMs 6,7 As mesmas equações são utilizadas para os cálculos 
relacionados à PIDA 
159 158 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
Alíquota 7.3. Cinzas insolúveis em detergentes neutro e ácido 
Item 3 
FDN (mg 200.2 199,7 200.0 Definições básicas 
V (mL) 4,1 4,0 4,2 
B (mL) 0,2 As cinzas insolúveis em detergente neutro (CIDN) e ácid 
Ne 0,02 (CIDA) constituem a contaminação mineral residual sobre os resíduos 
f 0,956 insolúveis em detergente neutro e ácido, respectivamente. Sua 
NIDNFDx 0,52 0,51 0,54 presença causa superestimaç�o dos teores de FDN e de FDA em 
%PIDNFDN 3,26 3,18 3,35 alimentos e outros materiais. Embora tenda a ser menor que a 
TOPIDNFDN (média) 3,26 contaminação proteica em muitos materiais, alimentos e outras
T%FDNMs 45,39 amostras sujeitas a contaminação com solo podem exibir níveis 
TOPIDNMs 1,48 elevados de cinzas insolúveis, como é o caso de forragens e fezes de 
T%PBMs 6,73 ruminantes sob pastejo. A correção para cinzas constitui rotina do 
T%PIDNPB 21,99 método de análises de FDN adotado pela AOAC (Mertens, 2002). 
Atualizaçõöes 
Somente duas atualizações são relevadas aqui. Primeiro,a 
inclusão da avaliação de resíduos oriundos do uso de cadinhos
filtrantes, os quais n�ão foram contemplados na primeira edição deste 
Manual. Segundo, ajustes no tempoe temperatura de queima 
adaptando-se os protocolos definidos pela AOAC (Mertens, 2002).
7.4 Veja mais detalhes no Capítulo 9. 160 
161 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
CIDN Método M-002/2 fechado para que a amostra se solte do tecido. Retorne o filter
CIDA -Método M-003/2 bag para a estufa não ventilada a 105°C por 2 horas e pese 
novamente, obtendo por diferença a amostra de resíduo utilizada 
Aparatos 
para avaliação da CIDN ou CIDA. Use dessecador para realização 
- Balança analítica com precisão de 0,0001g das pesagens'", A alíquota de fibra não deve ser pesada 
- Dessecador diretamente. Acondicione os cadinhos contendo as alíquotas no 
Cadinho de porcelana interior da mufla. 
Estufa sem circulação forçada de ar 
2b.Acondicione os cadinhos filtrantes contendo os resíduos de FDN ou 
- Forno mufla com temperatura controlada FDA no interior da mufla. Os pesos do cadinho e cadinho mais resíduo 
foram obtidos durante os processos de quantificação da FDN ou FDA Procedimentos 
3. Ligue a mufla e, aguarde que a mesma alcance temperatura de 
1. Use balança analítica aferida pelo INMETRO, com precisão de 
500°C. E desejável uma rampa de aquecimento de 1 hora para que 
0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente 
a temperatura de ignição seja alcançada. 
climatizado (20-25°C ou de acordo com as especificações do 
fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua 4. Proceda à queima por 3 horas a 500°C. Após este tempo, desligue a 
estabilização. mufla e deixe que a mesma resfrie fechada. A temperatura de retirada
deve estar entre 150 e 200°C. 
2a. Prepare e obtenha a tara dos cadinhos de porcelana como descrito
no método M-001/2. Com cuidado, corte uma das arestas do filter
Nesse passo, ao invés de se queimaruma alíquota, é possível queimar todo 
o filter bag contendo o resíduo. Assim, não seria necessário abrí-lo para 
obtenção da alíquota. O filter bag fechado é acondicionado no interior do 
cadinho. Contudo, faze-senecessária a utilização de "brancos" para 
consideração da contribuição de cinzas oriundas dos filter bags. Ao menos 
três filter bags de peso conhecido devem ser queimados em branco para 
conhecimento da sua contribuição em cinzas (i.e., g cinzas/g de filter bag).
163 
bag contendo o resíduo fibroso. A aresta deve permanecer ainda 
ligada ao filter bag. Com o auxilio de uma espátula metálica, retire
o máximo de resíduo de FDN ou FDA e acondicione no interior do 
cadinho. Antes de fazer o corte, movimente o filter bag ainda 
162 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos 2" Edição 
5. Coloque os cadinhos de porcelana ou os cadinhos filurantes com os 
%CIDN.=0lDNpDNX%FDN,s 
100 resíduos minerais em dessecador, deixe estabilizar com a temperatura 
ambiente. Pese e registre os pesos. 
em que: %CIDNMs = percentual de cinzas insolúveis em detergente 
neutro com base na matéria seca; %FDNMs = percentual de fibra 
Cálculo da concentração de cinzas insolúveis em detergente neutroo insolúvel em detergente neutro com base na matéria seca.
As mesmas equações são utilizadas para os cálculos Para o cálculo da contaminação do resíduo insolúvel em 
relacionados às CIDA 
detergente neutro, utilize as equações:
Exemplo de cálculo 
CIDN=(CAD+CIDN)-CAD 
Considerando a aliquota 1 da tabela abaixo, têm-se os cálculos 
CIDN da estimativa de cinzas insolúveis em detergente neuro (Lembrete: %CIDNFDN=DX100 
para estimar as cinzas insolúveis em detergente ácido, deve-se 
em que: CIDN = massa de cinzas insolúveis em detergente neutro (g) proceder aos mesmos cálculos somente substituindo as CIDN pelas 
CIDA e a FDN pela FDA)5; CAD = peso do cadinho de porcelana ou cadinho filtrante (g): 
%CIDNFDN = percentual de cinzas insolúveis em detergente neutro
com base na fibra insolúvel em detergente neutro; e FDN = massa de CIDN=(CAD+CIDN)-CAD=25,8880-25,8786=0,0094 g 
fibra insolúvel em detergente neutro retirada do filter bag para 
%CIDNFDN X100= 
CIDN 0,0094 
avaliação das CIDN (g) ou o resíduo total de FDN retido no cadinho x100=4,75% 
0,1980 
filtrante (g). 
Em função das demandas do estudo, a concentração de CIDN 
V6 Os cálculos aqui se referem ao uso de alíquotas extraídas de filter bags.
Para o caso de cadinhos filtrantes, o peso da FDN ou FDA corresponde ao 
resíduo integral retido sobre a malha filtrante, o qual foi devidamente 
mensurado durante as avaliações de FDN ou FDA. 
pode ser expressa com base na matéria seca usando-se a equação:
164 165 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição INCT Ciencia Animal 
7.4. Cálculo da fibra insolúvel corrigida para cinzas e proteína 
Alíquota 
Para o cálculo da fibra insolúvel em detergente neutro corigida Item 3 
para cinzas e proteína (FDNcp), use uma das duas equações abaixoCAD (g) 25,8786 24,3287 25,3679 
FDN (g) 0,1980 0,2000 0,1990 
6FDNcpMS=%FDNMs-(%PIDNMs+%CIDNMs) CAD CIDN (g) 25,8880 24,3379 25,3771 
CIDN (g) 0,0094 0,0092 0,0092 
(100-6PIDNFDN-%CIDNFDN) TCIDNFDN 4,75 4,60 4,62 6FDNcpMS=%FDNMsX 100 CIDNFDN (média) 4,66 
%FDNMs 
em que: %FDNcpMs = percentual de fibra insolúvel em detergente neutro 45,39 
TCIDNMS comgida para cinzas e proteína com base na matéria seca; %FDNMs = 2,11 
percentual de fibra insolúvel em detergente neutro com base na matéria
seca; %PIDNMs = percentual de proteína insolúvel em detergente neutroConsiderando-se as médias de concentrações expressas na 
com base na matéria seca, %CIDNMS = percentual de cinzas insolúveis tabela, fazemos a modificação das bases para expressão da CIDN: 
em detergente neutrocom base na matérna seca; %PIDNEDN= percentual 
de proteina insolúvel em detergente neutro com base na fibra insolúvel %CIDN FDNx%FDNMS 4,66x45,39 %CIDNMs em detergente neutro; %CIDNFDN = percentual de cinzas insolúveis em =2,11%100 100 
detergente neutro com base na fibra insolúvel em detergente neutro. 
Para o cálculo da fibra insolúvel em detergente ácido comigida
para cinzas e proteína (FDAcp), utilize as mesmas equações, apenas 
substituindo a FDN pela FDA, a PIDN pela PIDA e as CIDN pelas CIDA 
166 167 
Mélodos para Análise de Alimentos - 2" Edição INCT Ciência Animal 
Exemplo de cálculo Literatura Citada 
BARBOSA, M.M.; DETMANN, E.; ROCHA, G.C.: FRANCO, M.O. 
VALADARES FILHO, S.C. Evaluation of laboratory procedures to 
quantify the neutral detergent fiber content in forage, concentrate, and 
ruminant feces. Journal of AOAC International, v.98, p.883-889, 2015.
CASALI, A.0.; DETMANN, E; VALADARES FILHO, S.C.; PEREIRA, J.C. 
CUNHA, M.; DETMANN, K.S.C.; PAULINO, M.F. Estimação de teores de 
componentes fibrosos em alimentos para ruminantes em sacos de diferentes 
tecidos. Revista Brasileira de Zootecnia, v.38, p.130-138, 2009. 
Considerando as médias das concentrações de FDN, 
PIDN e 
CIDN expressas anteriormente, 
fazemos:
6FDNcpMS6FDNus-(%PIDNMs+6ClIDNMs) 
%FDNcPMS= 45,39- (1,48+2,11)=41,809% CODEX ALIMENTARIUS COMISSION. Procedural manual. 26th ed. 
Rome: Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2018. 253p.
DETMANN, E. Fibra na nutrição de novilhas leiteiras. In: PEREIRA, E.S.; 
PIMENTEL, P.G.; QUEIROZ, A.C. (Eds.) Novilhas leiteiras. Fortaleza: 
Graphiti, 2010. p.253-302. 
ou 
(100-6PIDNFDN-6CIDNFDN) DETMANN, E.; VALADARES FILHO, S.C. On the estinmation of non- 
fibrous carbohydrates in feeds and diets. Arquivo Brasileiro de 
Medicina Veterinária e Zootecnia, v.62, n.4, p. 980-984, 2010.
6FDNcpMS=6FDNMsX 100 
GOMES, D.IL.: DETMANN, E; VALENTE, TNP; VALADARES FILHO0, 
S.C.; QUEIROZ, A.C. Avaliação laboratorial de compostos f+brosos em 
alimentos e fezes bovinas sob diferentes ambientes físicos. Arquivo
Brasileiro de MedicinaVeterinária e Zootecnia, v.63, p.522-525, 2011. 
(100-3,26-4,66) 
6FDNcpMS=45,39x =45,39x0,9208=41,80% 100 
GOMES, D.I; DETMANN, E.; VALADARES FILHO0, S.C.; MEZZOMO, R.; 
SOUZA, N.KP.; QUEIR0Z, A.C.: DETMANN, K.S.c. Evaluation of 
sodium sulfite and protein comection in analyses of fibrous compounds in 
tropical forages. Revista Brasileira de Zootecnia, v.41, p.225-231, 2012.
Como pôde ser percebido, as duas equações 
conduzirão ao 
mesmo resultado, bastando utilizar as bases corretas no processo. 
A 
GOMES, D.I; SAMPAIO, C.B.; DETMANN, E.; VALADARES FILHO, 
S.C.; MEZzOMO, R.; REGADAS FILHO, J.G.L. Uilização de enzimas
industriais na avaliação da fibra insolúvel em detergente neutro em 
amostras com alto teor de amido. Semina. Cièncias Agrárias, v.35, 
p.2629-2642, 2014. 
segunda forma é, de certo modo, mais informativa, pois 
o valor
intermediário produzido, nesse caso 0,9208, indica que 92,08% 
do 
resíduo analisado como FDN era formado por seus principais 
macrocomponentes (i.e., celulose, hemicelulose e lignina). O restante, ou 
HALL, M. B. Methodological challenges in carbohydrate analyses. Revista 
Brasileira de Zootecnia, v.36. p.359-367, 2007 (Suplemento). cerca de 7,92% corresponderiam à contaminação inerente ao método. 
168 169 
INCT Ciencia Animal Métodos para Análise de Alimentos 2" FAicio 
HENRIQUES. L.T.: DETMANN. E.: QUEIROZ. A.C.: VALADARES 
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compounds contents in cattle feed and feces using bags made from 
different textiles. Revista Brasileira de Zootecnia, v.40, p.666-675, 
2011b.
17 170 
étodos para Análise de Alimentos -2" EdiçaoINCT Ciencia Anima 
Capítulo 8 
Y Amido 
Definiçoes hásicas 
Principal carboidrato de reserva dos cereais e das gramíneas 
forrageiras (Van Soest, 1994), o amido pode compor de 70 a 80% dos 
grãos usados para alimentação animal (Silva et al.. 2019). Protegido 
inicialmente por uma camada fibrosa dos grãos (pericarpo). o amido se 
concentra no endosperma, o qual é dividido em aleurona e endosperma 
amiláceo. Por sua vez, o endosperma amiláceo é subdividido em 
endosperma vítreo e farináceo. As células do endosperma amiláceo são 
constituídas por uma parede celular fina, granulos de amido embebidos 
em uma matriz proteica e por corpos proteicos de conformação estérica 
(García-Lara et al., 2019). 
Recentemente, a avaliação de amido tem ganhado destaque nos 
sistemas de análises de alimentos, passando a ser considerada 
juntamente com proteína bruta. gordura bruta, matéria nmineral e tibra)
como a quinta entidade diretamente analisada em sistemas proximais 
de análise de alimentos (ver Capitulo 9). Sua separação dos 
carboidratos não fibrosos (Tebbe et al., 2017; White et al., 2017). gerou
o novo conceito de tração calculada por diferença chamada de matéria 
organica residual (MOR).
172 173 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alim1entos2" Ediçio 
Em termos de nutrição de uminantes, a separaçåv do amido existência de passos mais eficientes, o método original foi modificado 
dos carboidratos não-tibrosos (CNF) nmostra-se cxlremamente e validado por Silva et al. (2019). Nesse processo. diferentes matrizes
funcional. haja vista que a MOR. composta basicamente por fibra orgânicas foram avaliadas. garantindo a robustez do método não só 
solúvel. possui padrão de fermentação distinto. Assim, o entendimento para alimentos, mas também para digestas e fezes, suportando 
em separado propicia melhor antecipação dos efeitos da dicta sobre o avaliação mais ampla não somente para a concentração de amido nos 
padrão de fermentação ruminal (e seus efeitos indiretos sobre saúde e alimentos, mas também para avaliações mais complexas envolvendo 
desempenho animal) e sobre a eficiência energética da dieta em si (e.g., digestão total e parcial. Algumas modificações em termos de preparo 
Corona et al. 2006: Shen et al.. 2018). Por outro lado, para nutrição de de soluçöes foram introduzidas a partir do trabalho de Cooper et al. 
animais não-ruminantes. a separaç�o propicia a avaliação funcional da (1970) para reduzir custos e aumentar sua facilidade de aplicaç�o. 
principal fonte energética para a produção animal (i.e., amido) e as 
fontes de polissacarídeos não-amiláceos solúveis (PNAS), os quais Método da hidrólise enzimática 
interferem efetivamente nos eventos de digestão e absorç�o no (Método G-007/1) 
intestino delgado (e.g.. Rojas-Bonzi et al., 2020; Zurak et al., 2020) 
Aparatos
Por muitos anos, a anáise de amido se baseou na liberação de 
açucares solúveis a partir da hidrólise ácida dos polissacarídeos 
- Balança analítica com precis�o de 0,0001g 
presentes nos alimentos. Contudo, esse tipo de análise não é capaz de -Tubos de ensaio com tampas rosqueáveis (30 mL) 
diferenciar acuradamente monossacarídeos liberados a partir de Béquer (500 mL) 
amostras complexas como alimentos (Hall & Mertens, 2017). Pipetas (100 uL. 500 uL. I mL. 10 mL) 
Balão volumétrico (1 L) Considerando-se a inacurácia de métodos baseados em hidrólises 
ácidas, métodos de natureza enzimática seriam mais específicos em - Funis raiados 
termos das moléculas alvo a serem avaliadas (i.e., amido). Papel de tiltro qualitativo (80 g/m) 
O método aqui adotado deriva-se do método descrito por Zinn - Tubos de ensaio (10 e 30 mL) 
(1990). Contudo, devido a problemas na robustez do método e na - Frasco âmbar (1 L) 
175 174 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição 
- Bolas de vidro 
heptahidratado. Homogeneíze até a solubilização e complete o 
- Banho-maria 
volume com água destilada. 
- Banho de gelo
Espectrofotômetro UV/visível Solução tampão
- Agitador de tubos (vórtex) Em balão volumétrico de 1 L, contendo, aproximadamente, 500 mL 
de água destilada, adicione 9,91 g de acetato de sódio e 7,27 mL. de 
Reagentes ácido acético glacial. Homogeneíze até a solubilização e complete o 
Toluol (CoHCH:) P.A. volume com água destilada. 
Sulfato de zinco heptahidratado (ZnSOs.7H20) P.A. 
Solução de o-toluidina 
- Acetato de sódio anidro (CaHaNaO) P.A. 
- Em balão volumétrico de 1 L, contendo, aproximadamente, 500 mL 
- Acido acético glacial (C>H.O») P.A. 
de ácido acético glacial, adicione 1,5g de tiouréia e homogeneíze até 
-Tiouréia (CSN H,) P.A. 
a dissolução. Em seguida, adicione 60 mL de o-toluidina e 
o-toluidina (CH%CoHLNH:) P.A. (fona líquida; densidade 1,008 glL homogeneize. Complete o volume com ácido acético glacial.
pureza >99,5%)
- Para armazenamento, a solução deve ser mantida em frasco âmbar.
D-glicose anidra P.A. Devido à dificuldade de aquisiç�o dos reagentes, essa solução pode 
- -amilase termo-estável (Lyquozime Supra 2.2.X, Novozymes, 2 ser substituída pela solução de o-toluidina 0,6 M Sigma T1 199. Araucária, PR, Brasil) 
Armiloglugosidade (AMG 300L, Novozymes, Araucária, PR, Brasil) Procedimentos 
Soluções 1. Use balanç: 
analítica aferida pelo INMETRO, com precisão de 
0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente 
Solução de zinco 15% 
climatizado (20-25°C ou de acordo com as especificações do 
- Em balãovolumétrico de 1 L, contendo, aproximadamente, 500 mL 
de água destilada, adicione 267,18 g de sulfato de zinco 
176 177 
INCT Ciencia Animal
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua 6. Remova os tubos do banho de gelo e adicione 9.5 mL da solução estabilização. lampão e 0.5 mlL de amiloglucosidade, agite gentilmente. Incube 
em banho-maria a 39°C por 2 horas (agite gentilmente a cada 30 2. Pese 0.50. 100. 150. 200 e 250 mg de D-glicose em tubos de ensaio de 
minutos). 30 mL com tampa rosqueável. Três aspectos devem ser relevados nesse 
passo. Primeiro, os valores acima descritos se referem a D-glicose pura. 7. Remova os tubos do banho-maria e mantenha-os em banho de gelo Logo. a quantidade deD-glicose a ser pesada deve ser ponderada para a 
por 10 minutos.
pureza do produto adquirido. Segundo, os valores acima apresentam 
8. Remova os tubos do banho de gelo e adicione 2 mL da solução de tolerância de #0,2 mg (ex: o padrão de 50 mg pode variar de 49,8 a 50,2 
zinco 15%. Agite os tubos em vórtex e mantenha em repouso em g de D-glicose pura). Contudo, no momento dos cálculos, o valor real 
temperatura ambiente por 10 minutos.pesado deve ser utilizado. Terceiro, os padrões devem ser analisados 
concomitantemente às alíquotas de amostras. 9. Utilizando funis e papel de filtro qualitativo (30 g/m), filtre o 
conteúdo em tubos de ensaio de 30 mL. 3. Pese, aproximadamente, 250 mg de amostra seca ao ar de amostra 
(processada em moinho com peneira de porosidade I mm) em tubo 10. Pipete I mL do filtrado em tubos de ensaio de 10 mL e adicione 5 
de ensaio de 30 mL com tampa rosqueável. mL de água destilada. Agite os tubos manualmente. 
4. Adicione aos tubos 10 mL de água destilada, 0,5 mL de a-amilase 11. Pipete 100 uL da solução diluída em tubos de ensaio de 10 mL e 
adicione 4 mL da solução de o-toluidina. Cubra os tubos com bolas termoestávele uma gota de toluol. Agite gentilmente os tubos e 
incube-os em banho-maria a 90°C por 2 horas (agite gentilmente a de vidro e incube-os em banho-maria a 100°C por 10 minutos.
cada 30 minutos). 
12. Remova os tubos do banho-maria e mantenha-os em banho de gelo 
5. Remova os tubos do banho-maria e mantenha-os em banho de gelo por 5 minutos. 
por 10 minutos.
179 178 
INCT Ciência Animal
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
13. Remova os tubos do banho de gelo e mantenha-os sobre a bancada 
em que: B = fator de conversão de absorbância em massa por 
até o equilíbrio com a temperatura ambiente. 
intcrmédio da Lei de Lambert-Beer (/g): P = quantidade de glicose no 
padrão i (g); Ai = absorbância no padrão i: G = quantidade de glicose 
14. Leia as absorbââncias a 630 nm em espectrofotômetro UV/visível. 
obtida a partir da amostra (g); AA = absorbância para a amostra: e 
Utilize o padrão de 0 mg de glicose para ajustar o "zero" do 
%GASA = Concentração de glicose com base na amostra seca ao ar. 
equipamento. Leia os demais padrões em sequência e então as 
amostras em análise. Devido à característica viscosa da solução 
E desejável que G esteja entre 0,050 e 0,200 g. Quanto mais 
final contendo o-toluidina, recomenda-se que cada padrão ou 
próximo à mélia, maior a confiabilidade da leitura. Leituras no 
amostra seja lida em uma cubeta individual e limpa. Para 
extremo superior (0,200-0,250 g) possuem baixa confiabilidade. facilitar os procedimentos e reduzir os custos, o uso de cubetas 
Leituras no extremo inferior (0-0,050 g), além da baixade acrílico é recomendado: 
confiabilidade, poderão sofrer interferências significativas do 
ruído do equipamento. A G pode ser ajustada pelo analistaCálculo da concentração de amido
variando-se a alíquota de ASA usada. Extrapolações (i.e., G > 
0,250 mg) não são toleradas. Utilize sequencialmente as equações abaixo:
Proceda à correção da amostra para umidade residual e à B2(PxA EP conversão em equivalente amido:
%&ASA x 100 %GMs/6ASE 
%AMs = %GMs X 0,9 
G 
100 %G ASA ASA 
181 180 
INCT Ciência Aninmal
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
em que: Gws = percentual de glicose com base na matéria seca; %ASE 
B= (PxA,) (0,000x0,000)+...+(0,250x0,448) A8) -1,795= percentual de "amostra seca em estuta"; %AMs = percentual de 0,0002+...+0,2502 equivalente amido com base na maténia seca. 
O coeficiente 0.9 é empregado pelo fato de haver a perda de 
AA 0,300 
uma molécula de água quando ocorre a ligação a entre duas moléculas 1.79510,1671g 
de glicose para formar a molécula de amido. Tal ligação implica, em 
média. na perda de 10% do peso quando da conversão de glicose em 
G 
9/%G ASA ASA 0,1671 oG ASAASA x100= 0,257100=65,00% equivalente amido. 
65,00 %GASA 10029.32 Exemplo de cálculo MS0ASEX0Ua 25 X100=72,78% 
Alíquota (ASA): 0,2517 g 
%AMS=%GMsX0,9=72,78x0,9=65,50% oASE: 89.32%
Absorbância: 0,300
Literatura Citada 
COOPER, E.R.; McDANIEL, V.: BAER, D.M.: DUBOWSKI, K.; 
MORRISON, D.B.; VANDERLINDE. R.: FASCE, C.; KOWALSKI, P. 
The deternmination of glucose by the ortho-toluidine method (filtrate and 
direct procedure). In: MacDONALD, R.P. (Ed.) Standard methods of 
clinical chemistry, v.6. Amsterdan: Elsevier, 1970. p.159-170. 
Padrão (mg) Quantidade real (g) Absorbância 
0,000 0,000
50 0,050 0,081 
CORONA, L.; OWENS, F.N.; ZINN, R.A. Impact of corn vitreousness and 
processing on site and extent of digestion by feedlot cattle. Journal of 
Animal Science, v.84, p.3020-303 1, 2006.
100 0,099 0,166
50 0,151 0,265 
200 GARCIA-LARA, S.; CHUCK-HERNANDEz, C.; SERNA-SALDIVAR, 
S.O. Development and structure of the corn kernel. In: SERNA- 
SALDIVAR, S.O. (Ed.) Corn: chemistry and technology. 3 ed. 
Duxford: Woodhead Publishing, 2019. p.147-164 
0,202 0,376 
250 0,250 0,448
182 183 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
HALL. M.B.: MERTENS. D.R. A 100-Yecar review: carbohydrates 
characterization. digestion, and utilization Journal of Dairy Science,
v.100. p. 10078-10093. 2017. 
Capítulo 9 
ROJAS-BONZI. P.; VANGSØE, C.T.; NIELSEN, K.L.; LÆRKE, H.N.; 
HEDEMANN. M.S.: KNUDSEN, K.E.B. The relationship between in 
vitro and in vivo starch digestion kinetics of breads varying in dietary
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Carboidratos não-fibrosos e matéria orgânica 
residual 
SHEN. Y. ZHAO, F.: YU, L.; YANG, W.; WANG, M.; WANG, H. Starch
sources and concentration in diet of dairy goats affected ruminal pH and 
fermentation, and inflammatory response. Animal Production Science,
v.59. p.1640-1647, 2018.
A partir do estabelecimento dos pressupostos para avaliação 
quantitativa de alimentos na Estação Experimental de Weende no século 
XIX, quatro grupos de compostos químicos foram adotados como análises SILVA, B.C.: GODOI, L.A.; VALADARES FILHO, S.C.; ZANETTI, D.; 
BENEDETI, P.B.; DETMANN, E. A suitable enzymatic method for 
starch quantification in different organic matrices. MethodsX, v.6, 
p.2322-2328, 2019. 
laboratoriais de rotina para alimentos: cinzas ou maténa mineral (MM), 
proteína bruta (PB), gordura bruta ou extrato etéreo (EE) e fibra bruta (FB). 
TEBBE, A.W.; FAULKNER, M.J.; WEISS, W.P. Effect of partitioning the 
nonfiber carbohydrate fraction and neutral detergent fiber method on 
digestibility of carbohydrates by dairy cows. Journal of Dairy Science, 
v.100. p.6218-6228, 2017.
Contudo, a avaliação quantitativa de um alimento deve se basear
na pressuposição de que sua composiç�o centesimal é inteiramente 
conhecida. Portanto, a união dos compostos químicos definidos acima em 
Van SOEST, P.J. Nutritional ecology of the ruminant. 2 ed. Ithaca: Cornell 
University Press, 1994. 476p. 
uma avaliação quantitativa de alimento somente pode ser realizada se,e 
somente se, sua soma produzisse a composição total do alimento. Isto WHITE, R.R.; ROMAN-GARCIA, Y.; FIRKINS, J.L; VANDEHAAR, 
MJ.; ARMENTANO, L.E.; WEISS, w.P.; MCGILL, T.GARNETT, 
R.HANIGAN, M.D. Evaluation of the National Research Council (2001)
dairy model and derivation of new prediction equations. 1. Digestibilityof fiber, fat, protein, and nonfiber carbohydrate. Journal of Dairy 
Science, v.100, p.3591-3610, 2017. 
obviamente não é verificado. A partir disso, um quinto grupo químico foi 
estabelecido, o qual deveria compreender todas as características 
químicas que não fossem contempladas nos demais gupos. Este novo 
grupo de compostos químicos seria estimado como ZINN, R. Influence of flake density on the comparative feeding value of 
steam-flaked corn for feedlot cattle. Journal of Animal Science, v.68, 
p.767-775, 1990. ENN = 100 - MM - PB - EE - FB (1) 
ZURAK, D.; KLJAK, K.; GRBE`A, D. The composition of floury and 
vitreous endosperm affects starch digestibility kinetics of the whole maize
kernel. Journal of Cereal Science, v.95, p. 103079, 2020. 
em que ENN é o extrativo não nitrogenado. Todos os termos são 
expressos como percentual da matéria seca (MS).
184 185 
INCT Cincia Animnal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
De um ponto de vista teórico, o ENN deveria compreender dos compostos fibrosos, constitui a principal limitação funcional para 
todos os compostos não nitrogenados, não gordurosos e não fibrosos utilização da FB e do ENN na nutrição de ruminantes. 
do alimento e deveria apresentar alta digestibilidade (pois conteria A partir do desenvolvimento do conceito analitico de fibra
amido, açúcares. etc). Adicionalmente, como o ENN é calculado por insolúvel em detergente neutro (FDN) por P.J. Van Soest na década de 
diferença (Equação 1), a soma dos cinco grupos de compost 1960, novas perspecti vas foram geradas para a avaliação quantitativa de 
químicos resultaria no alimento total (100%), fazendo com que a alimentos e dietas para animais ruminantes. A FDN representa uma 
suposição básica para avaliação quantitativa fosse suprida. aproximação química da fibra insolúvel em meio aquoso (como o rúmen) 
Ao contrário do ENN, a FB deveria representar ou mensurar e coresponde à porção do alimento que efetivamente causa efeito de 
o material indigestível dos alimentos, notoriamente para animais não enchimento no rúmen ou em outros segmentos do trato gastrintest1nal 
ruminantes. O conceito analítico FB foi baseado em características (Detmann, 2010). A FDN é formada basicamente por celulose. 
químicas da digestão (extração em ácido, simulando as condições hemicelulose e lignina e sua utilização elimina grande parte das distorções 
estomacais, seguida por extração em base, simulando as condições de causadas pela solubilização de compostos fibrosos durante a análise por 
intestino delgado) (Detmann, 2010). No entanto, a extração ácido-base intermédio do conceito de FB. 
causa a solubilização de hemicelulose e de lignina solúvel em álcali (Van A substituição da FB pela FDN representa uma opção lógica na 
Soest, 1994). Portanto, a FB é teoricamente formada por celulose, lignina nutrição de animais numinantes, pois confere entendimento nutricional 
insolúvel em álcali e por resíduos de hemicelulose. Assim, grande parte da mais concreto e amplo de alimentos e dietas. Contudo, a alteração do 
hemicelulose e da lignina seria incluída no ENN". A partir disso, o ENN, conceito analitico aplicado à avaliação da fração fibrosa do alimento 
o qual deveria representar a fração facilmente digerível dos carboidratos, obviamente demanda a modificação da interpretação do grupode 
passa a apresentar digestibilidade baixa e altamente variável entre compostos químicos calculado "por diferença". Assim, quando 
utilizada 
alimentos (Detmann, 2010). Este aspecto, em conjunto com a subestimação a FDN, o conceito de ENN não deve ser utilizado, pois este deve somente 
ser associado ao uso do conceito analitico de FB. 
Inicialmente, o novo gupo de compostos calculado "por 
Na prática, devido às interações entre os componentes da parede celular e 
à ação dos reagentes/condições de extração, uma pequena porção de celulose
pode também compor o ENN. 
diferença" foi denominado de carboidratos não estruturais (Sniffen 
et 
187 186 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
al.. 1992). Contudo. uma inconsistência teórica foi observada com esta 
Torna-se importante ressaltar que a equação (3)) pode ser 
nomenclatura. pois a pectina (um composto fibroso solúvel com papel 
encontrada com outro formato na literatura, no qual o EE é substituído 
estrutural na planta) seria classificada como não estrutural. 
pelos ácidos graxos de cadeia longa (AGCL: i.e., ácidos graxos com 
Posteriormente. essa nomenclatura foi alterada para carboidratos não 
cadeias maiores que quatro carbonos; Tebbe et al.. 2017: NASEM.
fibrosos (CNF; Mertens,1997). 2021). O uso de AGCL possui a vantagem inerente de deslocar a 
Neste contexto, o novo grup0 de compostos quimicos seria fração não-graxa do EE para a MOR. Isso é vantajoso. pois 
estimado como: 
componentes como o glicerol possuem potencial de contribuição 
energética parecido com os demais componentes da MOR (e.g..CNF = 100 - MM- PB -EE FDN (2 ); 
açucares solúveis, fibra solúvel), mas inferior aos lipídeos. Isso 
Em sistemas mais recentes de avaliaç�ão quantitativa de aumenta a exatidão da interpretação energética dos alimentos/dietas. 
alimentos, o amido contido nos alimentos passou a ser (ao lado de Contudo, a avaliação direta de AGCL possui base cromatográfica 
MM, PB, EE e FDN) a quinta entidade diretamente analisada (Tebbe (Sukhija & Palmiquist, 1988; Weiss & Wyatt, 2003), sendo de difícil 
et al., 2017; White et al., 2017; NASEM, 2021). Dessa forma um novo acesso como análise de rotina na maioria dos laboratórios de análise
de alimentos no Brasil. Desta forma, embora ciente do maior vício componente calculado por diferença é definido pela separação entre
causado pelo uso do EE, o comitê organizador deste Manual optou por amido e os demais componentes do CNF, o qual passa a ser formado 
sua manutenção para estimação dos componentes calculados por essencialmente por fibra solúvel em detergente neutro e outros 
diferença devido à maior acessibilidade de análise.
componentes minoritários como açúcares e ácidos orgânicos. Esse 
Em termos de nutrição de ruminantes, a separação do amido 
passa a ser denominado de matéria orgânica residual (MOR; Tebbe et 
dos CNF mostra-se extremamente funcional, haja vista que a MOR al., 2017), sendo definido por: 
composta basicamente por fibra solúvel, possui padrão de fermentação 
MOR = 100 MM- PB - EE - A - FDN (3) distinto. Assim, o entendimento em separado propicia melhor 
antecipação dos efeitos da dieta sobre o padrão de fermentação ruminal 
em que A éa concentração de amido como percentual da MS. 
(e seus efeitos indiretos sobre saúde e desempenho animal) e sobre a 
188 189 
INCT Ciência Animal Mélodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
eficiência energética da dieta em si. Por outro lado. para nutriçâo de CNF = 100 MM- EE -FDN - (PB PBu +U) (4): 
animais não-ruminantes. a separação propicia a avaliação funcional da 
MOR = 100 - MM - EE - A - FDN (PB - PBu +U) (5): 
principal fonte energética para a produção animal (i.e., amido) e as 
fontes de polissacarídeos não-amiláceos solúveis (PNAS), os quais em que: PBu = teor de PB oriunda da ureia (ou mistura ureia e sulfato de 
amônio); e Ué o teor de ureia. Todos os termos são expressos como o interferem efetivamente nos eventos de digestão e absorção no 
da MS. 
intestino delgado.
Contudo. um problema básico se ergue a partir da utilização Em situações em que ureia n�o é utilizada percebe-se facilmente 
das equações (2) e (3). Como os CNF e a MOR são calculados por que as equações (4) e (5) convergirão exatamente para aquilo queé 
diferença. estes irão englobar todos os erros associados às estimativas 
exposto nas equações (2)e (3), respectivamente. 
Sob um ponto de vista analítico, os principais vícios associados 
dos componentes químicos que são analisados diretamente. 
Equívoco característico observado quando ureia é incluída 
às estimativas dos teores de CNF e MOR estão associados com problemas 
sobre as estimativasdo teor de FDN. Em geral, estes problemas são 
em concentrados ou dietas. A despeito do fato de a PB da ureia ser 
causados pela presença de contaminantes no resíduo insolúvel em 
estabelecida com base nos pressupostos do método de Kjeldahl (PB = 
detergente neutro, os quais podem ser resultantes de eros nos 
Nx 6,25), o elevado teor de nitrogênio da uréia faz com que seu 
procedimentos de análise ou de contaminações inerentes ao método 
conteúdo em PB seja maior que sua própria massa (45% Nx 6,25 = 
analítico em si. Para todos os casos ocorrerá superestimação dos teores de 
281,25% PB). Esse excesso de PB pode ser potencialmente 
FDNe subestimação dos teores de CNF e MOR. 
transformado em massa real de PB a partir da assimilação do 
Torna-se importante ressaltar que a FDN constitui um método
nitrogênio na forma de proteína microbiana no rúmen. Contudo, este 
analíitico do tipo I de acordo com o Codex Alimentarius, ou seja, o 
excesso não existe no concentrado ou na dieta e implicará em 
resultado obtido é definido pelo método em si (Codex Alimentarius 
subestimação do conteúdo de CNF e de MOR. Assim, em situações 
Comission, 2018). Assim, todo e qualquer método do tipo I (algumas
nas quais ureia (ou misturas como ureia e sulfato de amônio) é 
utilizada em concentrados ou na dieta, correção deve ser adotada para 92 Considerando apenas a discussão deste Capítulo, esse raciocínio é também 
aplicado às análises de EE e MM, pois também constituem entidades 
analíticas obtidas por métodos do tipo I. evitar a subestimação do teor de CNF (Hall, 2000), a qual é dada por: 
191 190 
INCT Ciência Animnal 
Mitodos para Análise de linmentos diin 
vezes denominados de métodos empieos) deve ser seguido 
que levam à superestimação da fibra. Seundo-se tal raciocinio, o tecor de 
rigorosamente em todas as suas etapas metodológicas (Metens, 2003). 
FDN somente pode ser adequadamente ohtido considerando-se pois qualquer desvio ou modificação arbitrária nos procedimentos 
Contaminação pela proteína (PTDN) e pelas cinzas (CIDN) insolúveis em implicará 
na definição de uma nova entidade analítica não comparável
detergente neutro (Dctmann et al. 2008. Detmann. 2010).com aquela que deveria ser produzida pela aplicação do nmétodo original. 
No entanto, as recomendações com relação às corTeções a serem Os equívocos de procedimentos laboratoriais mais comuns irão 
rcalizadas sobre os teores de FDN são algumas vezes controversas e nem superestimar o teor de FDN principalmente por contaminação por amido 
Sempre seguem um padrão. AS formas comigidas de FDN com relação elou influência da gordura sobre a ação do detergente neutro (Detmann, 
aos contaminantes descritos previamente são: 2010: Valente et al. 2011). No primeiro caso, a utilização de uma a- 
amilase termoestável deve ser vista como procedimento obrigatório na FDNp = FDN - PIDDN 
(6) análise de FDN (Mertens, 2002; Valente et al., 2011). Por outro lado, se FDNc = FDN - CIDN 
(7): amostras com alto teor de gordura são submetidas à extração com 
FDNcp = FDN- (PIDN+CIDN) (8): detergente eutro, pode ocorrer a formação de duas diferentes fases, 
em que: FDNp = FDN corrigida para proteína: FDNc = FDN corrigida 
formadas por compostos polares e apolares. Neste caso, pode ocorrer a 
para cinzas; e FDNcp = FDN corrigida para cinzas e proteina. Todosmigração
do detergente para a fase apolar, que é formada pela gordura. 
Os termos são expressos como % da MS. Assim, a ação do detergente neutro se torna limitada na fase polar e o teor 
A FDNp (Equação 6) foi sugerida por Hall (2000) para que se de FDN será superestimado. Amostras com teores de EE superior a 10% 
procedesse à estimação dos CNF. incluindo-se dietas nas quais uréia for (com base na MS) devem ser parcialmente desengorduradas antes de 
utilizada. Contudo, uma inconsistência químicaé observada devido ao fato serem submetidas à extração com detergente neutro (Mertens, 2002;
de as CIDN serem parte da MM. Assim, a omissão da começão para cinzas Valente et al., 2011). 
levará a uma dupla suburação das CIDN na estimação dos teores de CNF. Resíduos fibrosos mensurados gravimetricamente, como a FDON,
Paura ilustrar tal fato. a equação (2) pode ser reeserita utlizando-se estão sujeitos a contaminantes indesejados, porém inerentes ao método,
daas pressuposições: L. a FDN possui obrigatoriamente contaminação por Os quais englobam, de forma geral, compostos nitrogenados e minerais,
193 192 
INCT Ciência Animal
Métodos para Análise de Alimentos2 Ediçin 
minerais além contaminação por pnoteina: e 2. a MM do alinmentodicta
Por outro lado, no método oficial para análise de FDN adotado pode ser fracionada em duas pongöces. uma solível e outra insolivel em 
pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC: Mertens, 2002) detergente neutro. A partir disso. utilizando-se as cquaçöes (2) e (6). faz-se: 
Somente a correção para cin7as foi con iderada (FDNc: Equação 7). 
Pressupondo-se que a PB de um alimento pode ser fracionada em uma CNF 100-(CSDN + CIDN) -PB -EE -FDNp (9a):
porção solúvel e outra insolúvel em detergente neutro e utilizando-se as 
CNF = 100-(CSDN +CIDN) - PB - EE - (FDNcp + CIDN) (96): cquações (2) e (7). faz-se:
em que CSDN são as cinzas solúveis em detergente neutro (% da MS). 
CNF = 100 MM -(PSDN + PIDN) EE -FDNc (10a):Reagrupando-se os termos da equação (9b): 
CNF = 100 MM - PSDN - PIDN EE - (FDNcp + PIDN)(10b): CNF 100-CSDN CIDN -PB -EE -FDNCp -CIDN (9c) 
2 CNF = 100 MM PSDN 2 x PIDN - EE -FDNcp (10c): CNF = 100 CSDN 2 x CIDN-PB - EE- FDNcp (9d) 
em que PSDN é a proteína solúvel em detergente neutro (% da MS). 
Assim. se a correção para cinzas não for considerada, o teor Desta forma, a utilização da FDNc implicará subestimação dos 
de CNF apresentará vício negativo equivalente ao teor de CIDN. A CNF pois haverá dupla subtração da fração PIDN. Analogamente. a 
mesma demonstração pode ser feita utilizando-se a equação (3) e a demonstração apresentada da equação (10) é tacilmente aplicada à 
MOR (Tabela 9.1). equação (3)eà MOR (Tabela 9.1) 
A utilização da FDNp foi sugerida pelo NRC (2001) em No método adotado pela AOAC não se considera o fato de a 
procedimento para se estimar o teor energético de alimentos e dietas para proteína ser o principal contaminante da ibra mensurada 
bovinos. Contudo, mais uma vez se observa inconsistência nutricional gravimetricamente (Van Soest, 1994). A despeito da inclusão de sulfito
(além da questão da subestimação dos CNF), pois cinzas não produzem de sódio na solução de detergente (Mertens, 2002), deve ser ressaltado 
energia (Detmann et al., 2008). ILogo, a correta utilização da FDN em que este composto químico não remove toda a proteina contaminante.
modelos de produção de energia deve obrigatoriamente considerar a Adicionalmente, o sulfito pode extrair parte da ligninae de outros
correção concomitante para CIDN. componentes da fibra insolivel (Van Soest et al., 1991;
Gomes et al., 
195 
194 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
2012) e sua utilização não tem sido recomendada no Brasil (Gomes et al. 
2007; Tebbe et al., 2017). Portanto, a FDNcp (Equação 8) deve ser 2012; Detmann et al.. 2016). 
usada no processo de estimação dos CNFe da MOR. 
Considerando-se os argumentos até aqui apresentados, na Tabela 9.1- Exemplo teórico da estimação dos teores de CNF e MOR 
utilizando-se diferentes aproximações para a FDN avaliação de concentrados ou dietas contendo ureia os CNF e a MOR 
Item devem, portanto, ser estimados como: Teor 
5,0 
21,5 
3,8 
48,5 
20,3 
3,4 
1,5 
18,8 
16,9 
15,4 
MM 
PB CNF 100 - MM - EE - FDNcp - (PB - PBu + U) (11); 
EE 
Amido MOR = 100 MM- EE -A - FDNcp - (PB - PBu + U) (12):
FDN 
PIDN 
CIDN 
Quando a ureia não for utilizada, as equações (11) e (12) 
convergirão para:FDNc2 
FDNp2 
FDNcp? 
CNF 100 MM - EE - FDNcp - PB (13); 
Estimativa 
49,4 
Vício 
-4,9 (PIDN + 
CIDN) 
MOR = 100 MM - EE - A - FDNcp - PB (14): CNF (usando FDN) 
MOR (usando FDN) 
CNF (usando FDNc)MOR (usando FDNc)
CNF (usando FDNp)
MOR (usando FDNp)
CNF (usando FDNcp) 
MOR (usando FDNcp) 
o da MS.2cepindicam coreções para cinzase proteína, respectivamente. 
0,9 
50,9 
2,4 
52,8 
Deve ser novamente enfatizado que a não consideração da 
3,4 (PIDN) ureia causará subestimação dos CNF e da MOR (Tabela 9.2). Por 
-1,5 (CIDN) Outro lado, quando a correção para o teor de ureia é aplicada, verifica- 
4,3 
54,3 
5,8 
se que a soma dos grupos de compostos químicos não produz 100% 
(Tabela 9.2; MM + PB + EE+ FDNcp + CNF = 103,2%). Contudo, 
isto não deve ser visto como vício, mas somente como um reflexo do 
Em adição, a ausência de correções para cinzas e proteína entendimento mais correto da dieta avaliada. 
poderá acaretar em distorções sobre os coeficientes de digestibilidade 
da FDN e dos CNF ou MOR em ensaios com animais (Chizotti et al., 
196 197 
INCT Ciência Anima Métodos ara Análise de Alimentos - 2" Ediçio 
DETMANN, E.: VALADARE 
L.T. PAULINO. M.F. MAGALH K.A.: SILVA. P.A. CHIZZOTTI. M.L. Prediction of the energy value of cattle diets based on 
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Feed Science and Technology. v.143. p. 1 24-147. 2008. 
Tabela 9.2 - Exemplo teórico do processo de estimação dos teores de 
CNF e MOR em uma dieta contendo ureia
FILHO. S.C.: PINA. D.S.; HENRIQUES. 
Teor 
6,0 
Item 
MM 
13,2 
2,0 
5,2 
2,6 
28,2 
40,5 
PB DETMANN, E.; SILVA. T.E. ; VALADARES FILHO. S.C.: SAMPAIO.
C.B.; PALMA, M.N.N. Prediction of the energy value of cattle diets 
based on the chemical composition of feeds. In: VALADARES FILHO: 
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3ed.Viçosa: DZO-UFV. 2016. p.85-118. 
Ureia:Sulfato de amônio (9:1) (U0) 
PBu2 
EE 
Amido 
FDNcp 
CNF (não se considerando a ureia) 
MOR (não se considerando a ureia)
CNF (considerando a ureia) 
MOR (considerando a ureia)
% da MS. 2 Assumindo-se 260% de PB na mistura uréia:sulfato de amônio.
Estimativa 
37,7 
9,5 
Vício 
-3,2 (PBuu 
U 
GOMES, D.I.; DETMANN, E.; VALADARES FILHO. S.C.: MEZzOMO. 
R., SOUZA, N.K.P.; QUEIROZ, A.C.; DETMANN, K.S.C. Evaluation 
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40,9 
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200 201 
Métodos para Análise de Alimentos 2" Ediçio INCT Ciência Animal 
Capítulo 10 
Lignina 
Definiçies básicas 
Dos componentes da parede celular, a lignina. polímero de 
subunidades aromáticas derivadas do ácido shiquímico. é o 
componente mais reconhecido por limitar a digestão dos 
polissacarídeos fibrosos no númen (Van Soest. 1994). No entanto, na 
planta, a lignina exerce papel de proteção sobre os componentes 
polissacarídeos da parede celular. promovendo rigidez e resistência 
fisica, bem como tornando a parede hidrofQbica e impermeável (Jung 
& Allen, 1995). 
Neste contexto, os carboidratos fibrosos das plantas 
forrageiras nem sempre são acessados pelos microrganismos ruminais
devido à presença de compostos fenólicos, como a lignina, que 
formam barreira fisica para a ação dos. sistemas enzimáticos 
microbianos (Dehority, 1993). Assim, o grau de lignificação em tono 
da celulose 6é mais relacionado com a redução da digestibilidade do 
que a concentração total de lignina da planta (Dehority & Johnson.
1961).
202 203 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
Existem diferentes métodos empregados na avaliação de 
rcmanescentes são oxidadas e clivadas (Van Soest. 1994). Neste 
lignina. porém nenhum atende plenamente à expectativa nutricional, 
sentido, a oxidação por permanganato de potássio constitui método relacionando o teor de lignina ao processo digestivo do animal. Há 
para avaliação gravimétrica do teor de lignina (Van Soest & divergencias significativas nos resultados obtidos em laboratórios para 
Robertson, 1985). 
todos os métodos aplicados (Gomes et al., 2011).
O método de lignina Klason difere analiticamente do método
Todos os métodos praticados para avaliação do teor de lignina da hidrólise ácida na sequência com que a concentração do ácido
baseados no isolamento dos componentes químicos apresentam sulfúrico e a temperatura de extraçãosão utilizadas, o que causa limitações no tocante aos processos analíticos, de forma que os 
efeitos diferentes na hidrólise dos polissacarídeos (Hatfield et al.. 
somatórios das partes são sempre contraditórios em uma mesma
1994). Contudo, há de se ressaltar que no método de lignina Klason amostra. Portanto, a afirmação sobre qual método representa melhor a 
não se utiliza detergente catiônico (brometo de cetil trimelamônio; 
quantidade de lignina da amostra e qual estabelece melhor a 
CTAB) como adjuvante, o qual proporciona a limpeza prévia do 
associação com os fenômenos biológicos do processo de degradação 
material que será submetido à hidrolise ácida. Assim, o detergente 
ruminal permanece ainda indefinida (Gomes et al., 2011). ácido é responsável pela obtenção de resíduo aproximadamente livre 
O método de lignina em ácido sulfúrico com extração prévia da interferência proteica (Van Soest & Robertson, 1985), promovendo com detergente ácido (método da hidrólise ácida), adotado como 
solubilização de grande parte da proteína associada à parede celular 
padrão por alguns sistemas nutricionais (eg. NRC, 2001), tipicamente 
(Van Soest, 1994). Portanto, embora o método de Klason apresente subestima os teores de lignina devido à solubilização parcial da mesma 
fortes correlações com a degradação ruminal da fibra, sua 
na solução de detergente ácido (Van Soest, 1994). Nesse método, a contaminação proteica excessiva equer correções para expressão 
perda de lignina particularmente em gramíneas pode chegar a 50% 
mais adequada dos valores obtidos em laboratório (Gomes et al., 
(Lowry et al., 1994). 
2011). 
A lignina também é suscetível à oxidação, a qual aumenta com Deve ser ressaltado que nenhum dos métodos aqui descritos 
a presença de duplas ligações insaturadas e, por apresentar natureza para análise de lignina leva em consideraçãoa interferência da cutina 
fenólica, é facilmente oxidada por uma quinona. As duplas ligações sobre as avaliações realizadas. Para a maioria das amostras, a 
204 
205 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" E.dição 
contribuição da cutina sobre os resíduos avaliados pode ser Método da hidrólise ácida
considerada desprezível. Contudo, essa suposição pode não ser (Método F-005/2) 
adequada para alguns tipos específicos de materiais, como, por 
Aparatos exemplo. palma forrageira e torta/farelo de mamona.
Nesse caso. para evitar a influência da cutina sobre a 
- Balança analítica com precisão de 0,0001 g 
estimativa de lignina, o método da oxidação em permanganato deve Balança semi-analítica com precisão de 0,1 a 0.01 g 
ser preferido (assim, a influência da cutina será contabilizado em - Dessecador 
conjunto com a estimativa de celulose). Caso a quantificação da cutina - Estufa sem circulação forçada de ar 
seja necessária, isso poderá ser realizado pela aplicação sequencial dos - Cadinhos filtrantes em borossilicato com porosidade grossa (40-60 
métodos da hidrólise em ácido e oxidação em permanganato (i.e., um) e S0 mL de capacidade 
hidrólise seguida da oxidação ou oxidação seguida da hidrólise). As 
- Coletores universais autoclaváveis (100-120 mL)
descrições analíticas aqui apresentadas permitem essa realização, mas Bastões de vidro 
uma representação esquemática informativa deste tipo de - Forno mufla 
procedimento pode ser obtida em Van Soest (1994). 
- Bomba de vácuo acoplada, em linha, a um kitassato e a um suporte 
para cadinhos filtrantes 
Atualizaçõões 
Geladeira 
- Termômetro 
As atualizações apresentadas nesta edição envolvem apenas
pequenas correções no preparo e concentração dos reagentes e em 
- Proveta de borossilicato ou polietileno 2 L 
alguns procedimentos e a incorporação dos métodos F-014/1 e F 
Reagente 
015/1 como procedimentos para obtenção do resíduo insolúvel em Acido sulfúrico (H;SO,) concentrado P.A. detergente ácido a ser utilizado nos métodos da hidrólise ácida e 
OXidação em permanganato de potássio. 
206 207 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de limentos -2" Edição 
Solução Recomenda-se o resfriamento da proveta com a água em geladeira 
Acido sulfúrico (12 M ou 720 g/kg ou 72% p/p)" ou freezer antes dos demais passos.
Características da solução - Acondicione a proveta em um recipiente contendo água e gelo. Isso 
Gravidade específica = 1,634 minimiza o impacto do aquecimento. 
- Massa final em 2 L = 3268 g (2x 1634)
- Adicione lentamente o ácido sulfúrico em porções de 50 a 100 mLe 
Preparo e aferição de 2 L de solução agite levemente com um bastão de vidro. N�ão deve haver fervura. A 
fervura é evitada não se adicionando grandes quantidades de ácido
1. Acido sulfúrico necessário 
de uma única vez. Após 4 ou 5 adições de pequenas quantidades de 
- 2353 g de ácido sulfúrico P.A. anidro 
ácido a reação se torna menos violenta e maiores quantidades podem 
2. Água destilada necessária ser adicionadas. Continue a adição do ácido até o volume
aproximado de 1900 mL. 
2353 
A=3268-
Cubra a proveta e deixe resfriar em água corrente (cerca de 30 
T00 
minutos). 
em que: A = quantidade de água destilada para o preparo de 2 L de 
- Com cuidado, retire a proveta da águae seque seu exterior com papel 
solução (g ou mL); P = pureza do ácido sulfúrico concentrado (%). toalha.
3. Preparo do ácido Acondicione a proveta sobre a balança semi-analítica e adicione 
lentamente ácido sulfúrico até o peso total da solução atingir 3268 g 
- Adicione a água destilada na quantidade estimada em uma proveta (não se esqueça de contabilizar a tara).
de 2 L. O peso da proveta deve ser previamente conhecido. 
Retire a proveta da balança e homogeneíze a solução com um bast�ão
de vidro.
0 Essas especificações dizem respeito à solução sob temperatura de 20°C. 
208 209 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
- Meça a temperatura. A temperatura final de atferição dever ser de 
Procedimentos 20+0.5°C. Caso a temperatura esteja acima deste patamar, mantenha
1. Use balança analítica aferida pelo INMETRO, com precisão de 
a solução em geladeira e monitore constantemente a temperatura. 
0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente
Antes de cada mensuração de temperatura é necessário
climatizado (20-25°C ou de acordo com as especificações do 
homogeneizar a solução com bastão de vidro. 
fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua Assim que a temperatura atingir o patamar adequado, proceda àà estabilização. 
aferição e, caso necessário, corrija a solução. 
2. Extraia as amostras em detergente ácido seguindo o método F-014/1 
ou F-015/1. A análise de lignina pelo método da hidrólise se inicia
4. Aferição da solução 
Confira o volume final da solução a 20+0,5°C. O volume final a partir da obtenção do resíduo insolúvel em detergente ácido em 
cadinho filtrante. aceitável deve estar entre 1995 e 2005 mL. 
3. Acondicione o cadinho filtrante contendo o resíduo insolúvel em Para o caso de volumes inferiores a 1995 mL, a solução ficou 
detergente ádcido em coletor universal e adicione pequena porção da demasiadamente concentrada. Assim, para cada 3 mL abaixo de 
solução de ácido sulfúrico de forma a apenas umedecer o resíduo. 2000 mL, retire 5 mL da solução e adicione 8 mL de água. 
Homogeneíze o conteúdo com auxílio de bastão de vidro com o 
Para o caso de volumes superiores a 2005 mL, a solução ficou
objetivo de quebrar todos os grumos e permitir que o ácido entre 
demasiadanmente diluída. Assim, para cada 1 mL acima de 2000 mL 
em contato com todas as partículas da amostra até que esta adquira
retire 9 mL da solução e adicione 8 mL de ácido sulfúrico consistência pastosa. Mantenha o bastão de vidro dentro do cadinho
concentrado. (deve ser usado um bastão para cada alíquota). 
4. Adicione solução de ácido sulfúrico até atingir-se metade da altura
interna do cadinho. Proceda à homogeneizaç�o do material após 30 
minutos. Caso necessário, adicione mais ácido para assegurar o 
211 210 
INCT Ciência Animal
Métodos para Análise de Alimentos- 2" Edição 
nível equivalente à metade da altura interna do cadinho. Mantenha
T0.Pese os cadinhose registreo peso. Esse resíduo obtido é composto nessas condições por mais 2,5 horas. 
por lignina e contaminantes minerais (i.e., sílica)" 
5. Com cuidado, retireo cadinho do coletor universal e o acople no 
11.Acondicione os cadinhos filtrantes contendo os resíduos no interiorsuporte de filtração. Acione o vácuo e drene todo o ácido sulfúrico. 
da mufla. 
6. Inicie o processo de lavagem com água destilada quente 
12.Ligue a mufla e, aguarde que a mesma alcance a temperatura de 
(temperatura 2 90°C). Inicie pelo bastão de vidro, tomando o 
550°C. E desejável uma rampa de aquecimento de I hora para que cuidado para que todos os resíduos aderidos ao bastão sejam retidos 
a temperatura de ignição seja alcançada. 
no interior do cadinho. Em seguida, lave o exterior do cadinho de 
forma a remover todo o ácido aderido na vidraria. 13.Proceda à queima por 3 horas a 550°C. Após este tempo, desligue a 
mufla e deixe que a mesma resfrie fechada. A temperatura de retirada 
7. Proceda à lavagem interna do cadinho. Com o vácuo desligado, deve estar entre 150e 200°C.
lave as paredes internas e o resíduo com água destilada quente 
14.Coloque os cadinhos filtrantes com os resíduos minerais em (temperatura > 90°C). Cuide para que não transborde. Acione o 
dessecador (máximo de 20 unidades por procedimento), deixevácuo e drene. Repita essa operação até que todo o ácido seja 
estabilizar com a temperatura ambiente. Pese e registre os pesos.removido. 
15.A massa de lignina é calculada pela perda de peso do resíduo após 8. Leve os cadinhos como resíduo à estufa não ventilada a 105°C por 
a incineração. 
16 horas. 
9. Retire os cadinhos, acondicione em dessecador (máximo de 20 
unidades por procedimento) e aguarde o equilíbrio com a 
temperatura ambiente. 
0Esse resíduo é também composto por cutina. A descrição do método
pressupõe que a contribuição da cutina seja desprezível. Veja mais detalhes 
nas definições básicas no início do Capítulo. 
212 213 
INCT Ciência Animal Métodos paru Análise de Alimentos -2" Edição
Para obtenção adequada dos resultados, realize o Exemplo de cálculo 
procedimento de forma que a temperatura do ácido esteja 
Considerando a alíquota I da tabela a seguir, têm-se os próxima a 20°C. 
cálculos da concentração de lignina: 
Cálculo da concentração de lignina (método da hidrólise ácida) 
LIG=(CAD+RES)-(CAD+RM)=40,4313-40.4074=0.0239 g 
Para o cálculo da concentração de lignina, utilize as equações: 
LIG 0,0239
x100:6LIGASA ASA x100=2,99% = LIG=(CAD+RES)-(CAD+RM) 0,8006
LIG 
6LIGASA 
4,99 o/LIGASAx100 a586 SA X100 o LIaMs= .A SE X100 ocx100=3,11% 
96LIGASAx100 %LIGMS9%ASE AlíquotaItem 
ASA (g) 0.8006 0,8255 
em que: LIG= massa de lignina (g); CAD = peso do cadinho filtrante 
CAD+RES () 40.4313 35,5684 
(g; RES massa do resíduo composto obtido após extração com 
CAD+RM (g) 40.4074 35,5433 
ácido sulfúrico (g); RM = massa do resíduo mineral obtido após a 
LIG (g) 0,0239 0,0251 
incineração (g); %LIGASA = percentual de lignina com base na amostra
oLIGASA 2.99 3,04 
seca ao ar; ASA = massa de amostra seca ao ar (g)s, LIGMs = 
%ASE 95,86 
percentual de lignina com base na matéria seca; %ASE = percentual 
%LIGMs 3,11 3,17 
de "amostra seca em estufa". 
%LIGMs (média) 3,14 
10 Esse valor é mensurado previamente à extração com detergente ácido.
214 215 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos -2" Ediçio
Método da oxidação em permanganato 
(Método F-006/2) Acctato de potássio (C>HKO:) P.A. 
- Alcool butílico terciário (CaH,OH) P.A. 
Aparatos Acido oxálico diidratado (C>H201.2H:0) P.A. 
- Álcool etílico (C2HOH) anidro P.A. (etanol absoluto) Balança analítica com precisão de 0,0001 g 
- Acido clorídrico (HCI) concentrado P.A. 
- Dessecador 
Acetona (C.H.0) P.A. 
Estufa sem circulação forçada de ar 
-Cadinhos filtrantes em borossilicato com porosidade grossa (40-60 Soluções
um) e 50 mL de capacidade 
Bandejas de polietileno Solução de permanganato de potássio 
- Bastões de vidro - Em balão volumérico de 1 L contendo cerca de 400 mL de água 
- Bomba de vácuo acoplada, em linha, a um kitassato e a um suporte destilada, dissolva 50 g de permanganato de potássio. Complete o 
para cadinhos filtrantes volume com água destilada. Transfira e armazene em frasco âmbar.
Balões volumétricos 1L 
Solução tampão 
- Pissetas de polietileno 500 mL 
- Em balão volumétrico de 1 L contendo 100 mL de água destilada, 
- Fraco âmbar para armazenamento de soluções 
dissolva 6,0 g de nitrato férrico hidratado e 0,.15 g de nitrato de prata.
- Proveta de 1000 ou 2000 mL 
Adicione 500 mL de ácido acético glacial e 5,0 g de acetato de 
potássio P.A. Agite até a solubilização. Complete o volume com 
Reagentes 
álcool butílico terciário. Tampe o balão e homogeneíze a solução.
- Permanganato de potássio (KMnO.) P.A. 
Solução de etanol 95% 
Nitrato de prata (AgNO;) P.A. 
- Em balão volumétrico de 1 L. adicione 50 mlL de etanol absoluto. 
Nitrato férrico hidratado [Fe(NO:)».9H:0] P.A. 
Complete o volume com água destilada e homogeneíze. 
- Ácido acético (C;H,Oz) glacial P.A. 
217 216 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
Solução de etanol 80% vh Procedimentos 
- Em balão volumétrico de 1 L. misture 155 mL de água destilada e 
1. Use balança analítica aferida pelo INMETRO, com precisão de 845 mL de solução de etanol 95% ou 200 mL de água destilada e 
0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente 800 mL de etanol absoluto. Homogeneíze. 
climatizado (20-25°C ou de acordo com as especificações do 
fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua Solução de desmineralização 
estabilização. Em balão volumétrico de1 L, adicione 700 mL de solução de etanol 
95% e dilua 50 g de ácido oxálico diidratado. Em capela, adicione 2. Extraia as amostras em detergente ácido seguindo o método F-014/1 
lentamente 50 mL de ácido clorídrico concentrado. Complete o 
ou F-015/1. A análise de lignina pelo método da oxidação se inicia
volume com água destilada e homogeneíze. a partir da obtenção do resíduo insolúvel em detergente ácido em 
cadinho filtrante. 
Solução combinada de permanganato e tampão (2:1)
Em uma proveta, misture a solução de permanganato e a solução 3. Acondicione os cadinhos filtrantes contendo os resíduos insolúveis 
tampão na razão de 2:1 v/v. Esta mistura deve ser realizada em detergente ácido em bandeja de polietileno com uma lâmina de 
imediatamente antes de seu uso e na quantidade necessária para a água destilada de 2 a 3 cm. 
análise. A sobra de solução deve ser descartada. A solução deve 
4. Adicione aproximadamente 30 mL de solução combinada de apresentar coloração de vermelha a purpúra e não deve conter 
permanganato e tampão (2:1), nmantendo o nível da solução nos precipitado, pois este dificulta a filtração. 
cadinhos filtrantes em cerca de 50o da altura interma, cobrindo toda 
a amostra. 
5. Homogeneíze com bastões de vidro de 30 em 30 minutos. 
6. Após 2 horas, acople o cadinho no suporte de filtração. Acione o 
vácuo e drene toda a solução de permanganato. 
218 
219 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
7. Transfira os cadinhos filtrantes com os resíduos para uma bandecja
13. Pesc os cadinhos e registre o peso. A massa de lignina é dada pela limpa. com lâmina de água similar à descrita anteriormente. 
diferença entre a massa de resíduo insolúvel em detergente ácido e Adicione 30 mL da solução de desmineralização. 
a massa do resíduo após o tratamento acima descrito. 
8. Após 30 minutos, acople o cadinho no suporte de filtração. Acione 
Cálculo da concentração de lignina (método da oxidação) 
o vácuo e drene toda a solução de desmineralização. O resíduo deve 
apresentar coloração clara (i.e., amarelo claro ou branco). Caso isso 
Para o cálculo da concentração de lignina, utilize as equaçõesnão seja observado, repita o procedimento 7 e filtre novamente apósLIG=(CAD+FDA)-(CAD+RES) 15 minutos.
%LIGASA ASA x100 
LIG 9. Com o vácuo desligado, direcione um jato de solução de etanol 80% 
usando uma pisseta sobre o resíduo de forma a revolvê-lo. Acione 
LIGASAx100 %LIGMs 9%ASE 
o vácuo e drene. Repita esse procedimento três vezes. 
10. Com o vácuo desligado, direcione um jato de acetona usando uma 
em que: LIG = massa de lignina (g); CAD = peso do cadinho filtrante (g): 
pisseta sobre o resíduo de forma a revolvê-lo. Acione o vácuo e 
FDA = massa do resíduo de fibra em detergente ácido (g); RES =massa do 
drene. Repita esse procedimento três vezes. 
resíduo composto obtido após extração com permanganato de potássio (g): 11. Leve os cadinhos com o resíduo a estufa não ventilada a 105°C por TOLIGASA = percentual de lignina com base na amostra seca ao ar, ASA = 16 horas. 
massa de amostra seca ao ar (g): LIGns = percentual de lignina com base 
na matéria seca; %ASE = percentmal de "amostra seca em estufa". 12. Retire os cadinhos, acondicione em dessecador (máximo de 20 
unidades por procedimento) e aguarde o equilíbrio com a 
Exemplo de cálculo
temperatura ambiente. 
Considerando a alíquota 1 da tabela a seguir, têm-se os 
cálculos da concentração de lignina: 
221 220 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos 2" Edição 
LIG=(CAD+FDA)-(CAD+RES)=38.1752-38, 1460=0,0292 g Balança semi-analítica com precisão de 0,1 a 0,01 g 
- Dessecador 
LIG 0,0292
%LIGASA=ASA X100 Estufa sem circulação forçada de ar 0,814500=3,59% 
Cadinhos filtrantes em borossilicato com porosidade grossa (40-60 
um) e 50 mL de capacidade 
%LIGMs %ASE 
3,59 
x100aox100=3,75% - Coletores universais autoclaváveis (100-120 mL) 
- Bastões de vidro 
Alíquota - Forno mufla 
1 2 Bomba de vácuo acoplada, em linha, a um kitassato e a um suporteItem 
ASA (g) 0,8145 0,8807 para cadinhos filtrantes 
CAD+FDA () 38,1752 39,0521
- Geladeira 
- Termômetro 
CAD+RES (g) 38,1460 39,0200
LIG (g) 0,0292 0,0321 
- Proveta de borossilicato ou polietileno 2 L 
- Banho-maria 
oLIGASA 3,59 3,64 
- Autoclave 
oASE 95,86 
%LIGMs 3,75 3,80 
Reagente 
oLIGMs (média) 3,78 
- Acido sulfúrico (H2SOA) concentrado P.A. 
Solução 
Lignina Klason 
(Método F-007/2)
Acido sulfirico (12 M ou 720 g/kg ou 72% p/p) 
Aparatos Prepare
a solução como descrito no método F-005/2. 
Balança analítica com precisão de 0,0001 g 
223 
222 
INCT Ciência Animal
Mélodos para Análise de limentos - 2" Edição 
Procedimentos 
procedimento até a transferência quantitativa do resíduo do coletor 
1. Adicione 250 a 350 mg de amostra em coletor universal para o cadinho. A transferência deve ser realizada com o 
autoclavável com capacidade de 100 a 120 mL. As amostras material ainda morno após a autoclavagem. 
devem ser processadas enm moinho com peneira com 
7. Com o vácuo desligado, lave o resíduo com água destilada quente porosidade de 1 mm. 
(temperatura2 90°C). Acione o vácuo e drene. Repita esse 
2. Adicione 3 mL da solução de ácido sulfúrico sobre a amostra e procedimento por trê vezes. 
homogeneíze com auxílio de bastão de vidro. 
8. Leve os cadinhos com o resíduo a estufa não ventilada a 105°C por 
16 horas. 3. Transfira os potes para banho-maria previamente aquecido a 30°C, 
onde permanecerão por 1 hora. Homogeneíze o material após 30 
9. Retire os cadinhos, acondicione em dessecador (máximo de 20 
minutos com bastão de vidro. unidades por procedimento) e aguarde o equilibrio com a 
temperatura ambiente. 
4. Retire os coletores do banho-maria e adicione 80 mL de água 
destilada. 10. Pese os cadinhos e registre o peso. 
5. Vede os coletores e autoclave os mesmos por 1 hora a 125°C. 11. Acondicione os cadinhos filtrantes contendo o resíduo
no interior
da mufla. 
6. Acople o cadinho filtrante com peso previamente conhecido no 
12. Ligue a mufla e, aguarde que a mesma alcance a temperatura 
de 
suporte de filtração. Com o auxílio de água destilada quente 
550°C. E desejável uma rampa de aquecimento de 1 hora para que 
(temperatura 90°C), transfira gradativamente o conteúdo do 
a temperatura de ignição seja alcançada. 
coletor universal para o cadinho. Durante a transferência, o 
vácuo 
deve estar desligado. Caso o volume do cadinho seja atingido, pare 
a transferência e acione o vácuo para drenagem da solução. Após a 
drenagem, desligue o vácuo e continue a transferência. Repita esse 225 
224 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição13. Proceda à queima por 3 horas a 55O°C. Após este tempo, desligue a 
Cálculo da concentração de lignina Klason 
mufla e deixe que a mesma resfrie fechada. A temperatura de retirada 
Para o cálculo da concentração de lignina. utilize as equações: 
deve estar entre 150 e 200°C. 
(CAD+RES)-CAD 
14. Coloque os cadinhos filtrantes com o resíduo mineral em dessecador 
%RESASA= x100 ASA deixe estabilizar com a tenmperatura ambiente. Pese e registre os 
9/6RESASAx100 
pesos.
6RESMs /%ASE A lignina Klason apresenta valores mais elevados de 
(CAD+RM)-CAD 
x100 
contaminação proteica em comparação as demais métodos aqui 
%RMASA ASA descritos, uma vez que o material não passa por tratamento com 
6RM ASAx100
detergente catiónico, responsável por retirar grande parte da 
%RMMs %ASE 
contaminação proteica. Caso haja interesse ou necessidade de 
correção para contaminação proteica, aumente o número de alíquotas 
%LKMSNC=%RESMs-%RMMs 
analisadas. Ao final do passo 10, retire algumas alíquotas que serão 
%RESMS %PCLIG=%PLRES /%LKMSNC 
destinadas à avaliação da proteína associada ao resíduo seguindo-se os 
procedimentos descritos para o método N-004/2.
(100-%PCLuG %LKMsc=%LKusNCX- 100 
em que: CAD = peso do cadinho tiltrante (g): RES = massa do resíduo 
após a extração ácida: %RESasA = percentual de resíduo obtido após 
o tratamento com ácido sultúrico com base na amostra seca ao ar; ASA 
massa de amostra seca ao ar (g): %RESns = percentual de resídu0
227 226 
INCT Ciencia Animal
Métodos para Análise de Alimnentos - 2" Edição
obtido após o tratamento com ácido sulfúrico com base na matéria (CAD+RM)-CAD RM ASA 38,1759-38,1546 
seca: %ASE = percentual de "amostra seca em estufa"; RM 
= massa 
ASA 
x100= -x100=8,38% 0,2541 
do resíduo mineral (g): GRMASA = percentual de resíduo mineral 
%RM ASA100 gs,86%RMMs 9/%ASE 8,38 x100=8,74% 
obtido após incineração em mufla com base na amostra seca ao ar; 
%RMMs percentual de resíduo mineral obtido após incineração em 
mufla com base na matéria seca; %LKmsNc = percentual de lignina
%LKMSNC=%RESMs-% RMus = 22,25 8,74 13,51% 
Klason não corrigida para proteína com base na matéria seca, %PCus
= percentual de proteína bruta contaminante presente na lignina; 
Alíquota
6PCRES = percentual de proteína bruta contaminante presente no Item
resíduo obtido após o tratamento com ácido sulfúrico; %LKMsc = ASA () 0.2541 0.2369 
percentual de lignina Klason corrigida para proteína com base na CAD (g) 38.1546 42.5231 
matéria seca. CAD+RES(g) 38.2088 42.5717
CAD+RM (g) 38.1759 42.5430
Exemplo de cálculo RES (g) 0.0542 0,0486 
RM (g) 0.0213 0,0199 Considerando a alíquota 1 da tabela a seguir, têm-se os 
%RESASA 21.33 20.51 cáleulos da concentração de lignina:
%RMASA 8,38 8.40 
(CAD+RES)-CADan38,2088-38,15*0x 100 = 21,33% %ASE 95,36 %RESASA= -x100=ASA 0,2541 oRESMS 22,25 21.40 
6RMMs 8.74 8,76 
o6RESASAx100 q5,86 21,33 x100=22,25% %RESMs=F oLKMsNC 13.51 12.64 %ASE 
%LKMSNc (média) 13,08
04 Valor obtido pela avaliação do resíduo conforme o método N-004/2. 229 
228 
INCT Ciência Animal
Métodos para Análise de Alimentos 2" Fdicão 
Literatura Citada 
Capítulo 11 
DEHORITY. B.A. Microbial ecology of cell wall fermentation. In: JUNG 
H.G.: BUXTON. D.R.: HATIFIELD. R.D.: RALPH. J. (Eds.) Forage cell 
wall structure and digestibility. Madison: Ameriea Socicty of 
Agronomy. 1993. P.425-453. 
Fibra indigestível 
DEHORITY. B.A.: JOHNSON. R.R. Effect of particle size upon the in vitro
cellulose digestibility of forages by rumen bacteria. Journal of Dairy 
Science. v.44. p.2242-2249. 1961. 
Definiçõesbásicas 
A estimação da digestibilidade dietética tem como ponto GOMES 
FUKUSHIMA. R.S.: SOUZA. M.A.: VALENTE, T.N.P.; PAULINO 
M.F.: QUEIROZ. A.C. Evaluation of lignin contents in tropical forages
using different analytical methods and their correlations with degradation 
of insoluble fiber. Animal Feed Science and Technology, v.168, p.206- 
D.I.: DETMANN. E. VALADARES FILHO, S.C.: 
inicial a obtenção de seu complemento, a indigestibilidade aparente. 
Neste contexto, a excreção fecal constitui a característica básica de 
indigestibilidade de um alimento ou dieta, uma vez que representa, ao 
222. 2011. 
menos aparentemente. a porção ingerida não aproveitada durante a 
HATIFIELD. R.D.: JUNG. H.G.: RALPH, J.; BUXTON, D.R.; WEIMER, 
P.J. Comparison of the insoluble residues produced by the Klason lignin 
and acid detergent lignin procedures. Journal of Agriculture and Food 
Chemistry, v.65. p.51-58. 1994. 
passagem pelo trato gastrintestinal (Detmann et al., 200-4). Contudo. 
devido à dificuldade de realização de coleta total de fezes em animais
de grande porte. como bovinos, téenicas indiretas com o uso de JUNG. H.G.: ALLEN, M.S. Characteristics of plant cell walls affecting 
intake and digestibility forages by ruminants. Journal of Animal 
Science, v.73, p.2774-2790, 1995.
indicadores são recomendadas. 
Os indicadores internos comumente utilizados em ensaio com 
LOWRY, J.B.; CONLAN, A.C.; SHLINK, A.C.; McsWEENEY, C.S. Acid 
detergent dispersible lignin in tropical grasses. Journal of Science and 
Food Agriculture, v.65, p.41-49, 1994.
ruminantes compreendem os residuos indigestiveis dos alimentos, 
sendo comumente representados pelas frações quimicas tibra em 
NATIONAL RESEARCH COUNCIL - NRC. Nutrient requirements of 
dairy cattie. 7 ed. Washington, D.C.: Academic Press, 200 1. 381p.
Van SOEST, P.J. Nutritional ecology of the ruminant. 2 ed. Ithaca: Cornell 
detergente neutro indigestível (FDNi) e tibra em detergente ácido
indigestível (FDAi) (Detmann et al., 2004: Valente et al.. 2011a). 
University Press, 1994. 476p. As estimativas de produção fecal são obtidas por intermédio 
Van SOEST, P.J.; ROBERTSON, J.B. Analysis of forages and fibrous 
foods. Ithaca: Cornell University, 1985. 202p. 
de relaçao de causa e eteito entre alinmento/dieta e os eventos
ligestivos do trato gastrintestinal (Detmanu et al., 2007). A base para 
utilização destes reside sobre o fato de que, à medida que o alinento 
231 
230 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Andlise de Alimentos-2 Ediçdo
transita pelo trato gastrintestinal, a concentração do indicador aumenta
Algumas modificações foram também realizadas com relação progressivamente pela remoção de outros componentes por digestão e 
à adaptação e manejo dos animais doadores e manejo dos filter bags absorção. 
pós-incubação. Essas adaptações constituem proposta de 
padronização de métodos de análise de alimentos utilizando animais
A verificação das características ideais de indicadores deve 
centrar-se sobre questöes relacionadas à recuperação desses após 
(direta ou indiretamente) por parte do comitê organizador. Maioressubmissão aos eventos do trato gastrintestinal, a qual, em termos 
detalhes podem ser obtidos nos Capítulos 17 e 18 deste Manual. teóricos, constitui caracteristica inerente ao indicador (Detmann et al., 
Adicionalmente, algumas dúvidas recorrentes são 2007). Contudo, influências indiretas dos métodos utilizados para 
apresentadas ao comitê organizador, as quais serão brevemente 
estimação de sua concentração podem causar desvios aparentes de discutidas neste tópico. A primeira reside sobre o tipo de filter bag a recuperação (Valente et al., 2011a). 
ser utilizado. Os resultados obtidos no Brasil sob as mesmas condições 
Adicionalmente, a importância de se obter estimativas de 
de incubação indicam que tanto filter bags F57 (Ankom®) como 
coeficientes de digestibilidade de forma eficiente reside no fato de que 
aqueles confeccionados com tecido não-tecido (TNT, 100 g/m) 
estas estimativas constituem aspecto básico para se quantificar o valor propiciam resultados similares de FDNi e FDAi (Valente et al., 201la: 
energético dos alimentos ou dietas, permitindo o balanceamento 2011b). Há duas diferenças básicas entre ambos para procedimentos 
adequado de dietas que propiciem o atendimento das demandas de de incubação in situ de tempo único, como os aqui recomendados. 
mantença e produção dos animais (Detmann et al., 2016). Primeiro, os filter bags confeccionados com TNT possuem menor 
resistência a danos fisicos (Valente et al., 201la), o que determina que 
Atualizações não haja reutilização dos mesmos. Em segundo lugar, os filter bags 
F57 possuem menor taxa de troca de material entre seu ambiente
O principal grupo de atualizações deri va-se das modificações 
interior e o exterior do ambiente de incubação. Isso acarreta taxa de 
realizadas sobre os métodos F-001/2, F-002/2, F-003/2 e F-004/2, os 
degradação do substrato mais lenta e, consequentemente, demanda 
quais servem de base para os processos de extração química aqui 
maiores tempos de incubação para estimação da fração indigestível 
utilizados. 
(Valente et al., 2011b). Contudo, o tempo de incubação aqui adotado 
233 232 
Métodos para Análise de Almmentos2 Edici INCT Cincia Animal 
dos resultados (Silva et al. 2018). possível reflexo acúmulo de 
já contempla tal diferença. sendo o protocolo 
cstabelecido para as 
maiores demandas de tempo. garantindo robustez parao 
uso de ambos bolhas no interior dos filter hags (CGomes et al. 201), o que 
os tipos de filter bags. compromete a homogeneidade de contato entre o extratoreomaterial 
Apesar de as análises de FDN demandarem partículas 
moídas 1 ser extraído. A pressurização amplia a temperatura de ebulição do 
em peneira de porosidade mm. as avaliações de FDNi e FDAi são Cxtrator e, consequentemente, evita a formação de bolhas no interior 
realizadas com partículas processadas em peneiras de porosidade 2 dos filter hags. A maioria dos equipamentos nacionais para extraçöes 
mm. Este é o padrão para avaliações in situ (favor consultar o Capítulo com filler bags opera sob condições não pressurizadas, não sendo
18). Contudo, nas avaliações de FDNi e FDAi, o uso de partículas com recomendada a sua utilização 
Questionamentos são também direcionados ao fato de haver menor superficie específica não compromete a extração pelas soluções 
de detergente. Embora possuam base analítica comum, a extração ou não diferenças entre animais quanto ao valor de FDNi ou FDAi 
possui objetivos distintos. A extração de FDN, por exemplo, é obtido. Nutricionalmente. animais são incapazes de causar tal 
complexa sob a ótica química, pois há muitas interferências oriundas diferença, uma vez que a dimensio da fração indigestívelé 
de outros compostos do alimento. A avaliação no material incubado característica inerente ao alimento utilizado. 0 que ocore são 
por 288 horas no nímen consiste basicamente de um processo de 
diferenças entre animais quanto à taxa de degradação do material, o 
limpeza para remoção de debris microbianos, sendo, portanto, muito 
que afeta o tempo critico necessário de incubação para se estimar a 
mais simples quimicamente. Esta é razão pelo qual não há necessidade fração indigestível (Sampaio et al. 2014). Essas variações advem de 
de a-amilase para análise de FDNi ou de extração sequencial para características inerentes aos animais em si, como, por exemplo,
análise de FDAi, pois, por exemplo, amido e pectina já foram peculiaridades no seu microbioma ruminal. Os efeitos destas variaçõöes 
degradados durante a permanência da amostra no rúmen. na estimação da tração indigestivel são conrolados pelo fornecimento 
de dieta adequada e pela adoção de tempo adequado de incubação. No entanto, similarmente ao recomendado para o uso de filier
A utilizaço de ovinos como animais doadores mostra-se uma bags nas análises de FDN e FDA, aqui também há necessidade dese 
conduzir a extração utilizando-sesistemas pressurizados. O uso de dúvicla recormente sobre os protocolos de avaliação de trações 
indigestíveis. Ovinos não devem ser utilizados para tais equipamentos não pressurizados compromete a qualidade e a precis�o 
235 
234 
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Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição 
procedimentos por duas razões básicas. Primeiro, devido ao pequeno 
Aparelho analisador de fibras Ankom20 ou Ankom20 ou 
volume do rúmen, há drástica redução no número de sacos incubados 
AnkomELIA ou autoclave 
por animal, comprometendo a capacidade operacional do método. Em 
- Erlenmeyers (4 e 10L) segundo lugar, ovinos apresentam taxa de degradação mais lenta em 
- Coletores universais autoclaváveis comparação a bovinos, exigindo tempos de incubação extremamente 
- Panela de alumíniolongos para estimação da fração indigestível (Reis et al., 2017). Logo, 
- Bandejas de alumínioconsiderando que a fração indigestível é uma característica do 
Fogão ou fogareiro alimento, sua avaliação é mais vantajosa utilizando-se bovinos como 
Sacos de filó 
animais doadores. 
- Corrente com peso na ponta
Bovino fistulado no rúmen FDNi utilizando analisador de fibras - F-008/2
Lavadora tipo "tanquinho" FDNi utilizando autoclave - F-009/2
FDAi utilizando analisador de fibras - F-010/2
Reagentes 
FDAi utilizando autoclave - F-011/2 
- Sulfato láurico de sódio (NaC12H2sS04) P.A. 
Aparatos - Etilenodiamino 
tetra-acético (EDTA) dissódico sal 
CioH14N2Os.2Na.2H;O) diidratado P.A. ou EDTA ácidoBalança analítica com precisão de 0,0001 g 
CioHisN 0s) P.A. e hidróxido de sódio (NaOH) P.A. - Dessecador 
Tetraborato de sódio (NazB,O7.10H0) decahidratado P.A. Estufa com circulação forçada de ar 
- Fosfato de sódio dibásico anidro (Na,HPO) ou heptahidratado Estufa sem circulação forçada de ar 
(Na-HPO4.7H,0) P.A. Sacos F57 (Ankom®) ou de tecido não tecido (TNT, 100 g/m) 
Trietilenoglicol (CsH1404) P.A. Seladora
- Acido sulfúrico (H2SO.) concentrado P.A. 
Brometo de cetil trimetilamônio (C9HBrN) P.A. (cetremide ou CTAB)
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INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
- Acetona (C:H.O) P.A. Sob temperaturas ambientes baixas pode haver precipitaç�o 
- Detergente neutro comercial parcial na solução armazenada. Nesses casos, aqueça levemente 
a solução e agite para a ressobulização antes do uso. 
Soluções 
Solução de detergente ácido
Solução de detergente neutro comercial Em Erlenmeyer de 10 Ladicione 4 L de água destilada previamente 
- Em Erlenmeyer de 4 L. adicione 1 L de água destilada e 80 mL de 
aquecida. Adicione 200 g de CTAB P.A. e agite levemente. Adicione 
detergente neutro comercial. Agite até a completa homogeneização lentamente 277 mL de ácido sulfúrico concentrado P.A. Agite até a 
e complete o volume com água destilada. solubilização e complete o volume com água destilada. 
Solução de detergente neutro Procedimentos 
- Em Erlenmeyer de 10 L adicione 4 L de água destilada previamente 
Use balança analítica aferida pelo INMETRO, cOm precisão de 
aquecida. Adicione 300 g de sulfato láurico de sódio P.A., 186,1 g 
0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente climatizado de EDTA sal dissódico P.A. (ou 146,1 g de EDTA ácido P.A. e 40 g 
(20-25°C ou de acordo com as especificações do fabricante). Ligue a 
de hidróxido de sódio P.A.), 68,1 g de tetraborato de sódio 
balança e aguarde 30 minutos para sua estabilização. 
decahidratado P.A., 45,6 g de fosfato de sódio dibásico anidro 
P.A. 
(ou 81,54 g de fosfato de sódio dibásico heptahidratado P.A.)
e 100 
Preparação dos filter bags 
mL de trietilenoglicol P.A. Agite até a completa solubilização. 
1. Identifique os filter bags com marcador pemanente. 
Completeo volume com água destilada. O pH final da solução
deve 
estar entre 6,95 e 7,05. Caso o pH final esteja abaixo de 6,50 
ou 
2. Acondicione os filter bags em panela de aumínio e adicione a solução 
acima de 7,50, descarte a soluç�o. Para pH final
de 
de detergente neutro comercial em volume suficiente para 
cobrir todo o 
6,50spHc6,95, ajuste para a faixa ideal com adição de pequenas material. 
porçoes de hidróxido de sódio. Para pH final de 7,05<pHs7,50 
ajuste para a faixa ideal gotejando ácido clorídrico 
concentrado. 
239 
238 
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Métodos para Análise de Alimentos 2" Edição 
3. Leve o recipiente ao fogão ou fogareiroe aqueça. A solução deve 
Adaptaçãoe dieta do animal(is) doador(es) 
ser mantida em ebulição por 15 minutos. 
O(s) animal(is) doador(es) deve(m) ser adaptados à dieta basal
4. Lave os filter bags com água corente até a total retirada do 
por, no mínimo, 14 dias antes da incubação e nesta ser mantido até a 
detergente. 
retirada do material do rúmen.
5. Seque os filter bags em bandejas (camada delgada sem A dieta basal deve ser formada por volumoso e concentrado 
sobreposição) sequencialmente em estufa com circulação forçada na proporção de 80:20, com base da matéria seca, e conter 12% de 
de ar a 55°C por 24 horas e em estufa não ventilada a 105°C por 2 proteína bruta, também com base na matéria seca. A suplementação 
horas. mineral deve ser realizada ad libitum, mantendo-se também água 
disponível em abundância. 
6. Acondicione os filter bags em dessecador (máximo de 20 unidades
por procedimento) e aguarde o equil+brio com a temperatura Incubação 
ambiente. 
1. Acondicione os filter bags em sacos de filó, os quais devem ser 
7. Pese os filter bags e registre o peso. Esse será o peso da tara. fechados. Fixe os sacos de filó a uma corrente com um peso na 
ponta. Introduza o saco de filó com o peso no rúmen do animal 
8. Acondicione as amostras nos filter bags seguindo-se a relação de 20 
doador, onde deve permanecer por 288 horas.
mg de matéria seca por centímetro quadrado de superfície. Sacos F57 
possuem aproximadamente 36 cm2 de superfície. Assim, seriam 2. Retire os filter bags do rúmen e lave-os bem em água corrente até a 
necessários 720 mg de matéria seca ou, aproximadamente, 800 mg de retirada do excesso de material aderido à superfície externa. 
amostra seca ao ar. O mesmo raciocínio é seguido para os filter bags Sugere-se que, durante a lavagem, os filter bags sejam pressionados 
confeccionados com TNT, cujas dimensões sugeridas são de 4,0 x 4,5 levemente com as mãos para auxiliar a retirada de material solúvel.
cm. As amostras devem ser obrigatoriamente processadas em 3. Acondicione os filter bags em lavadora tipo "tanquinho". Encha-a
moinho de facas com peneira de porosidade de 2 mm. com água limpa e, usando regulagem para "lavagem delicada", 
240 241
INCT Cência Animal Métodos para Análise de Alimentos 2" Edição 
acione a lavadora por I minuto. Drene a água após 
a lavagem. Este manter por I hora. O tempo de extração é contabilizado após a 
procedimento deve ser realizado por, no 
mínimo, cinco vezes. temperatura ser atingida. 
4. Após os ciclos de lavagem. pressione gentilmente os filter bags para 3. Lave os filter bags com água destilada quente (temperatura> 90°C) 
retirada do excesso de água (que deve estar límpida). até a completa retirada da solução de detergente. 
5. Caso a extração com detergente não ocorra de imediato, seque os 4. Adicione os filter bags em um recipiente e cubra-os com acetona. 
filter bags em bandejas (camada delgada sem sobreposição) em Agite por 3 a 5 minutos. 
estufa com circulação forçada de ar a 55°C por 24 horas. 
5. Seque os filter bags em bandejas (camada delgada sem 
sobreposição) sequencialmente em estufa com circulação forçada 
Extração
de ar a 55°C por 24 horas e em estufa não ventilada a 105°C por 2 
la. Acondicione os filter bags em aparelho analisador de fibras horas. 
Ankom220 ou Ankom2000 ou AnkomDELTA e adicione solução de 
neutro à temperatura ambiente. relação 6. Acondicione os filter bags em dessecador (máximo de 20 unidades detergente A 
detergente:amostra deve ser de, aproximadamente, 100 mL/g de 
por procedimento) e aguarde o equilíbrio com a temperatura 
ambiente. 
amostra seca ao ar, ou 
lb. Acondicioneos filter bags individualmente em coletores 7. Pese os filter bags e registre o peso.
universais autoclaváveis e adicione solução de detergente neutro à A avaliação da FDAi pode ser realizada diretamente, sem 
temperatura ambiente. A relação detergente:amostra deve ser de, análise sequencial à FDNi (normalmente, somente um dos compostos 
aproximadamente, 100 mLg de amostra seca ao ar. utilizado no mesmo estudo), repetindo-se os procedimentos 1 a 7 
mas substituindo-se a solução de detergente neutro por soluçã de 
2. Aquecer a solução em aparelhos analisador de fibras Ankom2 ou 
Ankom20 ou AnkomDELTA Ou autoclave à temperatura de 105°C e detergente ácido. 
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Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
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Cálculo da concentração de FDNi e FDAi 
dclergente neutro indigestível com base na matéria seca:. FDAi = 
massa de fibra em detergente ácido indigestível (g): %FDAiasA = 
Para o cálculo da concentração de FDNi e FDAi, utilize as 
percentual de fibra em detergente ácido indigestível com base na 
amostra seca ao ar; %FDAims = percentual de fibra em detergente equações: 
ácido indigestível com base na matéria seca; e %ASE = percentual de 
FDNi=(FB+FDNi)-FB 
"amostra seca em estufa". 
Exemplo de cálculo 
FDNi 
%6FDNiASAASA x100 
Considerando alíquota 1 da tabela a seguir, têm-se os cálculos
%FDN ASAx100 %FDNiMs da concentração de FDNi:%ASE 
FDNi=(FB+FDNi)-FB=0,6161-0,5003=0,1158 g FDAi=(FB-+FDAi)-FB 
%FDN ASA100 0,1158 x100 %FDAiASA ASA 
FDAi 
6FDNiMs9/%ASE 0,8058x100=14,37% 
/6FDN ASAx100g.86 14,37 x100=14,99% %FDAIASAx100 %FDAiMs Y6FDNiMS/%ASE %ASE 
em que: FDNi = massa de fibra em detergente neutro indigestível (g); 
FB = peso do filter bag (g); ASA = massa de amostra seca ao ar (g) 
OFDNiASA = percentual de fibra em detergente neutro indigestível 
com base na amostra seca ao ar; %FDNiMs = percentual de fibra em 
245 244 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
Alíquota GOMES, D.I.; DETMANN, E.; VALENTE, T.N.P.; VALADARES FILHO, 
S.C.; QUEIROZ, A.C. Avaliação laboratorial de compostos fibrosos em 
alimentos e fezes bovinas sob diferentes ambientes físicos. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.63. p.522-525, 2011.
Item 1 
ASA (g) 0.8058 0.8038 0,8031 
FB (g) 0.5003 0.5651 0,4671 REIS, M.J., SANTOS, S.A., PRATES, L.L.; DETMANN, E.; CARVALHO. 
G.G.P.; SANTOS, A.C.S.; RUFINO, L.M.A.; MARIZ, L.D.; NERLA, F.; 
COSTA, 
intropical feeds using in situ ruminal incubation. Animal Feed Science 
and Technology, v.232, p. 139-147, 2017.
FB+FDNi(g) 0.6161 0,6763 0,5795 Comparingsheepandcattle toquantify internalmarkers 
FDNi (g) 0.1158 0,1112 0,1124
ToFDNiASA 143 13,83 14,00 SAMPAI0, C.B.; GOMES, D.I.; REGADAS FILHO, J.G.L.; DETMANN, 
E.; VALADARES FILHO, S.C. Variations among animals when 
estimating the undegradable fraction of fiber in forage samples. Semina. 
Ciencias Agrárias, v.35, p.2739-2748, 2014. 
%ASE 95,86
T%FDNiMs 14,99 14,43 14,60 
%FDNins (média) SILVA, R.S.T.; FERNANDES, A.M.; GOMES, R.S.; BENDIA, L.C.R.;
SILVA, LC.; VIEIRA, R.A.M. On the specificity of different methods
for neutral detergent fiber and related problems. Animal Feed Science 
and Technology,v.240, p.128-144, 2018. 
14,67
Literatura Citada 
DETMANN, E.; VALADARES FILHO, S.C.; PAULINO, M.F.; 
ZERVOUDAKIS, J.T.; CABRAL, LS. Avaliação da técnica dos 
indicadores na estimação do consumo por ruminantes em pastejo. 
Cadernos Técnicos de Veterinária e Zootecnia, v.46, p.40-57, 2004.
VALENTE, TN.P.; DETMANN, E.; VALADARES FILHO, S.C.; CUNHA, 
M.; QUEIROZ, A.C.; SAMPAIO, C.B. In situ estimation of indigestible 
compounds contents in cattle feed and feces using bags made from different 
textiles. Revista Brasileira de Zootecnia, v.40, p.666-675, 201la. 
VALENTE, TN.P.; DETMANN, E.: QUEIROZ, A.C.; VALADARES 
FILHO, S.C.; GOMES, DI; FIGUEIRAS, J.F. Evaluation of ruminal
degradation profiles of forages using bags made from different textiles. 
Revista Brasileira de Zootecnia, v.40, p.2565-2573, 2011b. 
DETMANN, E.; SOUZA, A.L.; GARCIA, R.; VALADARES FILHO, S.C.; 
CABRAL, L.S.; ZERVOUDAKIS, J.T. Avaliação do vício de tempo
longo de indicadores internos em ensaio de digestão com ruminantes. 
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.59, p.182- 
188, 2007. Literatura Adicional 
DETMANN, E.; SILVA, T.E. ; VALADARES FILHO, S.C.; SAMPAIO, 
C.B.; PALMA, M.N.N. Prediction of the energy value of cattle diets
based on the chemical composition of feeds. In: VALADARES FILHO; 
S.C.; COSTA E SILVA, L.F.; GIONBELLI, M.P.; ROTTA, P.P.; 
MARCONDES, M.I.; CHIZZOTTI, M.L.; PRADOS, L.F. (Org) Nutrient requirements of zebu and crossbred cattle BR-CORTE. 
3ed.Viçosa: DZO-UFV, 2016. p.85-118. 
CASALI, A.O.; DETMANN, E.; VALADARES FILHO, S.C.; PEREIRA, J.C. 
HENRIQUES, L.T; FREITAS, S.G.; PAULINO, M.F. Influência do tempo
de incubação e do tamanho de partículas sobre os teores de compostos 
indigestíveis am alimentos e fezes bovinas obtidos por procedimentos in situ.
Revista Brasileira de Zootecnia, v.37, p.335-342, 2008. 
246 247 
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Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
sOUZA. M.A.: DETMANN. E.: ROCHA. G.C.: FRANCO, M.O. 
BATISTA. E.D.: VALADARES FILHO. S.C.; BERCHIELLI, T.T 
Collaborative study to evaluate the indigestible neutral detergent fiber and 
indigestible acid detergent fiber contents in feeds by in situ procedure. 
Semina. Cieências Agrárias, v.37. p.2589-2600, 2016.
Capitulo 12 
Solução mineral
Definições básicas 
As cinzas isoladas por intermédio da queima em mufla, embora 
indicadores do total de minerais presentes nos alimentos, não constituem 
indicação acurada da concentração de minerais individuais. Além das 
perdas por volatização e interações sobre a conformação química dos 
minerais, contaminações indesejadas podem ocorrer no interior da mufla 
(Baker et al., 1964; Issac & Jones Jr.. 1972). Assim. para se conhecer a 
concentração de minerais específicos de determinada amostra é 
necessário transformar a matéria mineral em solução mineral e. em 
seguida, analisá-los individualmente. 
Para quantificação da concentração de um elemento em uma 
amostra de alimento, deve-se primeiro destruir a matriz orgânica que 
forma a estrutura dessa amostra. Essa remoção pode ser conduzida 
pela oxidação dos compostos orgânicos do alimento utilizando ácidos
(Gomes & Oliveira, 2011). Neste contexto, constitui procedimento 
comum a utilização conjunta dos ácidos nítrico (HNO:) e perclórico 
(HCIO4). 
Em geral, a preparação da solução mineral por digestão ácida 
possui algunmas vantagens em relação ao isolamento dos minerais apenas 
48 249 
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Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição 
por queima (incineração). Entre essas, destaca-se. principalmente, a menor 4:1 entre os ácidos nítrico e perclórico e pode ser aplicada a diversas
possibilidade de perda por volatilização devido à menor temperatura de matrizes orgânicas, com exceção de ossos e cartilagens. A segunda 
digestão (200°C). Em contrapartida, este procedimento denmanda (M-004/3) pode ser aplicada a qualquer matriz orgânica, incluindo 
instalações especiais para eliminação dos vapores ácidos, além do perigo 
OSSOS e cartilagens. Em tese. o método M-004/3 poderia ser a única
de manuseio do ácido perclórico, que, quando aquecido, torma-se um 
Versão a ser aplicada. Contudo. geralmente. o ácido perclórico 
desidratante-oxidante (Silva & Queiroz, 2002).
apresenta maior custo. Logo. quando ossos e cartilagens não fazem
parte do escopo de amostras a ser analisado. o método M-004/2 reduz 
Atualizações 
O custo de análise, sem que haja comprometimento sobre a 
A versão anterior do método de produção de solução mineral recuperação de minerais. 
se baseava na digest�o ácida em duas etapas (i.e., nítrica e 
Digestäo nitro-perclórica posteriormente perclórica). Contudo, em função dos trabalhos de 
(Método M-004/2) Palma et al. (2015) e Rocha et al. (2015), evidenciou-se que os ácidos 
Aplicávela matrizesorgânicas, com exceção de ossos e 
podem ser previamente misturados e adicionados em conjunto sobre a 
cartilagens amostra, o que reduz o número de etapas, aumenta a praticidade e 
reduz o tempo de análise.
Aparatos
Adicionalmente, o método original (M-004/1) baseava-se no 
uso de uma razão única entre os ácidos nítrico e perclórico (4:1), a 
- Balança analítica com precisão de 0.0001g
qual era considerada adequada para todos os tipos de matrizes 
- Papel filtro quantitativo, livre de cinzas e de filtração rápida
Balões volumétricos de 25, 50 ou 100 mL orgânicas. Contudo, Palma et al. (2015) verificaram que matrizes de 
- Balöes volumétricos de 1000 mL maior rigidez, como ossose cartilagens, demandariam maior
Funis raiadosproporção de ácido perclórico para liberação otimizada dos minerais a 
serem analisados. Assim, o método M-004/1 foi desmembrado e 
Frasco de vidro âmbar para armazenamento de solução 
- Bloco digestor
atualizado em duas versões, a primeira (M-004/2) mantém a relação 
250 251 
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Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição 
Tubos de digestão em borossilicato com orla 
Homogeneíze e complete o volume com água ácido nítrico. 
- Potes de polietileno com tampa rosqueável 
Homogeneíze, aguarde estabilizar e transfira a solução para um 
- Capela com exaustão
frasco âmbar.
Reagentes 
Procedimentos 
- Ácido clorídrico (HCI) 37% P.A. 
- Ácido perclórico (HC10,) 70% P.A. 1. Use balança analítica aferida pelo INMETRO, com precisão de 
- Ácido nítrico (HNO:) 65% P.A. 0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente 
climatizado (20-25°C ou de acordo com as especificações do 
Soluções fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua 
estabilização. Solução de ácido clorídrico (200 mL/L) 
Em capela, em um balão de 1000 mL com cerca de 200 mL de água 
2. Lave toda a vidraria exclusiva para minerais (tubos, funis, balões 
destilada, adicione 200 mL do ácido clorídrico. Complete o volume 
volumétricos, etc.), usando solução de ácido cloríidrico (200 mL/L)
com água destilada e homogeneíze a solução. ou solução de ácido nítrico (100 mLL), em seguida, enxágue bem 
com água destilada. Sugere-se que a vidraria possa seja mantida
Solução de ácido nítrico (HNO3 100mLL) 
com das soluções ácidas por uma noite. 
- Em capela, em um bal�o de 1000 mL com cerca de 200 mL de água 
destilada, adicione 100 mL do ácido nítrico. Complete o volume com 3. Pese aproximadamente 200 mg de amostra seca ao ar e coloque no 
água destilada e homogeneíze a solução. tubo devidamente identificado. 
Solução nitro-perclórica 4:1 4. Em capela, adicione 5 mL da solução nitro-perclórica e deixe em 
Em capela, em um balão de 1000 mL, adicione cerca de 200 mL de 
repouso durante 30 minutos. 
ácido nítrico. Em seguida, adicione 250 mL de ácido perclórico. 
252 253 
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Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
5. Acondicione os tubos em bloco digestor e aqueça lentamente até 
8. Complete o volume do bal�o com água destilada. atingir a temperatura de 200°C. O bloco digestor deve permanecer 
9. Transfira a soluç�ão mineral para potes de polietileno devidamente 
em capela com o exaustor ligado durante toda a digestão. O 
limpos. Realize a lavagem do frasco no momento da transferência 
aquecimento no início deverá ser lento, até que cesse a formação de 
com um pouco da solução mineral. Adicione cerca de 5 a 10 mL da 
espuma. sendo aumentado em seguida. para haver ebulição e 
solução no frasco, tampe e agite. Descarte este material e então desprendimento de gases com coloração marrom-avermelhada. 
acondicione a solução a ser armazenada. Amazene a soluç�o em 
Aguarde até a solução tormar-se clara e cessar o desprendimento de 
geladeira até o momento da leitura.vapor de coloração marrom. Jamais permita que o aquecimento se 
prolongue até secar completamente, pois, nessas condições, poderá Recomendações adicionais 
ocorrer explosão. Caso o volume alcance aproximadamente 1 mLe 
1. Use somente água destilada ou desmineralizada e vidrarias exclusivas ainda estiver ocorrendo o desprendimento de vapor marrom, retire 
para análise de minerais para evitar contaminação com minerais de 
os tubos do bloco, mantendo-os, contudo, no interior da capela.
outros procedimentos. 
Aguardeo resfriamento até a temperatura ambiente, adicione 5 mIL 
da mistura nitro-preclórica e reinicie o aquecimento no bloco. 2. Embora não haja nada que indique que há deterioração da solução
mineral, recomenda-se o armazenamento da mesma sob refrigeração 6. Retire os tubos e os deixe-os esfriar no interior da capela.
(4°C).
7. Proceda à transferência quantitativa do material para balão 3. Durante a feitura da solução, use um bal�ão limpo para cada solução. 
volumétrico de 25, 50 ou 100 mL. Utilize papel de filtro 
Não reutilize balões entre soluções sem a devida limpeza. 
quantitativo, livre de cinzas e de filtração rápida. O volume do balão
a ser utilizado irá depender da concentração do(s) mineral(is) de 
interesse e da sensibilidade analítica do método de quantificação ba 
ser utilizado posteriormente. 
255 254 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
Digestão nitro-perclórica 
Soluçies
(Método M-004/3) 
Aplicável a todas as matrizes orgânicas, incluindo ossos e Solução de ácido clorídrico (200 m/L) 
cartilagens Em capela, em um balão de 1000 mL com cerca de 200 mL de água 
destilada, adicione 200 mL do ácido clorídrico. Complete o volume
Aparatos com água destilada e homogeneíze a solução. 
Balançaanalítica com precisão de 0,0001g Solução de ácido nítrico (100 mL/L) 
Papel filtro quantitativo, livre de cinzas e de filtração rápida 
- Em capela, em um balão de I000 mL com cerca de 200 mL de água 
Balões volumétricos de 25, 50 ou 100 mL destilada, adicione 100 mL do ácido nítrico. Complete o volume com 
Baloes volumétricos de 1000 mL água destilada e homogeneíze a solução. 
-Funis raiados 
- Frasco de vidro âmbar para armazenamento de solução Solução nitro-perclórica 2:1 
Bloco digestor 
- Em capela, em um balão de 1000 mL. adicione cerca de 200 mL de 
Tubos de digestão em borossilicato com orla ácido nítrico. Em seguida, adicione 333 mL de ácido perclórico. 
- Potes de polietileno Homogeneíze e complete o volume com água ácido nítrico. 
- Capela com exaustão Homogeneíze, aguarde estabilizar e transtira a solução para um 
frasco âmbar.
Reagentes 
Procedimentos 
Ácido clorídrico (HCI) P.A. 1. Siga todos os procedimentos definidos para o método M 004/2, Ácido perclórico (HCI0. 70%) P.A. substituindo, contudo, a mistura ácida de 4:1 por 2:1. 
Acido nítrico (HNO; 65%) P.A. 
256 257 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição
Literatura Citada 
Capítulo 13 
BAKER. D.E.: GORSLINE. G.W.: SMITH. C.B.: THOMAS, W.I.: GRUBE, 
W.E.: RAGLAND. J.L. Technique for Rapid Analyses of Corn leaves for 
eleven elements. Agronomy Journal. v.56. p.133-136, 1964. Fósforo inorgânico total 
GOMES. J.c.: OLIVEIRA. G.F. Análises fisico-químicas de alimentos. 
Viçosa: Editora UFV. 2011. 303p Definições básicas 
ISAAC, R.A.: JONES Jr.. J.B. Effects of various dry ashing temperatures on 
the determination of 13 nutrient elements in five plant tissues 
Communications in Soil Science and Plant Analysis, v.3, 261-269,
A avaliação direta de fósforo em amostras convertidas em solução 
1972. mineral pode ser realizada com base em reações coloriméticas. Uma 
alternativa consiste em colocar o fósforo presente na soluç�o mineral em SILVA, D.J.: QUEIROZ, A.C. Análise de Alimentos. Métodos químicos e 
biológicos. 3 ed. Viçosa: Editora UFV, 2002. 235p.
contato com molibdato de amônio, produzindo amônio fosfomolibdato. 
PALMA. M.NN: ROCHA, G.C.; VALADARES FILHO, S.C.; 
DETMANN, E. Evaluation of acid digestion procedures to estimate 
mineral contents in materials from animal trials. Asian-Australasian 
Este composto é reduzido na presença da vitamina C (ácido ascórbico). 
formando óxidos coloidais proporcionais à concentraçãode fósforo na 
Journal of Animal Science, v. 28, p. 1624-1628, 2015. 
solução. O excesso de molibdato de amônio não reage com a vitamina C. 
ROCHA, G.C.; PALMA, MN.N. DETMANN, E.; VALADARES FILHO,
S.C.. Evaluation of acid digestion techniques to estimate chromium 
contents in cattle feces. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.50, p.92- 
95, 2015.
A quantidade de fósforo é quantificada medindo-se a intensidade 
de cor azul, que é produzida pela formação dos óxidos coloidais reduzidos 
de molibdato. A intensidade da cor desenvolvida pelo fosfomolibdato 
depende da acidez e da temperatura da solução. sendo estável em solução 
ácida (Silva& Queiroz, 2002).
Atualizaçõöes 
Nenhuma atualização direta foi realizada sobre o método aplicado
à quantificação do fósforo inorgânico total. Apenas ressalta-se que as 
259 
258 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
modificações introduzidas por intermédio dos 
métodos M-004/2 e M- 
Soluções
004/3 devem ser aplicadas aqui. 
Solução de ácido ascórbico (40 g/L) 
Coloque 4 g de vitamina C em um balão de 100 mL e complete o 
Método do Fósforo-Molibdato 
volume com água destilada ou desmineralizada. 
(Método M-008/2)
A validade da solução é de 60 minutos. Assim, aconselha-se que esta 
Aparatos solução seja preparada somente no momento no qual as 
análises
serão realizadas. 
- Balões volumétricos de 50, 100 e 1000 mL 
Béqueres de 200 e 500 mL Solução ácida de molibdato 
Espectrofotômetro UV/Visível 
Solução A 
- Funis raiados
- Em béquer de 500 mL, pese 1 g de carbonato de bismuto, adicione 
- Bastões de vidro 
200 mL de água destilada ou desmineralizada e, cuidadosamente, 
- Pipetas graduadas 
138 mL de ácido sulfúrico concentrado. 
Homogeneíze com um bastão de vidro e deixe em repouso por 30 Reagentes 
minutos.
- Acido sulfúrico (HS0.) concentrado P.A. 
- Carbonato de bismuto [(Bi0),CO;] P.A. Solução B 
Molibdato de amônio tetraidratado [(NH:)%Mo;034.4H;0] P.A. Em béquer de 200 mL, adicione 20 g de molibdato de amônio 
e 150 
Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) P.A. mL de água destilada ou desmineralizada. Agite
com bast�o de vidro 
Vitamina CP.A. (ácido ascórbico) até a solubilização. 
261 
260 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição
Solução final Tabela 13.1 - Esquema para preparação dos padrões de fósforo
-Junte as duas soluções em um balão de 1000 mLe complete o volume 
Concentrações (ppm) com água destilada ou desmineralizada. 
Solução (mlL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 
Solução padrão de fósforo (solução estoque 1000 ppm) Solução de trabalho 3 4 
Em um balão volumétrico de 1000 ml, pese 4,39 g de fosfato de Solução ácida de molibdato 5 5 5 5 5 
potássio monobásico P.A. e complete o volume com água destilada. Adicionar água destilada ou desmineralizada a 2/3 e agitar 
A massa de KH;PO; deverá ser ajustada para a pureza do reagente. Solução de ácido ascórbico (40 g/L) 2 2 2 
Alternativamente, padrões minerais podem ser adquiridos Agua 9.s.p. 50 mL e agitar 
diretamente na forma de ampolas para serem diluídos em OBS: Aguarde 5 minutos após se completar o volume para que haja 
estabilidade da coloração azul. quantidades específicas de água. O uso destes padrões é interessante, 
pois os mesmos reduzem o risco de erro devido à necessidade de 
Procedimentos 
pesagem de massas pequenas e exatas para produç�o da solução
estoque. 1. Lave toda a vidraria exclusiva para minerais (tubos, funis, balões
volumétricos, pipeta etc.), usando solução de ácido cloridrico (200 
Solução de trabalho 
mL/L) ou solução de ácido nítrico (100 mL/L), em seguida, 
Em um balão de 1000 mL, adicione 10 mL da solução estoque (1000
enxágue bem com água destülada. Detalhes sobre estas soluções
ppm) e complete o volume com água destilada ou desmineralizada. 
podem ser encontrados no Capítulo 12. 
Soluções padrões 2. Veja preparo de solução mineral no capítulo 12. 
- Utilize balões de 50 mL e estabeleça os padrões conforme indicado 
na Tabela 13.1. 3. Transtira uma alíquota da solução mineral a ser analisada para 
balões de 50 mL já contendo 5 mL da solução ácida de molibdato 
de amonio e2 mL de solução de ácido ascórbico. Para a maioria dos 
262 263 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição 
materiais, alíquotas de I mL são suficientes. No entanto, esta poderá 
Cálculo da concentração de fósforo 
variar em função da concentração de fóstoro na amostra. Materiais 
com teores baixos de fósforo exigirão alíquotas maiores. Torna-se Utilize sequencialmente as equações abaixo: 
importante ressaltar que a concentração da solução de leitura deve 
estar entre 0.2 e 0.8 ppm. Isso é facilmente perceptível a olho nu B xA) 
comparando-se a intensidade da coloração azul da solução de leitura 
com os padrões (que devem ser os primeiros a serem produzidos). 
AA 
[Pls 
4. Acrescente 20 mL de água destilada. Homogeneíze e complete o 
volume com água destilada ou desmineralizada. Esta solução
VBSL 
(PlAsa-[Plst ASM 
VBSM 
utilizada para avaliação da concentração de fósforo na amostra é ASA 
denominada "solução de leitura"
em que: ß = fator de conversão de absorbância em concentração por 
5. Agite a solução levemente e deixe em repouso por 5 minutos. 
intermédio da Lei de Lambert-Beer ((ppm): Pi = concentração de 
6. Ajuste o espectrofotômetro para o comprimento de onda de 725 nm. fósforo no padrão i (ppm); Ai = absorbância no padrão i: Plst = 
concentração de fósforo na solução de leitura (ppm); AA = 
7. Proceda à calibração do aparelho, inserindo o "branco" (0 ppm) e absorbância para a amostra: [P]asA = concentração de fósforo com 
ajustando a absorbância para zero (A=0). Insira os demais padrões base na amostra seca ao ar (ppm): VBSL = volume do balão usado no 
e obtenha as absorbâncias. preparo da solução de leitura (no caso dos procedimentos aqui 
descritos este volume será fixado em 50 mL); ASL: alíquota de 
8. Insira as soluções de leitura e obtenha as respectivas absorbäncias. 
solução mineral usada no preparo da solução de leitura (mL); VBSM 
-OBS: O tempo entre o preparo da solução de ácido ascórbico e a volume do balão volumétrico usado para o preparo da solução
leitura não deve ultrapassar 60 minutos. mineral (mL); ASA = massa de amostra seca ao ar usada no preparo 
E da solução mineral (g). 264 265 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos -2" EdiçãoE desejável que [P]st. esteja entre 0,2 e 0,8 ppm. Quanto
Balão volumétrico usado no preparo da solução mineral: 100 mL. 
mais próximo à média, maior a confiabilidade da leitura. Leituras 
Absorbância da solução de leitura: 0.204 no extremo superior (0,8-1,0 ppm) possuem baixa confiabilidade. 
Leituras no extremo inferior (0-0,2 ppm), além da baixa 
Padrão (ppm) Absorbancia confiabilidade, poderão sofrer interferências significativas do 
0,0 0.000 ruído do equipamento. A [PlsL pode ser ajustada pelo analista 0,2 0.094 variando-se a alíquota de solução mineral usada para o preparo 0,4 0.201da solução de leitura. Extrapolações (i.e., [Plsu > 1,0 ppm) não são 0,6 0.312 
0,8 0416 
toleradas. 
1,0 0.539Proceda à correção da concentração para a umidade residual: 
B2PxAR A_0.0x0,000)+.+(1,0x0,539) 0.5265 PlMs X 100 PlASA 100 
(0,0)2++(1,0)2 %ASE 
AA 0,204 Pls 0,5265 =0,3875 ppm 
em que: P]Ms = concentração de fósoforo com base na matéria seca 
(ppm); %ASE = percentual de "amostra seca em estufa". 
VBSL VBSM 
PlASA=[PlsXASMASA .38/5 5*0,2692 
50 v 100 =1439,5 ppm 
Exemplo de cálculo
PlaSA100 9586 PlMs90ASE 
1439,5
x100=1501,7ppm>0,150% 
Alíquota usada no preparo da solução mineral (amostra seca ao 
ar): 0,2692 g. 
o ASE: 95,86%. 
Alíquota de solução mineral usada na produção da solução de 
leitura: 5 mL. 
267 266 
INCT Cíência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
Literatura citada 
Capítulo 14 
SILVA. D.J.: QUEIROZ, A.C. Análise de Alimentos. 
Métodos químicos e 
biológicos. 3 ed. Viçosa: Editora UFV, 2002. 235p. Cromo 
Literatura adicional 
Definições básicasBRAGA, J.M.: DEFELIPO, B.V. Determinação espectrofotométrica de 
fósforo em extratos de solos e material vegetal. Revista Ceres, v.21, p.73- 
75, 1974. 
Vários elementos químicos, seja na forma de óxido ou de sal. 
podem ser usados como indicadores externos em ensaios de digestão
FISKE, C.A.: SUBBAROW, I. The colorimetric determination of 
phosphorus. Journal of Biological Chemistry, v.66, p.375, 1925. 
com ruminantes. Entre estes, destacam-se: itérbio, érbio, eurÓpio.
cádmio, cobalto, lantânio, ouro, cério, titänio e cromo. Este último 
elemento, notadamente sob a forma de sesquióxido de cromo ou óxido 
crômico (Cr-03), é o indicador extermo mais utilizado para a 
quantificação da excreção fecal de bovinos em confinamento ou a 
pasto. Tal peculiaridade se deve ao fato do óxido crômico ser 
facilmente adicionado à dieta, ser facilmente analisado e apresentar 
baixo custo (Detmann et al., 2004). 
Entre as características ideais de um indicador, pode-se
enfatizar a capacidade deste ser completamente recuperado nas fezes 
Ou em qualquer segmento do trato grastrintestinal (Owens & Hanson, 
1992). A falta dessa característica pode resultar em estimativas 
viesadas do fluxo de digesta ou excreção fecal. Em termos teóricos, a 
capacidade de recuperação constitui característica inerente ao 
indicador (Detmann et al., 2007). Contudo, influências indiretas dos 
268 269 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos -2" Ediço 
métodos aplicados para estimar a sua concentração pode resultar em 
Atualizações desvios aparentes de recuperação. 
Vários métodos para avaliar o teor de cromo em amostras de Os métodos propostos na primeira edição foram devidamente 
fezes podem ser encontrados na literatura. Geralmente, esses métodos avaliados por Souza ct al. (2013). Contudo, em trabalho de avaliação 
são baseados na combinação de duas técnicas diferentes. A primeira. da otimização do método M-005/1. Rocha et al. (2015) verificaram 
denominada geralmente de abertura, é usada para eliminar a matéria que a relação entre os ácidos nítrico e perclórico poderia ser 
orgânica da amostra deixando o cromo em uma forma química modificada de 2:1 para 3:1. sem comprometer a exatidão e precisão 
quantificável. Neste ponto. aplica-se a segunda técnica, que é das estimativas, porém reduzindo o custo das análises. Esta 
responsável pela quantificação da concentração em si. modificação foi adotada. Por outro lado. nenhuma modificação foi 
A primeira técnica está normalmente baseada na digestão proposta para o método M-006/ 1. 
ácida sob altas temperaturas. A digestão ácida das amostras altera a 
Digestão nitro-perclórica 
valência do cromo de +3 (sesquióxido) para +6 (dicromato). A partir 
(Método M-005/2) 
daí. o elemento é facilmente quantificado. Vários ácidos ou 
combinações de ácidos podem ser empregados no processo de Aparatos
digestão, sendo mais comuns as misturas de ácidos nítrico e perclórico Balança analítica com precisão de 0.0001 g 
(Kimura & Miller, 1957) e de ácidos sulfúrico e perclórico (Fenton & - Tubos de digestão em borossilicato com orla 
Fenton, 1979). Neste Manual, faculta-se a utilização de um desses Bloco digestor
processos de digestão, ambos acompanhados de quantificação por - Papel filtro quantitativo, livre de cinzas e de filtração rápida
espectrofotometria de absorção atômica, pois ambos fornecem Balões volumétricos 
estimativas exatas do teor de cromo fecal (Souza et al., 2013). A - Funis raiados 
digestão em ácido fosfórico (Williams et al., 1962)e a quantificação Potes de polietileno 
por colorimetria (Kimura & Miller, 1957) não são recomendadas -Espectofotômetro de absor_ão atômica 
devido à falta de exatid�o das estimativas obtidas (Souza et al., 2013). - Frasco Erlenmeyer de 2000 mL 
270 271 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição- Pipetas
- Capela com exaust�ão molibdato de sódio PA (concentração de lg/L de solução). Agite 
com bastão de vidro at� a solubilização 
Reagentes 
Padroes 
- Åcido clorídrico (HCI) 37% P.A. 
- Faça soluções padrões contendo 0. 2. 4, 6. 8 e 10 ppm de cromo a 
- Acido nítrico (HNO;) 65% P.A. 
partir de uma solução estoque contendo 1000 ppm de cromo. Sugere- 
Ácido perclórico (HCI04) 70% P.A. 
se a aquisição de padrões ou soluções estoque de cromo comerciais 
- Molibdato de sódio diidratado (Na2MoO4 2H,0) P.A. (eg. Merk 1,09948 Tritisol®). 
- Ressalta-se que pode haver pequenas variações nas concentrações de 
Soluções 
cromo nos padrões (e.g., 0-8 ppm. 0-12 ppm) devido a 
Solução de ácido cloridrico (200 m/L) peculiaridades dos equipamentos (faixa de linearidade de 
Em um balão de 1000 mL com cerca de 200 mL de água destilada, mensuração de cada equipamento). 
dissolva 200 mL de ácido clorídrico P.A. Complete o volume com 
Procedimentos 
água destilada e homogeneíze a solução.
1. Use balança analítica aferida pelo INMETRO, com precisão de 
Solução de ácido nítrico (100 ml) 0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente 
Em um balão de 1000 mL com cerca de 200 mL de água destilada, climatizado (20-25°C ou de acordo com as especificações do 
dissolva 100 mL de ácido nítrico P.A. Complete o volume com água fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua 
destilada e homogeneíze a solução. estabilização. 
Solução digestora 2. Lave toda a vidraria exclusiva para minerais, usando solução de 
- Em capela, em um Erlenmeyer, misture cuidadosamente 1200 mL de ácido clorídrico ou solução de ácido nitrico, em seguida, enxágue 
ácido nítrico P.A. e 400 mL de ácido perclórico P.A. (relação entre bem com água destilada. Veja detalhes no Capítulo 12. 
os ácidos nítrico e perclórico de 3:1 v:v). Adicione 1,6 g de 
273 272 
INCT Ciencia Animal
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
3. Pese. aproximadamente. 250 mg de amostra seca ao ar e coloque no 
10. Transfira uma alíquota para potes de polietileno devidamente tubo devidamente identificado. 
limpos. Realize a lavagem do frasco no momento da transferência 
com um pouco da solução mineral de cromo. Adicione cerca de 5 4. Adicione 5 mL da solução digestora e deixe em repouso por 30 
minutos. 
a 10 mL da solução no frasco, tampe e agite. Descarte este material 
5. Acondicione os tubos em bloco digestor e aqueça lentamente à e então acondicione a solução a ser armazenada. 
temperatura de 200°C. Mantenha aquecido até atingir coloração 
alaranjada e cessar o desprendimento de vapor marrom. Não deixe 11. Armazene a solução em geladeira (4°C) até o momento da leitura. 
o material secar durante a digestão, pois há risco de explosão. O 
12. Após a calibração com os padrões, proceda à leitura em volume final deve ficar entre 1 e 2 mL (siga as mesmas
espectrofotômetro de absorção atômica utilizando lâmpada de 
recomendações de segurança feitas para o método M-004/2), 
cátodo oco para cromo (comprimento de onda de 357.9 nm) e chama 
6. Retire os tubos e os deixe esfriar na capela. de acetileno e óxido nitroso.
7. Proceda à transferência quantitativa do material para balão Digestão sulfo-perclórica 
volumétrico de 25, 50 ou 100 mL. Uilize funis e papel de filtro (Método M-006/1)
quantitativo, livre de cinzas e de filtração rápida. O volume do balão
Aparatos
a ser utilizado irá depender da concentração de cromo na amostra. 
Balança analítica com precisão de 0,0001 g 
8. Complete o volume do balão com água destilada ou Erlenmeyer de 50 mL em borossilicato com orla 
desmineralizada. Erlenmeyer 2000 mlL 
- Funis raiados 
9. Cubra o balão com tampa ou para-filme e homogeneizar a solução. - Forno mufla com temperatura controlada 
Bolas de vidro 
275 
214 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Nimentos-2" Fdição 
- Banho de areia 2. Lave toda a vidraria exclusiva para minerais, usando solução de 
- Papel filtro quantitativo. livre de 
cinzas e de filtração rápida 
ácido clorídrico (200 m/L) ou solução de ácido nítrico (100 
Potes de polietileno mL/L), em seguida, enxágue bem com água destilada.Veja 
Baloes volumétricos detalhes no Capítulo 12. 
- Espectrofotômetro de absorção atômica 
3. Pese, aproximadamente, 1 g de amostra seca ao ar e coloque em - Capela com exaustãão 
erlenmeyer de borossilicato de 50 mL devidamente identificado. 
Reagentes 
4. Acondicione os erlenmeyers contendo as amostras em mutla.
- Ácido sulfúrico (H;SO) concentrado P.A. 
Aqueça até atingir a temperatura de 600°Ce mantenha por 4 horas. 
Acido perclórico (HCI04) 70% P.A. 
5. Após este tempo, desligue a mufla e deixe que a mesma resfrie fechada
Soluções até se atingir a temperatura ambiente. 
Solução de ácidos sulfúrico e perclórico 
6. Adicione aos Erlenmeyers 15 mL da solução de ácidos sulfúrico e 
- Em capela, em um frasco Erlenmeyer de 200 mL faça uma mistura 
perclórico. 
de água destilada ou desmineralizada, ácido sulfúrico P.A. e ácido 
perclórico P.A. na raz�o de 0,75:0,75:1 (v/v/v). 7. Cubra os erlenmeyers com bolas de vidro e leve-os ao banho de 
areia para digestão a 300°C até as amostras atingirem coloração 
Procedimentos amarelada. Este procedimento deve ser realizado em capela. 
1.Use balança analítica aferidapelo INMETRO, com precisão de 0,0001
8. Espere esfriar à temperatura ambiente. 
g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente climatizado 
(20-25°C ou de acordo com as especificações do fabricante). Ligue a 9. Proceda à transferência quantitativa do material para bal�o 
balança e aguarde 30 minutos para sua estabilização. volumétrico de 25, 50 ou 100 mL. Utilize funis e papel de filtro
276 277 
Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição
INCT Ciência Animal 
A suposição do teor de 68.4% de cromo no óxido 
crômico n�ão 
quantitativo, livre de cinzas e 
de filtração rápida. O 
volume do balão
deve ser utilizada em nenhuma hipótese. pois os óxidos adquiridos 
a ser utilizado irá depender da concentração 
de cromo na amostra. 
comercialmente variam muito quanto ao teor real de cromo. E comum 
10. Complete o volume do 
balão com água destilada ou 
verificar-se teores variando de 55 a 60%. Assim, a dose real de cromo 
desmineralizada. deve ser aferida por experimento e/ou por partida de óxido crômico 
adquirida. 
11. Cubra o balão com tampa ou parafilme e homogeneíze 
a solução.
A abertura das amostras de óxido crômico é feita de forma 
12. Transfira uma alíquota para potes de polietileno 
devidamente 
similar às amostras fecais, com as seguintes sugestões: 
limpos. Realize a lavagem do frasco no momento da 
transferência 
1. Pesar alíquotas de 100 a 150 mg 
com um pouco da solução mineral de cromo. Adicione cerca de 
5 
a 10 mL da solução no frasco, tampe e agite. Descarte este material 2. Utilizar balões de 100 ou 200 mL 
e então acondicione a solução a ser armazenada. 
3. E relativamente comum a necessidade de diluir as soluções minerais 
antes da leitura na absorção atômica. 
13. Armazene a solução em geladeira (4°C) até o momento da leiura. 
14. Após a calibração com os padrões, proceda à leitura em Cálculo da concentração de cromo
espectrofotômetro de absorção atômica utilizando lâmpada de 
Utilize sequencialmente as equações abaixo: 
cátodo oco para cromo (comprimento de onda de 357,9 nm) e chama 
de acetileno e ózido nitroso. 
B-2(xA) 
Procedimentos adicionais 
AA 
Durante a condução de ensaios de consumo e/ou digestão 
amostra(s) do óxido crômico utilizado deve(m) ser reservada(s) para 
que a mesma seja aferida quanto ao teor de cromo.
279 
278 
INCT Ciencia Animal Métodos para Análise de Alimentos -20 Edição 
VBSM 
[CrlASA=[Crls1xFx ASA Proceda à correção da concentração para a umidade 
residual: 
CrlASA 100 CrMs%ASEem que: B = fator de conversão de absorbância em concentração por 
intermédio da Lei de Lambert-Beer /ppm); Pi = concentração de 
em que: [Cr]Ms = concentração de 
cromo comn base na matéria seca 
cromo no padrão i (ppm); Aj = absorbância no padrão i; [Cr]sL 
= 
(ppm): %ASE = percentual de "amostra seca 
em estufa"
concentração de cromo na solução de leitura (ppm); AA = absorbância 
para a amostra; [Cr]asA = Concentração de cromo com base na 
amostra 
Exemplo de cálculo em uma amostra fecal 
seca ao ar (ppm); F = fator de diluição da solução mineral para compor 
a solução de leitural4l; VBSM = volume do balão volumétrico usado Alíquota usada no preparo da solução mineral (amostra 
seca ao 
para o preparo da solução mineral (mL); ASA = massa de amostra seca ar): 0,2501 g. 
ao ar usada no preparo da solução mineral (g). Balão volumétrico usado no preparo da soluçãomineral: 50 mL. 
o ASE: 90,15%.
É desejável que [Cr]st esteja entre 2 e 8 ppm. Quanto mais 
Diluição da solução mineral para compor a solução 
de leitura: 1 
próximo à média, maior a confiabilidade da leitura. Leituras no mL em 4 mL de água destilada [F = (4+1)/1 = 5]. 
extremo superior (8-10 ppm) possuem baixa confiabilidade. Leituras - Absorbância da solução de leitura: 0,1391 
no extremo inferior (0-2 ppm), além da baixa confiabilidade, podero 
Absorbância sofrer interferências significativas do ruído do equipamento. A Padrão (ppm) 
[Crlst. pode ser ajustada pelo analista variando-se a alíquota de 0,0000 
0,0367 solução mineral usada para o preparo da solução de leitura 
Extrapolaçöes (ie., [Crlst.> 10 ppm) não são toleradas. 4 0,0758 
6 0,1200 
8 0,1644 
41 Este fator de diluição é aplicado quando, anteriormente à leitura, há 
necessidade de nova diluição das soluções minerais produzidas por 
intermédio dos métodos M-005/2 e M-006/1.
10 0,1967 
281 280 
INCT Ciência Animnal 
Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição
2XA_(Ox0,0000)+..+(10x0,1967) 
E,P =0,0199 Absorbância da solução de leitura: 0.1644(0)2++(10)2 
AA 0,1644 
[Crsu 0,0199 =8,2598 ppm [Cr)s 0,01996,9887 ppm 
AA 0,1391 
VBSM 
Cróxido|CTJsuxr Alíquota VBSM =6,9887xS* 0,1391ASA 50 [CrlasA=[CrlsLXFx- = 12560,5 ppm 
200 
Crloxido8,2598x35x =548043,4 ppm 1055 
12560,5CrlasA 100 90,15 Cr]Ms %ASE [Crlóxide=548043,4 ppm >54,80%- x100=13932,9 ppm1,39%
Logo, caso a dose diária de óxido crômico seja de 10 g. então OBS: alguns equipamentos utilizam uma função quadrática (i.e., a dose real de cromo seria de 5,48 ge não de 6.84 g (considerando-se 
segundo grau) passando pela origem para ajustar a curva padrão (ao a concentração teórica de 68,4%o de cromo no óxido crômico). 
contrário da reta passando pela origem aqui apresentada). Assim, os 
Referências Bibliográficas resultados de concentração nas soluções podem apresentar valores
DETMANN, E; VALADARES FLHO. S.C.: PAULINO, M.F. 
ZERVOUDAKIS, J.T.: CABRAL, LS. Avaliação da técnica dos 
indicadores na estimação do consumo por ruminantes em pastejo.
Cadernos Técnicos de Veterinária e Zootecnia, v.46, p.40-57, 2004.
ligeiramente divergentes do método aqui apresentado. 
Exemplo de cálculo em uma amostra de óxido crômico 
DETMANN, E.; SOUZA, A.L.: GARCIA, R.: VALADARES FILHO, S.C. 
CABRAL, L.S.; ZERVOUDAKIS, J.T. Avaliação do vício de "tempo
longo" de indicadores internos em ensaio de digestão com 
ruminantes. 
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.59, p.182- 
188, 2007 
- Alíquota de óxido crômico usada no preparo da solução mineral 
(amostra seca ao ar): 0,1055 g. 
Balão volumétrico usado no preparo da solução mineral: 200 mL 
FENTON, T.W.; FENTON, M. An improved procedure for the determination 
of chromic oxide in feed and feces.Canadian Journal 
of Animal 
Science, v.59, p.631-634, 1979. 
Diluição da solução mineral para compor a solução de leitura: 
0,2 mL. em 6,8 mL de água destilada [F = (6,8+0,2)/0,2 =35]. 
283 
282 
INCT Cncia Animal Mtndos para Análive de Aiimentse 2 Fdict 
KIMURA. F.T.: MILLER. V.L. Improved 
determination of chromicoxide
in 
cow feed and feces. Journal of 
Agricultural and Food 
Chemistry. v.5. 
p.216-216. 1957. 
Capítulo 15 
OWENS. FN.: HANSON. C.F. 
Extermal and intermal markers 
for appraising 
site and extent of digestion in ruminants.Journal 
of Dairy Science, v.75, 
p.2605-2617. 1992 
Nitrogênio amoniacal em fluidos biológicos 
ROCHA. G.C.:PALMA. M.N.N.: 
DETMANN, E.: VALADARES 
FLHO,
S.C. Evaluation of acid digestion techniques to 
estimate chromium 
contents in cattle feces Pesquisa Agropecuária 
Brasileira, v.50, p.92- 
95. 2015.
Definições hásicas 
A concentração de nitrogênio amoniacal (N-NH:) tem
sido 
SOUZA. N.K.P.: DETMANN. E.: PINA. D.S.: 
VALADARES FILHO, S.C.; 
SAMPAI0. C.B.: QUEIROZ, A.C.: VELOSO, C.M. 
Evaluation of 
chromium concentration in cattle feces using different acid digestion 
and 
spectrophotometric quantification techniques. Arquivo 
Brasileiro de 
Medicina Veterinária e Zootecnia, v.65, p.1472-1482, 2013.
usada como uma referência qualitativa para entender a adequação do 
ambiente ruminal quanto a atividade microbiana sobre 
os carboidratos 
fibrosos (Detmann et al.. 2009). Isto está possivelmente associado com 
o fato de o N-NH: ser a fonte de nitrogenio preferida para 
o 
WILLIAMS. C.H.: DAVID. D.J.; IISMAA, O. The determination of 
chromic 
oxide in faeces samples by atomic absorption spectrophotometry. 
Journal of Agricultural Science, v.59, p.381-385, 1962.
crescimento de microrganismos fibrolíticos (Russell, 2002). Por 
outro 
lado, avaliações qualitativas da produçäo de silagem tambén
se 
baseiam na concentração de N-NH: no "suco" como uma 
das 
características para monitoramento de adequado processo
fermentativo (Santos et al.. 2010). 
Assim, considerando a relevâneia do N-NH: na nutrição de 
ruminantes e forragicultura, os métodos utilizados para avaliar a sua 
concentração em fluidos devem fornecer estimativas exatas.
Chaney & Marbach (1962), adaptando os procedimentos de 
Boletter et al. (1961). propuseram método para a avaliação de N-NH 
em tluidos biológicos, o qual é baseado em reação colorimétrica da 
amônia com fenol, formando indofenol. Essa reação é catalisada por 
284 
285 
INCT Ciência Animal 
Mélodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
nitroprussiato de sódio, sendo este método amplamente utilizado em 
avaliações microbiológicas (e.g.. Thomas & Russell, 2004) e produz Método da reação colorimétrica de indofenol catalisada 
estimativas exatas e precisas da concentração de amônia em fluídos (Método N-006/1) 
biológicos (Souza et al., 2013).
Aparatos 
Alternativamente. Fenner (1965) estabeleceu as bases teóricas 
- Tubos de ensaio para avaliação de N-NH3 no líquido ruminal por destilação a vapor, na 
presença de uma solução de hidróxido de potássio. Esta base foi 
- Tubos eppendorf 
Balöes volumétricos de 100 mLe 1000 mL adaptada para a utilização da destilação de Kjeldahl. O método 
- Potes de polietileno resultante foi amplamente utilizado em ensaios de nutrição de 
Pipetasruminantes (e.g., Detmann et al., 2009). Contudo, sua exatidão pode - Agitador (vortex)
ser comprometida por problemas associados à liberação de amônia a Banho-maria 
partir de proteína verdadeira e à recuperação incompleta do N - Espectrofotômetro UV/visível 
amoniacal presente na amostra (Souza et al, 2013). - Centrífuga 
De forma geral, recomenda-se como método padrão a reação Frascos âmbar para armazenamento de soluções 
colorimétrica de indofenol catalisada em função da exatidão das - Capela com exaustão
estimativas. A destilação de Kjeldahl somente deve ser usada como 
alternativa caso o método anterior não possa ser realizado. Contudo os Reagentes 
valores devem ser corrigidos (veja na descrição do método) para que - Fenol cristalizado (ácido fênico, CsH,OH) P.A. 
se tornem similares àqueles produzidos pela reação colorimétrica de - Nitroprussiato de sódio didratado (Na:[Fe(CN)SNO],2H:0) P.A. 
indofenol catalisada (Souza et al., 2013). - Hidróxido de sódio (NaOH) P.A. 
Solução de hipoclorito de sódio (NaCIO) 2,5% P.A. 
- Cloreto de amônia (NH.CI) P.A. 
Ácido tricloroacético (CCl,coOH) P.A. 
286 287
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos 2" Edição 
Soluções Acido trictoroacético ( 100 g/L) 
Solução A4 
Em balão volumétrico de 100 mL contendo, aproximadamente 50 
Em capela. acondicione 50 g de fenol 
cristalizado P.A. e 0,25 g de mL de água destilada, adicione 10 g de ácido 
tricloroacético P.A. 
nitropussiato de sódio P.A. em 
balão de 1000 mL. Complete 
o 
Agite até a solubilização e complete o volume
com água destilada. 
volume com água destilada. Transfira a solução para 
um frasco Transfira para um recipiente adequado e 
mantenha sob refrigeração. 
âmbar e mantenha sob refrigeração. 
Nessas condições, a 
Procedimentos 
durabilidade da soluç�ão é de 60 dias.
Aliquotas para ajuste da curva padrão 
Solução B 1. Pipetar 0, 5, 10, 15, 20 e 25 L da solução padrão para 
tubos de 
- Em balão voumétrico de 1000 mL contendo, aproximadamente, 
500 
ensaio ou tubos eppendorf. 
mL de água destilada, acondicione 25 g de 
hidróxido de sódio P.A. 
e 16,8 mL de solução de hipoclorito de sódio. Agite 
até a dissolução. 2. Adicionar 1,5 mL da solução Ae 1,5 mL da soluç�ão 
B e agite em 
Aguarde resfriar e complete o volume com água 
destilada. Transfira vortex.
a solução para um frasco âmbar e mantenha sob refrigeração. 
Nessas
Preparaç�ão das amostras 
condições, a durabilidade da solução é de 60 dias. 
1. Adicione em tubos de centrífuga 10 mL de amostra de líquido
de 
Solução padrão (estoque) rúmen e l mL da solução de 
ácido tricloroacético (100 g/L). 
- Em balão volumétrico de 100 mL contendo, aproximadamente 
50 Agite em vórtex e deixe em repouso por 30 
minutos em temperatura 
mL de água destilada, adicione 63 mg de NHCI. Agite
até a ambiente. 
solubilização complete o volume com água destilada. 
Transfira 
para um recipiente adequado e mantenha sob refrigeração. 
13O texto aqui se refere a líquido ruminal, mas 
entende-se que os 
procedimentos descritos são totalmente aplicáveis 
a outras matrizes, como, 
por exemplo, "suco" de silagem. 
288 
289 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Ediçao 
3. Centrifugue a 1000 xg por 10 minutos. Separe o sobrenadante em 
potes de polietileno e mantenha sob refrigeraç�o até o momento da Cálculo da concentração de N amoniacal 
análise. 
A solução padrão utilizada para fazer a curva padrão de NH.CI 
4. Pipete de 5 a 25 uL de amostra (i.e., sobrenadante) para tubos de (63 mg/100 mL) possui uma concentração de NH, de, aproximadamente 
ensaio ou tubos eppendorf. Se necessário, a amostra pode ser 20 mg/dL. Assim, com a utilização de alíquotas menores. produzem-se 
diluída para que o valor obtido na absorbância fique entre as leituras os diferentes padrões para composição da curva.
da curva padrão. Assim, para o ajuste da curva padrão, utilize a equação abaixo:
5. Adicione 1,5 mL da solução Ae agite em vortex. B-2Px A 
EP 6. Adicione 1,5 mL da solução Be agite em vortex. 
7. Mantenha as alíquotas referentes à curva padrão e às amostras em em que: B = fator de conversão de absorbância em concentração por 
banho-maria a 39°C por 15 minutos. intermédio da Lei de Lambert-Beer /(mg/dL)]}: P; = concentração de 
NH3 no padrão i (ppm); Aj = absorbância no padrão i. 
8. Ajuste o espectrofotômetro para leitura em comprimento de onda de 
630 nm. E desejável que as leituras (i.e., absorbância) das alíquotas 
referentes as amostras encontrem-se entre aqueles verificadas 
9. Proceda à calibraç�o do equipamento inserindo o "branco (padr�o para os padrões de 4 e 16 mg/dL (veja tabela no exemplo de 
0) e ajustando a absorbância para zero. Proceda à leitura das demais cálculo). Quanto mais próximo à média, maior a confiabilidade da 
soluções padrão. leitura. Leituras no extremo superior (i.e., acima daquelas 
observadas para o padrão 16 mg/dL) possuem baixa10. Insira as soluções oriundas das amostras e obtenha as respectivas confiabilidade. Leituras no extremo inferior (i.e., inferiores 
absorbâncias 
àquelas observadas para o padrão 4 mg/dL), além da baixa
confiabilidade, poder+o sofrer interferências significativas do 
290 291 
INCT Cncia Animal Métodos para Análive de Aiimenters Ediçie 
ruído do cquipamento. A alíquota de líquido 
ruminal usada 
volume de líquidode rimen Ino caso deste procedimento a raz�o seria
efetivamente na análise pode ser ajustada para obtenção 
de 
de (10+1/10 = I.1: e FCO = fator para conversão qufmica da NH:
leituras mais confiáveis. Extrapolações (i.e., leituras acima 
do 
em N-NH1. o que é de. aproximadarnente. 0.824 
limite superior da curva padrão) não sâo toleradas. 
Exemplo de cálculo 
A partir da equaçâão anterior, a concentração de nitrogênio 
- Aliqnota de líquido de rúmen: 10 uL 
amoniacal (N-NHa) nas amostras é dada por: 
-Diluição com ácido na coleta: não houve (i.e.. FD = ) 
AA - Absorbância: 0.372
N-NH3= x FD x FA x FTCA x FCQ 
Volume NH.CI (uL) Equivalente NH: (mg/dL) Absorbancia 
em que: N-NH3 = Concentração de nitrogênio amoniacal (mg/dL); AA 0 0,000 
absorbância da soluç�o relativa à amostra; FD = fator de diluição, 0.267 
considerado somente para os casos de haver diluição prévia da amostra 10 0.577
antes de sua análise., FA = fator alíquota, o qual é dado pela razão 12 0,864 
entre o maior volume de solução de cloreto de amônia utilizado para 20 6 1.033 
produção de padröes (neste caso, segundo os procedimentos aqui 20 396 
adotados, esse valor seria de 25 uL) e o volume da alíquota da amostra
usado na análise; FTCA = fator de correção devido ao uso de ácido a2(P X A) (0 x 0,000) + (20 x 1,396) 
Pi 0++ 202 tricloroacético, o qual é dado pela razão entre o volume de líquido de 
rúmen somado ao volume de solução de ácido tricoloroacético e o 
= 0, 0688 
AA 13.2 Essa diluição específica se resere ao uso connum de ácidos puru lixução
do N amoniacal logo após sua coletü. Por exemplo, caso a alíquota de líquido 
de rúmen seja de 50 ml., à qual é adicionado I mi. de ácido, o FD seria de 
N-NH= FD x FA x FTC.A x FCQ 
(50+1 )/50 = 1,02. 
292 
INCT Cência Animal
Mélodos para Análise de Alimentos 2" Fdição 0,372 x1 x0X 25.(10+) 824 = 12,25 mg/d N-NH3 0,0688
Agite até a complcta solubilização. Aguarde resfriamento até a 
10 
temperatura ambiente e complete o volume com água destilada. Método da destilação em vapor 
Solução de ácido tricloroacético (100 g/L) (Método N-007/2) 
Em balão volumétrico de i100 mL contendo, aproximadamente 50 Algumas modificações foram introduzidas nesse método enm mL de água destilada, adicione 10 g de ácido tricloroacético P.A. 
Agite até a solubilização e complete o volume com água destilada. 
função das modificações adotadas no método N-O01/2.
Transfira para um recipiente adequado e mantenha sob refrigeração. Aparatos 
Solução alcoólica de vermelho de metila (I z/L) 
- Tubos de digestão em borossilicato com orla 
- Em um balão de 100 mL com cerca de 60 mL de álcool etílico anidro
- Tubos de ensaio para centrifugação (20 ou 30 mL) (absoluto) dissolva 0.1 g de vermelho de metila. Complete o volume- Centrifuga 
com etanol e homogenize a solução. 
- Pipetas 
Solução alcoólica de verde de bromocresol (1 g/L) - Potes de polietileno 
- Em um balão de 100 mL com cerca de 60 mL de álcool etílico anidro- Erlenmeyers de 250 mL e 1000 mL 
(absoluto) dissolva 0,1 g de verde de bromocresol. Complete o 
- Destilador por arraste de vapor (destilador de Kjeldahl) 
volume com álcool etílico e homogenize a solução.
- Bureta de 50 mL com graduação de 0,1 mL 
Solução de ácido bórico (20 g/L) 
Soluções - Dissolva em um bal�ão de 1 L (10 L). com cerca de 500 mL (5 L) de 
água destilada, 20 g (200 g) de ácido bórico P.A. Adicione 12.5 ml Solução de hidróxido de potássio (2 M) 
(125 mL) de solução alcoólica de vermelho de metila e 6 mL (60 - Em erlenmeyer de 1000 mL contendo, aproximadamente, 500 mL 
mL) de solução alcoólica de verde de bromocresol. Agite até a de água destilada, adicione 132,02 g de hidróxido de potássio P.A. 
completa solubilização e complete o volume com água destilada. 
295 
294 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
Solução-padrão de ácido clorídrico a 0,005 N (0,49 g/L) 
Dilua 0,414 mL (4.14 mL) de HCI P.A. em balão volumétrico de 5. Em erlenmeyer de 250 mlL. adicione 10 mL de solução de ácido 
1000 mL (10 L). contendo em média 500 mL (5 L) de água destilada. bórico (20 g/AL). Adapte o erlenmeyer ao conjunto de destilação Deixe esfriar, complete o volume com água destilada e homogeneíze para receber a amónia destilada. a solução. Proceda à padronização da solução conforme descrito no 
6. Por intermédio do dosador do destilador de Kjeldahl adicione 10 
método N-001/2. 
ml de solução de hidróxido de potássio (2 M). A razão entre a Procedimentos solução de KOH e a amostra deve ser mantidaem 5:1. 
1. Lave os tubos de digestãoe os tubos de centrífuga e deixe secar enm 7. Destile por arraste, mantendo o terminal do condensador mergulhado estufa nãão ventilada. 
na solução receptora de ácido bórico até que toda a amõnia seja 
liberada. O volume final do destilado deve ser de 100 mL. 2. Adicione em tubos de centrífuga 10 mL de amostra de líquido de 
8. Retire o erlenmeyer, e titule com soluç�o de ácido clorídrico (0.005rúmen e l mL da solução de ácido tricloroacético (100 g/L) 
N) até a viragem do indicador (verde para rosa claro). A cada Agite em vórtex e deixe em repouso por 30 minutos em temperatura 
bateria de destilação destile ao menos dois tubos em "branco" ambiente. 
contendo 2 mL de água destilada. 
3. Centrifugue a 1000 x g por 10 minutos. Separe o sobrenadante em 
Cálculo da concentração de N-NH3 potes de polietileno e mantenha sob refrigeração até o momento da 
análise. 
xFTCAXFDD 
N-NH(k)=5x0,005xfx14x100 
4. Pipete 2 mL de amostra (i.e., sobrenadante) para tubos de digestão 
e acople no destilador de Kjeldahl. em que: N-NH:(K) = concentração de nitrogênio amoniacal obtida pela 
destilação de Kjeldahl (mg/dL); V = volume de ácido clorídrico 13O texto aqui se refere a líquido ruminal, mas entende-se que os 
procedimentos descritos são totalmente aplicáveis a outras matrizes, como, 
por exemplo, "suco" de silagem. 
utilizado na destilação (mL): B = volume de ácido clorídrico utilizado 
291 296 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos-2 Fdicin na destilação do "braneo*": f = fator de começão da concentração de 
N-NH,(k)|-[N-NH,(d) N-NH,(k)|-2,11 
ácido cloridrico obtida com uma solução de Na,CO: (0.005 N; ver 
N-NH,(C)= 
R 0,83 
detalhes no Capítulo 4): 14 = peso atômieo do nitrogênio; A = volume
da alíquota (mL): FTCA = fator de correção devido ao uso de ácido
em que: N-NH(C) = concentração de nitrogênio amoniacal corrigida tricloroacético. o qual é dado pela razão entre o volume de líquido de (mg/dL): N-NH:(k) = concentração de nitrogènio amoniacal obtidarúmen somado ao volume de solução de ácido tricloroacético e o 
com a destilação de Kjeldahl (mg/dL): N-NH(d) = nitrogènio volume de líquido de rúmen [no caso deste procedimento a razão seria amoniacal produzido a partir da deaminação de proteina verdadeira de (10+1)/10 = 1,1]; e FD = fator de diluição, considerado somente (mg/dL): e R = recuperação de nitrogènio amoniacal elo método da 
para os casos de haver diluição prévia da amostra antes de sua destilação de Kjeldahl. 
análise154 
Literatura Citada
BOLLETER, W.T.: BUSHMAN,C.J.. TIDWELL. P.W. Spectrophotometrie determination of ammonia as indophenol. Analitycal Chemistry, v.33, 
p.592-594, 1961. 
Ajuste da concentração de N-NH3 
A concentração de nitrogênio amoniacal estimada por 
CHANEY, A.L.; MARBACH. E.P. Moditied reagents tor determination of 
urea and ammonia.Clinical Chemistry. v.3. p. 130-132, 1962.
intermédio do método da destilação de Kjeldahl apresenta viés 
DETMANN, E.: PAULINO, M.E.: MANTOVANI. H.C.: VALADARES 
FILHO, S.C.: SAMPAIO, C.B. SOUZA, M.A.: LAZZARINl, I.; 
DETMANN, K.S.C. Parameterization of ruminal tibre degradation in 
low-quality tropical torage using Michaelis-Menten kineties. Livestock 
Science, v.126. p. l36-146, 2009.
causado pela deaminação de proteína verdadeira e por propiciar 
recuperação incompleta da amônia presente n0 meio. Assim, os 
valores obtidos por este método devem ser corrigidos para que se 
FENNER, H. Method for determiningtotal volatile bases in rumen fluid by 
steam distillation. Journal of Dairy Science, v.48. p.249-251, 1965. 
amplie sua exatidão. Essa correção é dada pela equação (Souza et al., 
2013): 
SANTOS, R.D.; PEREIRA, L.G.T.: NEVES, A.L.A.; ARAUJO, G.G.L.: 
VOLTOLINI, T.V.; BRANDÃO, L.G.N.; ARAGÃ0, A.S.L.; DÓREA. 
J.R.R. Caracteristicas de termentação da silagem de seis variedades de 
milho indicadas pra a região semiárida brasileira Arquivo Brasileiro de 
Medicina Veterinária e Zooteenia, v.62, p.1423-1429, 2010.
19 Essa diluição específica se refere ao uso comum de ácidos para fixação do N amoniacal logo após sua coleta. Por exemplo, caso a alíquota de líquidode rúmen seja de 50 mL, à qual é adicionado I mL de ácido, o FD seria de (50+1)/50 = 1,02. 
299 298 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição RUSSELL, J.B. Rumen microbiology and its role in ruminant nutrition. 
Ithaca: James B. Russell, 2002. 119p. 
Capítulo 16 sOUZA.N.K.P.; DETMANN. E.: VALADARES FILHO, S.C.: COSTA, 
V.A.C.: PINA, D.S.: GOMES, D.I.: QUEIROZ, A.C.: MANToVANI. 
HC. Accuracy of the estimates of ammonia concentration in umen fluid 
using different analytical methods. Arquivo Brasileiro de Medicina 
Veterinária e Zootecnia. v.65, p. 1752-1758, 2013. 
Titânio
Definiçoes básicas
THOMAS. S; RUSSELL. J.B. The effect of cellobiose. glucose, and cellulose 
on the survival of Fibrobacter succinogenes A3C cultures grown under 
ammonia linmitation. Current Microbiology, v.48, p.219-223, 2004. 
Como ressaltado no Capítulo 14, vários elementos químicos, 
seja na forma de óxido ou de sal, podem ser usados como indicadores 
externos em ensaios de digestão com ruminantes. Entre estes, 
destacam-se: itérbio, érbio, európio, cádmio, cobalto. lantânio. ouro.
cério, titânio e cromo. Este último elemento, notadamente sob a forma
de sesquióxido de cromo ou óxido crômico (Cr:03). é o indicador 
externo mais utilizado para a quantificaç�o da excreção fecal de 
bovinos em confinamento ou a pasto. Tal peculiaridade se deve ao fato 
do óxido crômico ser facilmente adicionado à dieta, ser facilmente 
analisado e apresentar baixo custo (Detmann et al. 2004). 
Contudo, cíticas têm sido dirigidas ao uso do óxido crômico
como indicador devido aos seus potenciais efeitos carcinogênicos 
(Mayers et al., 2004), o que, associado ao fato da demanda por técnicas 
onerosas de quantificação (i.e., espectrofotometria de absorção 
atômica), pode demandar sua substituição como indicador externo em 
ensaios de digestão com animais. 
O dióxido de titânio (TiO%) constitui alternativa direta ao uso 
do óxido crômico, uma vez que permite contornar as restrições acima 
301 
300 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
descritas. Esse composto tem sido legalmente 
adicionado en 
Balöes volumétricos de 50, 100 e 1000 mL 
alimentos. muitas vezes como corante (Titgemeyer 
et al., 2001), c 
Funis raiados 
possui processo de quantiticação 
calcado em espectrofotometria 
Potes de polietileno 
convencional. de menor custo e maior
acessibilidade. 
Espectofotômetro UV/visível 
Varios autores têm demonstrado a efetividade 
do dióxido de 
Frasco Erlenmeyer de 2000 mL 
titânio como indicador externo em ensaios de consumo
e digestão com 
Pipetas 
bovinos (Titgemeyer et al., 2001: Ferreira et al., 2009), ovinos (Myers - Bicos de papagaio (20 mL) com reservatório 
et al.. 2006). suínos (Jagger et al., 1992) e aves (Short et al., 1996). 
Reagentes Estudos conduzidos no Brasil demonstram que dióxido de titânio e 
óxido crômico possuem recuperação e padrão de excreção similares - Ácido sulfúrico (H:SO.) concentrado P.A. 
em ensaios com ruminantes (Sampaio et al., 2011a; 2011b). Acido cloridrico (HC) 37% P.A. 
O método aqui descrito baseia-se na digestão sulfúrica da Sulfato de sódio (Na»SO,) P.A. 
amostra. sendo adaptado dos procedimentos inicialmente descritos por Sulfato de cobre pentahidratado (CusO. 5H:0) P.A. 
Short et al. (1996), Myers et al. (2004) e Titgemeyer et al. (2001). Peróxido de hidrogênio (H:0) 30% v/w P.A. 
Digestão sulfúrica Soluçoes 
(Método M-007/2) Solução de ácido cloridrico (200 mL/L) 
Aparatos
- Em um balão de 1000 mL com cerca de 200 mL de água destilada. 
dissolva 200 ml de ácido clorídrico P.A.. Complete o volume com 
- Balança analítica com precis�o de 0,0001l g 
água destilada e homogeneize a solução.
- Tubos de digestão macro em borossilicato com orla 
- Bloco digestor para tubos macro
- Capela com exaustão
- Papel filtro quantitativo, livre de cinzas e de filtração rápida
303 302 
INCT Cíência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
Solução de ácido nítrico (100 mLA) Esses tubos passarão por toda as etapas analíticas descritas 
abaixo. 
Em um balão de 1000 mL com cerca de 200 mL 
de água destilada, 
Importante: o dióxido de titânio usado para a preparação 
dos 
dissolva 100 mL de ácido nítrico P.A. Complete o volume com água padroes deve ser oriundo de alíquotas do 
indicador usado 
destilada e homogeneíze a solução. durante o ensaio de consumo/digestão. 
Mistura digestora (catalítica) 
Procedimentos: 
- Em separado, peneire (peneira com porosidade de I mm) o 
sulfato 
1. Use balança analítica aferida pelo INMETRO, com precis�o 
de 0.0001
de sódio P.A. e o sulfato de cobre pentahidratado P.A. Em um pote 
g, sobre bancada especial de laboratório 
e em ambiente climatizado 
de polietileno adicione o sal (sulfato de sódio) e o catalizador 
(20-25°C ou de acordo com as especificações do fabricante). Ligue
a 
metálico (sulfato de cobre) na proporção de 20 para 1, 
balança e aguarde 30 minutos para sua estabilização. respectivamente (i.e., para cada 1000 g de sulfato de sódio use 50 g 
de sulfato de cobre). Misture até a completa homogeneização. O 2. Lave toda a vidraria exclusiva para minerais, usando solução de 
material deve ser armazenado em pote com tampa. ácido clorídrico ou solução de ácido nítric0, em seguida, enxágue 
bem com água destilada. Ver detalhes no Capítulo 12. 
Padröes 
Em tubos de digestão pese 0, 2, 4,6, 8 e 10 mg de dióxido de titânio. 3. Pese, aproximadamente, 500 mg de amostra seca ao ar e coloque no 
Como as quantidades a serem pesadas são muito pequenas, tubo de digestão macro devidamente identificado. 
recomenda-se a utilização de pequenos pedaços de papel de filtro 
ashless para a pesagemeque o conjunto (papel mais amostra) seja 
4. Adicione, aproximadamente, 5 g de mistura digestora e 20 mL de 
ácido sulfúrico concentrado. 
transferido para os tubos de digestão. Este procedimento visa evitar 
perdas de amostra durante a transferência que ocorreriam se a 5. Em capela, acondicione os tubos em bloco digestor e aqueça
amostra fosse pesada em um recipiente e transferida parao tubo de lentamente à temperatura de 400°C. Mantenha aquecido até atingir
ensaio. A tolerância na pesagem deve ser de +0,2 mg. Contudo, no coloração esverdeadae translúcida. 
cálculo das concentrações, o valor real pesado deve ser utilizado. 
304 305 
INCT Ciencia Animal
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
6. Retire os tubos e os deixe esfriar
na capela. 13. Proceda à leitura em espectrofotômetro ajustado para 
o 
comprimento de onda de 410 nm. Imediatamente 
antes da leitura,
7. Adicione lentamente 10 mL de peróxido 
de hidrogênio 30% P.A. e 
com o auxílio de pipeta Pasteur, adicione 3 gotas de peróxido de 
aguarde resfriar. 
hidrogênio 30% P.A. à solução contida no frasco 
e agite. 
8. Proceda à transferência quantitativa do 
material para balão
Utilize funis e papel de filtro 14. Proceda à calibração 
do equipamento inserindo o padrão 0 mg e 
volumétrico de 50 ou 100 mL. 
ajustando a absorbâância para zero. Proceda à 
leitura das demais 
quantitativo, livre de cinzas e de filtração rápida. O 
volume do bal�ão 
soluções padrão.
a ser utilizado irá depender da concentração de dióxido de 
titânio 
na amostra. Contudo, todos os padrões e alíquotas em uma mesma 
15. Proceda à leitura das soluções produzidascom as amostras. 
bateria devem ser transferidos para balões de mesmo volume. 
Ao contrário do cromo, não há necessidade de ajuste para 
9. Complete o volume do bal�o com água destilada ou 
a concentração de titânio no dióxido por duas razões. Primeiro, 
desmineralizada. 
porque estima-se a concentração do composto (dióxido) e não do 
10. Cubra o balão com tampa ou para-filme e homogeneíze a solução. elemento (titânio). Segundo, porque o próprio composto usado no 
ensaio de digestão é usado como padrão.
11. Transfira uma alíquota para potes de polietileno devidamente 
limpos. Realize a lavagem do frasco no momento da transferência Cálculo da concentração de titânio 
com um pouco da solução mineral de cromo. Adicione cerca de 5 
a 10 mL da solução no frasco, tampe e agite. Descarte este material Utilize sequencialmente as equações abaixo 
e então acondicione a solução a ser armazenada. 
B 2Px A) 
EP 12. Armazene a solução em geladeira (4°C) até o momento da leitura.
306 307 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos -2" Ediç�o 
A 
(TiO2)A
A 
Proceda à correção da concentração para a umidade residual: 
Ti02 ASA 100 
[TiO2lMs %ASE * 0 
(Ti02Ax 100 [Ti02lasA ASA 
em que: [TIO:]Ms = concentração de TiO; 
com base na matéria seca 
(%); %ASE = percentual de "amostra seca em estufa". 
em que: B = fator de conversão de 
absorbância em massa de Ti02 
oriunda da amostra por intermédio da Lei de 
Lambert-Beer (/mg); Pi 
Exemplo de cálculo em uma amostrafecal1
= valor de TiO^ no padrão i (mg); Aj = absorbância no padrão i; 
(TiO2)A = massa de Ti0; oriunda da amostra (mg); 
AA = absorbância 
- Alíquota fecal (amostra seca ao ar): 500,2 mg.
para a amostra; [Ti02Jasa 
= concentração de TiO2 com base 
na 
- %ASE: 91,80%. 
amostra seca ao ar (o); e ASA = massa de amostra seca ao 
ar (mg). 
- Absorbância da solução de leitura: 0,413 
E desejável que (TiO2)A esteja entre 2 e8 mg. Quanto
mais 
Padrão (mg) Quantidade real (mg) Absorbancia 
próximo à média, maior a confiabilidade da leitura. 
Leituras no 
0,0000 
extremo superior (8-10 mg) possuem baixa confiabilidade. 0,167 2.2 
Leituras no extremo inferior (0-2 mg), além da baixa 
0,330 4,1 
confiabilidade, poderäo sofrer interferências significativas do 6 5,9 0,499 
ruído do equipamento. A (TiOz)A pode ser ajustada pelo analista 0.6788 8,1 
variando-se a alíquota de amostraeo volume do balão utilizados. 
10 10,2 0,836 
Extrapolações (Ge, (TiO)A > 10 mg) não s�ão toleradas. 
PKxA0x 0, 000)+...+(10,2 x 0,836) =0,0826 
2P (0)+.+(10,2)2 
309 308 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos 2" Edição 
SAMPAIO, C.B.; DETMANN, E.: VALENTE. T.N. P.: SOUZA, M.A.: 
VALADARES FILHO, S.C.; PAULINO, M.F. Evaluation of 
fecal 
recovering and long term bias of internal and 
external markers in a 
digestion assay with cattle. Revista Brasileira de 
Zootecnia, v.40, p. 174- 
182, 2011a.
(TiO),=AA 0,413 
(TiO2)A 0,0826 =5,00 mg 
SAMPAIO, C.B.; DETMANN, E.; VALENTE, T.N.P.;
COSTA, V.A.C.
VALADARES FILHO, S.C.; QUEIROZ, A.C. Fecal excretion patterns 
and short term bias of internal and external markers in 
a digestion assay 
with cattle. Revista Brasileira de Zootecnia, v.40, p.657-665, 
201lb. 
(Ti02)A x 100 500,2 
5,00 x 100= 1,00% 
ITiO2lASA ASA 
TiOzlAsAx 10091,80 SHORT, F.J.; GORTON, P. 
WISEMAN, J.; BOORMAN, K.N. 
, 00 
X 100 = 1,09% 
(TiO2]Ms Determination of titanium 
dioxide added as na inert marker in Chicken 
digestibility studies. Animal Feed Science and Technology, 
v.59, p.215- 
221, 1996. 
%ASE 
E.C.; ARMENDARIZ, C . BINDEL. D.J.: TITGEMEYER, 
GREENWOOD, R.H.; LOEST, C.A. Evaluation of titanium 
dioxide as a 
digestibility marker for cattle. Journal of Animal Science, v.79. p. 
1059-
1063, 2001.
Literatura Citada
DETMANN, E; VALADARES FILHO, S.C.; PAULINO, M.F; 
ZERVOUDAKIS, J.T.; CABRAL, L.S. Avaliação da técnica dos 
indicadores na estimação do consumo por ruminantes em pastejo. 
Cadernos Técnicos de Veterinária e Zootecnia, v.46, p.40-57, 2004. 
FERREIRA, M.A.; VALADARES FILHO, S.C.; COSTA e SILVA, L.F.;
NASCIMENTO, F.B.; DETMANN, E.; VALADARES, R.F.D. 
Avaliação de indicadores emn estudos com ruminantes: estimativa de 
consumos de concentrado e de silagem de milho por vacas em lactação. 
Revista Brasileira de Zootecnia, v.38, p.1574-1580, 2009. 
JAGGER, S.; WISEMAN, J.; COLE, D.J.A., CRAIGON, J. Evaluation of 
inert markers for the determination of ileal and faecal apparent 
digestibility values in the pig. British Journal of Nutrition, v.68, p. 729- 
739, 1992. 
MYERS, W.D.; LUDDEN, P.A.; NAYIGIHUGU, V.; HESS, B.W. A 
procedure for the preparation and quantitative analysis of samples for 
titanium dioxide. Journal of Animal Science, v.82, p. 179-183, 2004. 
MYERS, W.D.; LUDDEN, P.A.; NAYIGIHUGU, V.; HESS, B.w. 
Excretion of titanium dioxide and chromic oxide in duodenal digesta and 
feces of ewes. Small Ruminantion Research, v.63, p.135-214, 2006. 311 310 
INCT Ciencia Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
Capítulo 17 
Digestibilidade in vitro da matéria
seca para 
ruminantes 
Definições básicas 
Inicialmente, ensaios de digestão in vitro 
foram propostos 
para se estimar a digestibilidade 
in vivo de forragens (Tilley & Terry
1963). Contudo, atualmente, a amplitude 
de aplicação desse tipo de 
método mostra-se mais ampla, incluindo, principalmente, triagem,
discriminação ou comparaç�ão direta de 
alimentos ou dietas para 
animais ruminantes (Silva et al., 2017).
Os métodos in vitro para avaliação de alimentos/dietas para 
ruminantes são categorizados como métodos do tipo I de acordo comn 
o Codex Alimentarius. Logo, os métodos permitem acessar um 
determinado valor que é definido pelo método em si (Codex 
Alimentarius Commission, 2018). Uma vez que não existem padrões
Ou referências primárias para este tipo de método, esses não podem ser 
validados quanto a sua exatidão, ou seja, quanto à sua capacidade de 
produzir resultados convergentes ao "valor real" para a entidade
analítica em questão. Assim,, para se minimizar erros sistemáticos 
entre laboratórios, os métodos ditos empíricos (i.e., métodos tipo D 
312 313 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
INCT Ciência Animal 
Dessa forma, o método aqui proposto foi construído com base 
devem ser seguidos exatamente como 
descrito nos protocolos padrões, 
em diversos trabalhos (Machado et al., 2016; Silva et al., 2017: 
Camacho, 
pois, mesmo a menor variação
nos procedimentos pode 
acarretar na 
2017; Camacho et al., 2019; Camacho, 2021), alguns
destes envolvendo 
mensuração de uma entidade
analítica distinta da originalmente 
proposta (Mertens, 2003). diversas instituições, de forma 
a fomentar um método padrão entre os 
A digestibilidade in vitro pode ser afetada por 
diversas5 diferentes laboratórios de instituições brasileiras. Este 
método foi 
características do método, como instrumental, tipos de recipientes 
e devidamente validado quando à repetibilidade e reprodutibilidade por 
filter bags, soluções tampão, tipo de gás no headspace, 
trabalho do Camacho (2021). O uso de incubadoras artificiais, com avaliação 
coletiva
analista, fontes de inóculo, adaptação dos animais doadores, moagem de filter bags no mesmo ambiente, 
a despeito das críticas quanto às 
da amostra, entre outros (Mould et al., 2005; Hall & Mertens, 2008; estimativas obtidas (Camacho, 2017), 
foi fomentado devido à facilidade 
Patra & Yu, 2013; Silva et al., 2017; Camacho et al., 2019; Castro- de uso e aquisição dos equipamentos. 
Montoya & Dickhoefer, 2019). Assim, qualquer mudança no número 
Digestibilidade in vitro da matéria seca usando incubadoras de etapas ou em qualquer parâmetro físico-químico da anáise
resultará em métodos diferentes, os quais não podem ser diretamente 
artificiais (modelos Daisy" Ankom, TE-150 Tecnal ou similares) 
(Método G-008/1)
comparados. 
Considerando esses aspectos, um método nacional que Aparatos 
permita comparar a digestibilidade in vitrode alimentos/dietas de 
- Balança analítica com precis�o de 0,0001 g 
ruminantes e que produza resultados reprodutíveis era ainda 
Estufa com circulaç�o forçada dee ar 
inexistente. Esse tipo de proposição permitiria a minimização da 
Estufa sem circulação forçada de ar 
variação entre laboratórios e, em um estádio futuro, permitiria a 
- Filter bags de tecido não tecido (100 g/m2; 4 x 4,5 cm) ou F57 
combinação de resultados a partir de uma visão mais ampla e robusta 
(Ankom®) 
entre instituições de forma a construir equações para predizer o - Seladora 
comportamento in vivo de forma acuradae precisa. - Dessecador 
- Incubadora artificial 
314 315 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
Cilindro de CO Soluções
Tecido gaze 
Solução tampão
- Erlenmeyers 
- Em balão volumétrico de 1L (10 L) contendo 0,1 L (1 L) de água 
- Baloes volumétricos 
destilada, adicione 9,80 g (98 g) de NaHCOs, 3,71 g (37.1 g) de 
- Liquidificador 
Na2HPO4 anidro ou 4,65 g (46.5 g) de NazHPO; diidratado ou 7,00 
- Garrafas térmicas 
g (70,0 g) de NazHPOs heptaidratado, 0,57 g (5,7 g) de KCl; 0,47 g 
Potenciómetro digital
4,7 g) de NaC1; 0,12 g (1,2 g) de MgSOa heptaidratado e 0,05 g (0,5 
- Animal doador de inóculo 
g) de CaClh diidratado. Agite para dissolução parcial. Adicione 0,8 
Lavadora tipo "tanquinho 
L (8 L) de água destilada e agite até a completa solubilização. 
- Panela de alumínio 
Complete o volume do balão para 1 L (10 L). Este procedimento 
- Bandejas de alumínio 
deve ser realizado, preferencialmente, 24 horas antes da incubação. 
- Fogão ou fogareiro 
Solução de ureia 
Reagentes - Adicione 5,5 g de ureia em balão volumétrico de 100 ml. 
- Bicarbonato de sódio (NaHCOs) P.A. Acrescente, aproximadamente, 70 mL de água destilada e 
- Fosfato de sódio dibásico (NazHPO4) P.A. anidro, diidratado ou homogeneíze até completa solubilização. Após a estabilização da 
heptaidratado temperatura com o ambiente, complete o volume. A solução deve ser 
Cloreto de potássio (KCI) P.A. armazenada sob refrigeração até o momento da utilização. 
- Cloreto de sódio (NaCI) P.A. 
Solução de detergente neutro comercial (20 mL/L) 
- Sulfato de magnésio (MgSO.) heptaidratado P.A. 
- Em Erlenmeyer de 4 L, adicione 1 L de água destilada e 80 mL de 
- Cloreto de cálcio (CaClh) diidratado P.A. 
detergente neutro comercial. Agite até a completa homogeneizaç�o 
Ureia P.A. 
e complete o volume com água destilada. 
- Detergente neutro comercial 
316 317 
Métodos para Análise de Alimentos 2" Ediçio 
INCT Ciência Animal 
6. Acondicione os filter hags em dessecador (máximo de 20 unidades por 
Procedimentos 
procedimento) e aguarde o equilibrio com a temperatura 
ambiente. 
Em todos os procedimentos, 
use balança analítica 
aferida pelo 
INMETRO, com precisão de 0.0001 g, 
sobre bancada especial 
de 
7. Pesc os filter bags e registre o peso. Esse será o peso 
da tara.
laboratório e em ambiente 
climatizado (20-25°C ou de 
acordo com as 
8. Pese aproximadamente 500 mg de amostra seca ao ar processada 
em 
especificações do fabricante). Ligue 
a balança e aguarde 30 
minutos
porosidade de I mm. registre o peso e 
acondicione no interior do filter
para sua estabilizaç�ão. 
bag 
Preparação dos filter bags 9. Sele os filter bags usando seladora
e os reserve para posterior incubação. 
1. Identifique os filter bags com marcador permanente. 10. Para cada jarro 
da incubadora faz-se necessário o uso de. ao menos 
dois filter bags selados em "branco" (i.e.., 
sem amostra) 
2. Acondicione os filter bags em panela de alumínio
e adicione a solução 
de detergente neutro comercial em volume 
suficiente para cobrir todo o 
Preparação da solução tampão 
material. 
1. Adicione a solução tampão em trasco Erlenmeyr em volume
3. Leve o recipiente ao fogão ou fogareiro e aqueça. A solução 
deve 
suficiente para a realização dos procedimentos. 
ser mantida em ebulição por 15 minutos. 
2. Adicione a solução de ureia à solução de McDougall na proporção 
4. Lave os filter bags com água corrente até a total retirada do 
de 5 mL/300 mL. Esta adição é considerada opcional, uma vez 
detergente. 
que o uso da ureia pode reduzir o poder de discriminação entre
5. Seque os filter bags em bandejas (camada delgada sem amostras (ver detalhes em Camacho et al., 2019). Portanto,a 
sobreposição) sequencialmente em estufa com circulação forçada decisão de adicionar ou não ureia à solução tampão é o único 
de ar a 55°C por 24 horas e em estufa não ventilada a 105°C por 2 passo neste método que depende da decisão do analista. 
horas.
319 
318
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos -2" Ediçio 
3. Acople uma mangueira de 
silicone ao cilindro de CO;. mineral deve ser realizada ad libitum, mantendo-se também água 
disponível em abundância. A prática de aplicação de jejum ao animal 
4. Introduza a extremidade livre 
da mangueira na solução tampão 
e 
anteriormente à coleta não deve ser realizada. 
libere o C0: propiciando borbulhamento. 
5. Com o potenciómetro digital, monitore o pH 
da solução. O 
1. Acione previamente o aquecimento da incubadora (39°C) contendo 
borbulhamento com CO: é encerrado quando o pH atingir o valor os jarros vazios em seu interior. 
de 6.8. 
2. Abra a cânula ruminal e colete porções das partes sólida e líquida 
6. Com o uso de estufa ou sala climatizada, aclimatize 
a solução da digesta em diferentes pontos do númen e armazene-as 
em 
tampão para a temperatura de 39°C. garrafas térmicas previamente aquecidas (39° C). 
7. Este procedimento deve ser realizado anteriormente à coleta 
do 
3. Conduza o material imediatamente ao laboratóri1o. 
inóculo ruminal.
homogeneize digesta por,a 4. Usando liquidificador. 
aproximadamente, 30 segundos. 
Coleta e processamento do inóculo ruminal
5. Em frasco Erlenmeyer, filtre a digesta homogeneizada através de 
O inóculo pode ser coletado de um bovino fistulado, sendo,
quatro camadas de gaze. Descarte o material retido na gaze. 
contudo, recomendada a produç�ão de inóculo a partir de pool de 
digesta ruminal obtida de três ou mais animais. Adicionalmente, o(6) 6. Mantenhao filtrado (i.e., inóculo) climatizado (39°C) com o uso de 
animalis) doador(es) deve(m) ser adaptados à dieta basal por, no garrafas térmicas, estufa ou sala climatizada 
mínimo, 14 dias antes da coleta de inóculo. 
7. Este procedimento deve ser realizado imediatamente antes do início 
A dieta basal deve ser formada por volumoso e concentrado 
da incubação 
na proporção de 80:20, com base da matéria seca, e conter 12% de 
proteina bruta, também com base na matéria seca. A suplementação 
321 320 
INCT Ciência Anima Métodos para Análise de Alimentos 2" Edição 
Procedimento de incubação . Acondicione os filter bags em lavadora tipo "tanquinho". 
Encha-a 
com água limpa e. usando regulagem para "lavagem 
delicada". 
1. Retire os jarros previamente aquecidos da 
incubadora e acondicione 
acione a lavadora por I minuto. Drene a água após a lavagem.
Este 
em seu interior os filter bags. Recomenda-se que cada jarro opere 
com 
procedimento deve ser realizado por, no 
mínimo, trës vezes. 
20-25 filter bags contendo amostras e dois filter bags 
em branco.
9. Após os ciclos de lavagem. pressione gentilmente 
os filter bags para 
2. Adicione a cada jarro 400 mL do inóculo e 1600 mL 
da solução 
retirada do excesso de água (que deve estar limpida). 
tampão com o pH devidamente ajustado. 
10. Seque os filter bags em bandejas (camada delgada 
sem sobreposiç�io) 
3. De forma rápida, faça um flushing com CO% no headspace de 
cada 
sequencialmente em estufa com circulação forçada
de ar a 55°C por 
jarro de forma a substituir o ar atmosférico por dióxido
de carbono.
24 horas e em estufa não ventilada a 
105°C por 16 horas. 
Tampe os jarros imediatamente. 
11. Acondicione os filter bags em dessecador (máximo 
de 20 unidades 
4. Acondicione os jarros na incubadora, inicie o mecanismo de rotação por procedimento) e aguarde o equilibriocom a temperatura 
e feche a porta. Assegure-se de que o aquecimento esteja ambiente. 
devidamente ligado e regulado a 39°C 
12. Pese os filter bags e registre o peso. 
5. Mantenha os jarrOS sob as condições de temperatura e rotação porr 
48 horas. Cheque estas condições regularmente durante todo o Cálculo da digestibilidade in vitro da 
matéria seca 
processo de incubação. 
Inicialmente, caleule o resíduo obtido com 
os filter bags em 
6. Após 48 horas, abra a incubadora e retire os filter bags. branco: 
7. Lave-os superficialmente com água limpa e pressione-os 
B FgT 
gentilmente para retirada de gases.
323 
322 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de 
Alimentos-2" Ediçã 
em que: B 
= contaminação 
decorrente do procedimento 
de incubação 
CIn quc: Uasa 
= indigestibilidade com 
base na amostra seca 
ao ar 
(g de matéria 
seca): Fs = peso do filter bag 
em branco após incubação (h): ASA = massa de amostra 
seca ao ar (g): Uus = indigestibilidade 
(g): e T=tara ou peso do filter bag 
pré-incubação (g). com basc na matéria seca 
(%):DIVMS = digestibilidade 
in vitro da 
O valor do "branco" a 
ser usado nos demais 
cálculos deve ser matéria seca (%); e %ASE 
= percentual de "amostra 
seca em estufa. 
obtido pela média da contaminação 
obtida nos filter bags em 
branco
Os demais termos foram previamente 
detinidos. 
avaliados no estudo. Torna-se
importante ressaltar que 
a contaminação 
Na exposição dos 
resultados é obrigatório reportar 
as 
é inerente a cada procedimento 
de incubação. Logo, brancos 
são 
requeridos a cada procedimento, 
não sendo possível o uso de 
"médias'" seguintes informações: 
1. marca e modelo da 
incubadora artificial. 
obtidas em outros procedimentos. 
2. tipo defilter bag utilizado, 
e 3. adição ou não de ureia à solução 
de 
Calcule o resíduo aparentemente 
não digerido (sem correção
tampão. Esses três 
fatores afetarão as 
estimativas 
digestibilidade e seu 
conhecimento é crucial para interpretação 
e 
para o branco): 
avaliação comparativa de 
resultados de diferentes ensaios. 
U=FA-T 
em que: U = resíduo aparentemente 
não digerido (g de matéria seca); 
Exemplo de cálculo 
FA= peso do filter bag contendo a amostra após 
incubação (g); e T = - Amostra (amostra seca ao ar): 0.5129 g. 
tara ou peso do filter bag pré-incubação (g). %ASE: 91,809%. 
Calcule da digestibilidade in vitro da matéria seca: - Peso do filter bag (tara): 0,41900g 
Peso do filter bag+ resíduo: 0.6242 g8 
U-B x100 6UASAASAJ** Média da contaminação (branco): 0,0023 
%U ASAx100 
6UMs%ASE 
U=FA-T=0,6242-0,4190=0,2052 g 
%DIVMS=100-6UMs 
324 
325 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos 2" Ediçio 
MACHADO, M. G.; DETMANN,. E.: MANTOVANI. H. C.: VALADARES 
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6UASA= 
U-B x100(0,2052-0,0023 ]]x100=39,56% 96U ASAASA 0,5129 
39,56 %U ASA 10091,80 
6UMs0%ASE 
x100 x100=43,09% 
MERTENS, D.R. Challenges in measuring insoluble dietary fiber. Journal
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MOULD, F.L.; KLIEM, K.E.; MORGAN, R.: MAURICIO, R.M. In 
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%DIVMS=100-%UMs = 100 43, 09 = 56, 91% 
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Zootecnia). Viçosa: Universidade Federal de Viçosa, 2017.
CAMACH0, L.F. Development of a Brazilian standard procedure for in 
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Zootecnina). Viçosa: Universidade Federal de Viçosa, 2021 
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E.0.S.: 
PALMA, M.N.N.; VALADARES FILHO, S.C. Comparação de métodos 
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CAMACHO, LF.; SILVA, T.E.; PALMA M.N.N.; ASSUNÇÃO, A.S.; 
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307, 2008. 
327 
326 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos- 2" Edição 
Capítulo 18 
Protocolos para condução de ensaios de 
degradação in situ em ruminantes 
Definições básicas
A digestibilidade constitui a principal característica 
na 
definição do valor nutritivo dos alimentos (Huhtanen 
et al., 2006). Sua 
quantificação pode ser realizada por métodos 
in vivo, in vitro e in situ. 
Entre estes, o método in vivo é 
considerado padrão. Contudo. sua 
aplicação demanda grande número de 
animais e requer grande
quantidade de alimentos para fornecer aos 
mesmos (Harmon & 
Richards, 1997). Além disso, procedimentos adicionais exigidos 
no 
método in vivo, como coletas fecais, tornam o método mais oneroso
e 
laborioso. Estas características fomentam a utilização de outros 
métodos, como os métodos in situ e in vitro.
Os métodos in vitro aplicados a animais ruminantes têm por 
objetivo simular as condições fisicas, químicas e microbiológicas do 
rúmen, relacionando-se com precisão com a digestibilidade in vivo 
(Huhtanen et al., 1994). Contudo, a desvantagem primária dos 
métodos in vitro é a sua franca diferença em relação ao ambiente in 
vivo (Mertens, 2005). 
328 
329 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos 2" Ldiçi
Por sua vez. os métodos in situ 
são amplamente utilizados para Nesse sentido, o objetivo deste Capítulo foi definir orientações 
a avaliação de características da 
cinética de degradação runminal (i.e., básicas para protocolos de incuhações in site visando 
à avaliação do pertil
extensão e taxa de degradação: Mertens. 2005).
Estes vêm sendo 
de degradação de alimentos em ruminantes. A adoção 
desses protocolos 
considerados como referência para a avaliação da degradaç�ão 
de 
podc constituir ferramenta útil para 
se contornar as dificuldades 
alimentos ou componentes dos alimentos em 
diferentes sistemas 
destacadas no parágrafo anterior. As recomendações aqui 
estabelecidas 
nutricionais (AFRC. 1993: NRC, 2001; Valadares Filho et al., 2016). foram construídas a partir de informações apresentadas por Nocek (1988). 
Contudo, as características da cinética de degradação 
ruminal
Michalet-Doreau & Ould-Bah (1992). Madsen & Hvelplund (1994). 
obtidas por métodos in situ também sofrem 
diversas influências Vanzant et al. (1998). Hvelplund & Weisbjerg (2000). NRC 
(2001). 
advindas de modificações nas diferenças etapas e características que Mertens (2005), Ákerlindet al. (2011). Valente et al. (201). Machadoet 
compõemo protocolo aplicado em determinadacondição, destacand0- al., (2013), Valente te al. (2015). Machado et al. 
(2016), Assunção (2017) 
se: granulometria da amostra, porosidade e material dos sacos, relação e Menezes et al. (2017).
amostra:superfície dos sacos, tempos de incubação empregados, 
protocolos de lavagem dos sacos, dieta dos animais, número de 
Protocolos para condução de ensaios de degradação in situ para 
ruminantes 
animais utilizados, contaminação microbiana, entre outros. 
(Método G-009/1) 
Uma breve inspeção de estudos in situ na literatura demonstra a 
pluralidade observada nos protocolos aplicados (e.g.. Nocek, 1988; NRC, 
Os protocolos são descritos de forma direta na Tabela 18.1. 
2001; Mertens, 2005; Trujillo et al, 2010; Seifred et al., 2015; Machado Abaixo são discutidos os fundamentos que levaram à recomendação 
et al., 2013; Menezes et al., 2017). Essa variabilidade deveria ser vista dos principais pontos das proposições aqui apresentadas. 
como indesejada, uma vez que pode comprometer a reprodutibilidade das
estimativas obtidas e, consequentemente, o cotejamento inter Animais e dieta
experimental. Por outro lado, variações excessivas podem também 
A proposição de composição de dieta se baseou no 
comprometer a formação de banco de dados com vistas à construção dee 
fornecimento de ua dieta equilibrada, com diversidade da 
ferramentas de predição de características in vivo.
331 
330 
INCT Ciência Animal 
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Ediçio 
composição de alimentos 
e sem restrições 
nutricionais que 
Amostras e sacos 
comprometam o 
crescimento microbiano (Tabela 18.1).
Os animais 
A recomendação do tecido náilon com porosidade de 40-60 um 
devem ser adaptados à dieta basal por, no 
mínimo, 14 dias antes do 
agrega às recomendações internacionais de uma foma em geral (Nocek. início da incubação (Machado et al., 2016) para 
buscar alcançar uma 
1988; Michaet-Doureau & Ould-Bah. 1992: Vanzant et al. 1998; NRC. 
condição de steady state no ambiente ruminal, 
necessária à adequada
2001). Ressalta-se que tecidos como o tecido não-tecido (100 g/m>) eo 
estimação dos parâmetros da cinética 
de degradação (Mertens, 2005). 
FS7 (Ankom), embora recomendados para avaliação de compostos 
A estrutura de dieta proposta visa agregar 
ao que tem sido 
indigestíveis (e.g.. FDN indigestível) em procedimento de incubação de recomendado em estudos recentes na tentativa de padronização de 
tempo único, não devem ser utilizados para avaliação de pertis de ensaios de digestão ruminal in vitro no Brasil (Silva et al., 2017;
degradação. Esses tecidos apresentam menor taxa de troca entre os meios Camacho et al., 2019). Contudo, variações podem ocorrer caso o 
interno e extemo aos sacos e tendem a subestimar a taxa de degradação 
ensaio de degradação seja direcionado a uma condiç�ão dietética 
(Valente et al., 2011).
específica. Nestes casos, faz-se necessário a devida justificativa para 
A moagem das amostras tem o propósito de criar uniformidade no 
esta alteração e sua devida exposição no relatório final.
substrato e o aumento no tamanho de partículas tende a ampliar a 
Recomendações quanto ao nível de alimentação dos animais 
variabilidade dos resultados. Em termos gerais. a detinição por tamanho 
utilizados na incubação são variáveis na literatura, na qual indica-se 
de partículas é preferível em relação a uma abertura de peneira, mas, na 
alimentação em nível de mantença (Vanzant et al., 1998), restrita 
prática, isto é ditícil de ser operacionalizado (Michalet-Doureau & Ould 
acima da mantença (Hvelpund & Weisbjerg, 2000) ou ad libitum
Bah, 1992). Em compilação de dados da literatura Michalet-Doureau & 
(Nocek, 1988). Vanzant et al. (1998) indicaram que as influências do 
Ould-Bah (1992) recomendaram tamanho de partíiculas no intervalo de 
nível de alimentação sobre os resultados de estudos in situ não são tão 
1,5 a3,0 mm. Vanzant et al. (1998), também em compilaç�ão de literatura, 
claras. Desta forma, a proposição de alimentação ad libitum aqui 
encontraram o valor modal de 20 mm, o qual constituiu sua 
apresentada se baseia no fato de isto permitir o fornecimento contínuo
recomendação para procedimentos in siu, sendo esta adotada pelo NRC 
de novos substratos e garantir a continuidade do crescimento 
(2001). Bsta foi a base dlarecomendação aqui apresentada. 
microbiano. 
332 333 
INCT Ciencia Animal 
Métodos para Análise de Alimentos 2" Ediç�o 
Procedimentos gerais de incubação 
podem comprometer a identificação da conformação do perfil (i.e.,
presença de lag. identificação de modelo sigmóide). De forma Não há consenso na literatura quanto ao 
número de animais
particular, alimentos produzidos em condições tropicais. notadamente necessários para avaliação da degradação in situ 
de alimentos (e.g.,
um animal - Tomich & Sampaio. 2004; dois animais - NRC, 2001; 
Mehrez & Ørskov, 1977; Ruiz & Ruiz, 1992; Åkerlind 
forragens, possuem degradação mais lenta em comparaç�o a seus 
pares produzidos em regiðes temperadas. Logo, a localização dos três animais 
tempos finais de incubação pode ser determinante para a correta et al., 2011). Em trabalho conduzido em condições brasileiras,
estimaç�o da assíntota e, consequentemente, a correta estimação da Assunção (2017) avaliou as estimativas de parâmetros da cinética
de 
dimensão das frações insolúvel potencialmente degradável e degradação de volumosos e concentrados usando de 2 a 5 animais.
indegradável. Observou-se que, nesse intervalo avaliado, n�o há como definir o 
Assim, os tempos de incubação aqui propostos (Tabela 18. 1) são número mínimo de animais que minimize as variâncias aleatórias dos 
dados. Contudo, recomendou-se o uso de, no mínimo, três animais, o 
resultantes de investigação conduzida por Assunção (2017) sobre 
que propiciou alta probabilidade de obtenção de taxas de degradação alimentos produzidos em condições brasileiras. Uma característica 
similares ao obtido com o número máximo de animais avaliado em marcante que diferencia essa proposição daquelas constantes na 
literatura é o uso de um alto tempo final (i.e., 240 horas) para a 
seu estudo (i.e., cinco). Esta recomendaç�ão direcionou os protocolos 
avaliação dos perfis de degradação ruminal da FDN de volumosos. 
aqui propostos, embora ainda haja ampla lacuna no conhecimento a 
Isso se faz necessário em função dos motivos apresentados no 
ser preenchida neste quesito em especial. 
parágrafo anterior. 
Similarmente, não há consenso na literatura quando ao esquema
Os procedimentos de lavagem dos sacos se faz necessário paraideal de tempos de incubação para a estimação adequada dos 
retirada de resíduos oriundos do ambiente ruminal. Contudo, como 
parâmetros da cinética de degradação ruminal dos diferentes 
componentes dos alimentos. Pequeno número de tempos de incubação 
alertado por Madsen & Hvelpund (1994), a padronização dos 
pode comprometer a estimabilidade das características de degradação. 
procedimentos de lavagem só seria possível com o uso de máquinas
Por outro lado, poucos tempos no início do perfil (i.e., tempos iniciais) 
de lavar. Vanzant et al. (1998) afimaram que a remoção de fluido 
ruminal contaminante segue um modelo de difusão simples. Assim, 
334 335 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos 2" Ediçao
Sua remoção estaria mais 
relacionada ao número de lavagens 
e a0 
volume de água utilizado do que 
ao tempo dispendido 
em cada 
lavagem. Contudo. o tempo 
de exposição e a força dispendidas 
na 
manipulação física dos sacos pode 
ter implicação sobre a perda 
de 
pequenas partículas. Estes 
autores recomendaram, com base 
em dados 
da literatura. o procedimento de lavagem
adotado e sugerido neste 
trabalho (Tabela 18.1). A sugestão de uso 
de lavadora tipo 
"tanquinho" se deve à busca por padronização 
entre procedimentos e 
ao baixo custo e fácil acesso a este tipo de equipamento. 
A disposição dos sacos em ordem reversa em relação 
aos 
tempos de incubação, com retirada simultâneaestá associada à 
recomendação acima, uma vez que todos os sacos seriam
submetidos 
ao mesmo procedimento de lavagem, o que contribuiria para 
padronização e aumento da precis�ão das avaliações. 
336 337 
INCT Cíência Animal 
TI Métodos para Análise de Alimentos 2" Ediça 
E 
5 
E 
i 
339 
338 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
Para estudos da degradação da PB em alimentos volumosos,
faz-se necessária a correção quanto à contaminação microbiana. para 
a qual recomenda-se a utilização das equações propostas por 
Machado 
et al. (2013). A contaminação por compostos nitrogenados 
microbianos não é considerada significativa no estudo da degradação 
da PB de alimentos concentrados (Menezes et al., 2017), não 
sendo.
portanto, necessária. 
A recomendação aqui realizada se baseia no fato de 
a 
contaminação de N microbiano sobre volumosos 
ser diretamente 
proporcional ao tempo de incubação e inversamente proporcional 
ao 
teor de PB da forragem avaliada. As equações recomendadas para 
çorreção da PB degradada são (Machado et al.. 2013): 
%C = 79,21 x (1 -e-0,055Sxt) x e-0,0874xPB 
(100 6C) 
PBR (t) = PBR(t) x 100 
em que: %C = percentagem de contaminação microbiana sobre a 
protefna bruta do resíduo: t = tempo de incubação (h); PB = 
concentração de PB na amostra incubada (% MS); PBRe(t) = resíduo 
não degradado de PB no tempo t corrigido (g); e PBR() = resíduo não 
degradado de PB no tempo t (g). 
341 
340 
INCT Cíência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição 
Ao contráio das análises
estatísticas convencionais, os (4) 
D= A + B x [1 - (1+2 x t) xet] 
modelos a serem aplicados para interpretação dos perfis 
de degradação 
não podem ser def+nidos em planejamento experimental.
Os modelos 
cm que: D = fração degradada no tempo t (g/100 g): 
A = fração solúvel 
devem ser adotados em função do comportamento dos 
dados obtidos 
(g/100 g); B = fração insolúvel potencialmente
degradável (g/100 g): 
no experimento. Modelos são ajustados aos 
dados e não o contrário. 
k = taxa fracional de degradação (h"); t 
= tempo (h): L = latência 
O estabelecimento de um modelo único a priori pode 
gerar 
discreta (h); u = taxa fracional de latência (h*"); 
ei = parâmetro taxa 
interpretação equivocada dos resultados experimentais.
Alimentos
tempo-dependente da degradação (h').
diferentes e. algumas vezes, frações diferentes dentro do 
mesmo 
alimento podem apresentar comportamentos de degradação
distintos,
100 
demandando assim modelos diferentes para que os processos sejam
descritos de forma mais verossímil.
Para interpretação dos perfis de degradação da MS e PB, os 
modelos devem ser ajustados com base na fração degradada
(comumente denominados de perfis "crescentes"), cujos modelos mais 
comuns são (Figura 18.1):
-( -
(1) D = A+Bx (1 -e-kxt) 
Tepo () 
D =A + B x[1- ekx{t-1)1 (2) 
Figura 18.1. Comportamento comparativo de pertis
de degradaçãoo
aplicáveis para interpretação da matéria seca e proteína 
bruta (1, exponencial de primeira ordem; 2, exponencial
de primeira ordem corrigido para latência discreta; 
e 
3/4, compartimental). 
euxtueD, =A + Bx[1-( (3) 
k-u 
343 
342 
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de A/imentox 2 Ediçi
O ajuste direcionado à fraç�ão degradada 
se baseia no fato de 
Caso no processo de ajustamento do modelo (3), 
as taxas de 
que essa fração ser mais 
relevante para interpretação 
nutricional, 1nesse
degradação e latência (1.e.. k e u) tendam ao mesmo valor. 
o modelo
caso. Por exemplo. para o uso da PB no 
ambiente ruminal, o interesse
apresentará uma indeterminação matemática devido à estrutura de seu 
primário é sobre sua degradação, o que 
indica, entre outros aspectos, 
denominador. A solução será dada pela aplicação da regra de 
oN disponível para assimilação microbiana. L'Hôpital sobre o modelo (3). o que resulta no modelo (4). 
O modelo (1) é denominado de exponencial
de primeira 
Para interpretação dos pertis de degradação da FDN, os 
ordem e constitui de uma simples função de base neperiana. Por sua modelos devem ser ajustados com base no resíduo não degradado 
vez, o modelo (2) constitui uma modificação de (1) com a inclusão
do 
(comumente denominados de pertis "decrescentes"), cujos modelos 
parâmetro L que representa a latência discreta. Em outras palavras, 
um 
mais comuns são (Figura 18.2):
tempo teórico no qual eventos como a hidratação de substrato 
e a 
colonização microbiana ocorrem antes do início da degradação em si. R = Bx e-kxt +I (5) 
O modelo (2) assume que todas as limitações para aa 
degradação são simultaneamente contornadas ao final da latência (6): R = B xe-kx(t-L) +[| 
discreta. Contudo, tal suposição não considera que as condições para 
degradação podem ser atingidas diferentemente (e em tempos
R= Bx( kxeuNt-uxekxt
)+l (7): diferentes) para as diferentes frações do substrato. Assim, para k-u 
contornar tal suposição Van Milgen et al. (1991) desenvolveram o 
modelo (3), denominado de modelo compartimental, o qual não R = B x (1 +a x t) x e-kxt+I (8): 
considera a latência um processo discreto, mas sim representado por 
uma taxa. Assim, na medida que o substrato passa pelos processos em que: Ri = resíduo não degradado no tempo t (g/100 g): B fração 
preparatórios, o mesmo se torna disponível para os eventos de potencialmente degradável (g/00 g): k = taxa fracional de degradação
degradação. (h': t = tempo (h):l = tração indegradável (g/100 g): L = latência 
344 345 
2" EdiçãoINCT Ciencia Animnal Métodos para Análise de Alimentos 
discreta (h); u = taxa fracional 
de latência (h'); e a 
= parâmetro taxa 
anteriormente. Somente ressalta-se que os 
modelos (1) a (4) jamais 
tempo-dependente da degradação (h'). devem ser usados para interpretação do perfil 
de degradação da FDN. 
uma vez que os mesmos contemplam 
parâmetro associado à fraçãoo 
solúvel (i.e., fração A). Por definição, 
a FDN representa a fibra 
insolúvel em meios aquosos como o rúmene o uso 
de um modelo que 
nutricional. 
solúvel seria um equívoco contemple fração
Experimentalmente, é comum 
detectar-se o desaparecimento aparente 
de FDN no tempo 0 de incubação. No 
entanto. essa aparente "fração
solúvel" reflete tão somente a ocorrências
de eventos indesejados
como, por exemplo, a perda de partículas pelos 
sacos de incubação.
Literatura Citada 
ASSUNGÇÃO, A.S. Avaliação da variabilidade entre 
animais e de 
protocolos de incubação em estudos de degradação in 
situ em bovinos. 
51f. Disertação (Mestrado em Zootecnia). Viçosa: Universidade
Federal 
de Viçosa, 2017. 
Tempo () 
Figura 18.2. Comportamento comparativo de perfis de degradação 
aplicáveis para interpretação da fibra em detergente 
neutro (5, exponencial de primeira ordem; 6, 
exponencial de primeira ordem corrigido para latência
discreta; e 7/8, compartimental). 
ÅKERLIND, M.; WEISBJERG, M.: ERIKSSON. T.: TØGERSEN. R.; 
UDEN, P.; OLAFssON, B.L.: HARSTAD, O.M.: VOLDEN, H. Feed 
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Nordic feed evaluation system. Wageningen: Wageningen Academic 
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AFRC. Energy AGRICULTURAL AND FOOD REsEARCH COUNCIL 
and protein requirements of ruminants.
International, 1993. 159p. 
De forma simples, o ajuste direcionado ao resíduo não Wallingford: CAB 
degradado se baseia no fato de que a fibra insolúvel possui capacidade 
CAMACHO, L.F.: SILvA. T.E.: PALMA M.N.N.; ASSUNÇÃO, A.S.; 
RODRIGUES, J.P.: CoSTA E SILVA, L.F; DETMANN, E. Evaluation 
of buffer solutions and urea addition for estimating the in vitro 
digestibility of feeds. Journal of Anîmal Science, v.97, p.922-931, 2019. 
de ocupaç�ão de espaço no rúmen. Logo, torna-se interessante avaliar 
a fração ainda residente desse componente após determinado tempo.
As bases teóricas dos modelos são as mesmas apresentadas 
346 347 
INCT Ciencia Animal
Métodos para Análise de Alimentos- 2" Fdiçin 
HARMON, D.L.: RICHARDS. C.J. 
Considerations forgastrointestina 
cannulation in ruminants. Journal of 
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