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Bioenergética Metabolismo MAPA METABÓLICO SIMPLIFICADO Ácido Cítrico (C4) ATP + H2O ADP + Pi DG°’=-30,5kJ.mol-1 PRINCIPAIS SUBSTÂNCIAS NAS VIAS CATABÓLICASS: ATP, NAD+ E NADH; FAD E FADH2 NICOTINAMIDA DINUCLEOTÍDEO: NAD+ E NADH FLAVINA ADENINA DINUCLEOTÍDEO FAD e FADH2 FAD FADH2 PRINCIPAIS SUBSTÂNCIAS NAS VIAS CATABÓLICASS: ATP, NAD+ E NADH; FAD E FADH2 Mitocôndria A mitocôndria, do Grego μίτος ou mitos (fio/linha) + χονδρίοv ou "chondrion“, (grânulo) é uma das organelas celulares mais importantes, também sendo extremamente relevante para a respiração celular. A mitocôndria é responsável por muitos processos catabólicos fundamentais para a obtenção de energia para a célula, como o Ciclo de o Ácido Cítrico, e a Cadeia respiratória na produção de ATP. TEORIA DA ENDOSIMBIOSE LYNN MARGULIS 1981 SYMBIOSIS IN CELL EVOLUTION Proposta para origem das mitocôndrias https://evosite.ib.usp.br/history/endosym.shtml CÉLULA VEGETAL Cloroplasto a partir de cianobactérias CÉLULA ANIMAL Mitocôndria a partir de bactérias aeróbias Glicólise é um processo anaeróbico que ocorre no citosol em uma sequência de 10 reações enzimáticas FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA Leveduras realizam oxidação redutiva do piruvato a etanol e tal processo é explorados há muitos séculos na produção de vinho. Pasteur e outros pesquisadores começaram a realizar experimentos na investigação química dessas vias catabólicas no século XIX. Em 1940 a via completa foi elucidada por EMBDEM-MEYERHOF-PARNAS. REDUÇÃO A LACTATO Algumas bactéria e mamíferos realizam a redução do piruvato a lactato. Etapas de 1 a 5: Investimento de Energia DHAP G3P G6P F6P F1,6B Etapas de 6 a 10: Recuperação de Energia Intermediários são todos fosforilados A importância da fosforilação dos intermediários • Manter metabólitos no citosol sem gasto de energia, pois não há proteínas carreadoras na membrana; • Grupos fosforila são fáceis de transferir ; • Enzimas têm sítios ativos específicos p/ grupos fosfatos complexados com Mg2+. • Glicose-1-fosfato DG°’=-20,9kJ.mol-1 • Frutose-1-fosfato DG°’=-13,8kJ.mol-1 • Glicose-6-fosfato DG°’=-13,8kJ.mol-1 Reações da glicólise Hexocinase é uma enzima comum, não específica, que catalisa a fosforilação de hexoses (D-glicose, D-manose e D-frutose). 1a etapa: fosforilação da glicose 2º Significado do Km Km está relacionado às constantes de velocidade de cada etapa da reação Ex: Hexocinase (Músculo) versus Glicocinase (Fígado): da Glicose Glicose – 6 – fosfato G6P O OH OH HO HO CH2 O H Asp C O O P O O P O O P O Adenosina O O Mg O O 2 Glicose O OH OH HO HO CH2 OPO32 Asp C O OH ADP C O OGlu O AsnH2N Hexocinase Hexocinase + Mg2+: ATP + n H2O Hexocinase + Glicose + Mg2+: ATP - n H2O Cinase = enzima que transfere grupo fosforila entre ATP e um metabólito 2a etapa: conversão da glicose-6-fosfato em frutose-6-fosfato catalisada pela fosfoglicose isomerase O mecanismo da catálise pela fosfoglicose-isomerase (PGI) envolve reação ácido-base com a participação de resíduos conservados evolutivamente: Lys, His e Glu: Mecanismo da catálise pela fosfoglicose-isomerase (PGI) B׃ = N N H His H C O OGlu Lys NH3 ou H+ = CH2OH C O HO OH OH OHH H H H H 1 2 3 4 6 5 CH2OH O C HO OH OHH H H 1 2 3 4 6 5 CH2OH C O HO OH OH H H H H 1 2 3 4 6 5 CH2OH C O HO OH OH OH H H H H 1 2 3 4 6 5 HO H OH OH Glucose cis-Enediolato Manose OH H H OH Frutose A velocidade da isomerização é muito maior que a da epimerização. PGI (fosfoglicose-isomerase) deve bloquear a face do intermediário que levaria à formação da manose. OH HO HO H O O OPO3 2- H H3N Lys B OH HO HO O OPO3 2- O H H H Abertura do anel da glicose Isomerização da glicose Etapa mais lenta da via 3a etapa: fosforilação da frutose-6-fosfato para frutose-1,6-bisfosfato OH O CH2OH OH HO P O O O OCH2 OH O HO P O O O OCH2 CH2OH OH OH O HO P O O O OCH2 OH ATP ADP CH2OPO3 2- Frutose-6-fosfatoFrutose-6-fosfato Frutose-1,6-bisfosfato Mg2+ Equilíbrio dos anômeros α e β da frutose Sítio alostérico Frutose-1,6-bisfosfato ATP PFK-1 é uma proteína tetramérica com 2 estados conformacionais, R e T, em equilíbrio Ativador (ADP; AMP) Inibidor - ATP (só em T); Sítios do Substrato e da Coenzima (ATP se liga neste sítio em R e T; F6P se liga só em R) R T [ATP] R T 4a etapa: A enzima frutose-1,6-bisfosfato aldolase catalisa condensação aldólica (retro-aldol) R O CH2 OHH R' OH- H2O R O CH2 O-H R' R O CH2- R CH2 O- H2O OH- R O CH3 dihidroxi-acetona- fosfatoH O R' + gliceraldeído-3-fosfato Mecanismo de clivagem de aldol catalisada por base (condensação retro-aldólica) 5a etapa: A diidroxiacetona-fosfato é rápida e reversivelmente convertida no gliceraldeído-3- fosfato pela triose-fosfato isomerase. 4a etapa 5a etapa 6a etapa: oxidação de gliceraldeído-3-fosfato para 1,3-bisfosfoglicerato catalisada pela gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase. A fosforilação é feita com Pi A 1a fase de recuperação de energia (2NADH+) Acilfosfato anidrido misto com alto potencial de transferir grupo fosforila C O O P O O2 2- R NAD+ substitui NADH no sítio 7a etapa: A enzima fosfoglicerato-cinase transfere o grupo fosforila de alta energia do 1,3- bisfosfatoglicerato (DG°’=-49,4kJ.mol-1) para ADP formando ATP e 3-fosfoglicerato. O P O O2 2-R O P O O O P O Adenosina O O Mg2+ 3-fosfoglicerato + ATP : Mg2+ 8a etapa: Conversão do 3-fosfoglicerato no 2-fosfoglicerato, mediada pela fosfoglicerato mutase com participação do cofator Mg2+ Enzima fosforilada inicialmente pelo 2,3-BPG presente (traços) no citosol Requer a presença de 2,3-BPG 9a etapa: Desidratação do 2-fosfoglicerato, mediada pela enolase, para formar fosfo-enolpiruvato (PEP) (PEP) Duas propostas mecanísticas: Glu211 C O O H C C C O OPO3 2- OHH H H Mg2+ O Mg2+ Lys345 NH2 1 2 PEP 1 2 PEP Glu168 Glu211 C O O C O O H H O C C C O O OPO3 2- OHH H H Mg2+ Enolase - H2O - H2O (PEP) K+ Mg2+ 10a etapa: transferência do grupo fosforila do fosfoenolpiruvato (PEP) (DG°’=-61,9kJ.mol-1) para ADP, catalisada pela piruvatocinase, que requer K+ + Mg2+ ou Mn2+ A reação global da glicólise gera ATP, NADH e Piruvato: Ciclo do Ácido Cítrico 1937 – Hans Krebs – sugeriu a natureza cíclica da via 1945 – Kaplan e Lipman – elucidação da estrutura da Coenzima A 1951 – Ochoa e Lynen – a primeira reação do ciclo era desconhecida: acetil-CoA + oxalacetato => citrato 6C 6C 5C 4C 4C 4C 4C O CAC começou a ser estudado a partir de 1930, quando já era conhecido que que vários dicarboxilatos e um tricarboxilato eram rapidamente oxidados no tecido muscular durante a respiração. Ac-CoA 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + acetil-CoA 3NADH + FADH2 + GTP + CoA + 2 CO2 1. Em eucariotos todas as enzimas do CAC estão localizadas na mitocôndria; 2. Os dois átomos de carbono das duas moléculas de CO2 produzidos a cada volta do ciclo não são os dois carbonos que começam o ciclo; 3. Os intermediários do CAC são precursores na biossíntese de outras substâncias (-cetoglutarato e aa); 4. A oxidação do grupo acetila a 2 CO2 necessita da transferência de 4 pares de elétrons (3NAD+ 3NADH e FAD FADH2). O Oxaloacetato consumido na primeira etapa do ciclo é regenerado na última etapa. Assim, o CAC atua como catalisador de múltiplas etapas que pode oxidar um número ilimitado de grupos acetil. Equação geral do ciclo: Ciclo do Ácido Cítrico ou Ciclo do Ácido Tricarboxílico (TCA) C6 C6 C5 C4 C4 C4 C4 C2 Complexo Multienzimático E1+ E2 + E3 Conversão de piruvato a acetil-CoA 5 Etapas E1 = Piruvato desidrogenase E2 = Diidrolipoil transacetilase E3 = Diidrolipoil desidrogenase Micrografia crioeletrônica do complexo multienzimático Complexo Piruvato Desidrogenase Quais são as vantagens de um complexo multi-enzimático? Sequência de reações que ocorrem na presença de 3 enzimas diferentes e 3 coenzimas diferentes e dois grupos prostéticos (TPP e Ácido lipólico) = complexo piruvato desidrogenase TPP Tiamina pirofosfato Ácido lipólico 1ª Reação: Descarboxilação do Piruvato em E1 Ilida de nitrogênio (“Ylid”)Tiamina pirofosfato (TPP) Piruvato (Piruvato Desidrogenase) Hidroxietila-TPP metiltiazolium 2ª Etapa: Transferência do grupo hidroxietila para E2 TPP-E1 Acetil-dihidrolipoamida-E2 E2 - Domínio lipoila Dihidrolipoil transacetilase Lipoil oxidado (dissulfeto) Ácido lipólico 3ª Etapa: Transferência do grupo acetila para a CoA Dihidrolipoamida-E2 Acetil-CoA Acetil CoA Lipoil reduzido - Ditiol Coenzima A Curiosidade: Envenenamento por arsênico provoca parada respiratória Aduto bidentado inativa a enzima Dihidrolipoil transacetilase - E2 Quais são as vantagens de um complexo multienzimático? • Os Complexos Multienzimáticos são grupos de enzimas associadas de modo não-covalente que catalisam duas ou mais reações sequenciais em uma rota metabólica; e representam um avanço na evolução da eficiência catalítica, apresentando as seguintes vantagens: • 1. Como sabemos, a velocidade das reações enzimáticas é limitada pela frequência com que as enzimas colidem com seus substratos. No caso dos complexos enzimáticos os substratos devem difundir-se entre os sítios ativos do complexo, aumentando a velocidade das reações; • 2. A canalização dos intermediários metabólicos entre enzimas sucessivas reduz a possibilidades que tais metabólitos reajam com outras substâncias minimizando reações secundárias; • 3. As reações em um complexo enzimático podem ser controladas coordenadamente. Reações do CAC 1a Reação: Condensação de acetil-CoA e Oxalacetato Citrato sintase, uma enzima dimérica Oxalacetato se liga primeiro à enzima, provocando uma alteração conformacional, que gera um sítio de interação com a acetil-CoA FORMA ABERTA FORMA FECHADA oxalacetato acetil-CoA H B+ H H C SCoA O H N N His274 HC O O375Asp N N His274 H B H C SCoA O H H Acetil CoA Enol C CO2 - O -O2C CH2 Oxaloacetato N N H His320 H B+ C CO2 --O2C CH2 HO CH2 C SCoA O (S)-citril-CoA H2O HSCoA C -O2C CH2 HO CO2 - CH2 CO2 - Citrato Condensação Mecanismo Ataque estereoespecífico do enol à face si da carbonila gera apenas isômero (S)-citril-CoA Citrato não é opticamente ativo Citrato sintase 2a Reação: Isomerização de citrato em isocitrato 3a Reação: Descarboxilação oxidativa do isocitrato Mn2+, DG°’=-21kJ/mol 4a Reação: Descarboxilação oxidativa do -cetoglutarato Etapa análoga à conversão de Piruvato em acetil-CoA E1 + E2 + E3 5a Reação: Hidrólise do grupo acil-CoA Em mamíferos: 2 isoenzimas [GTP (trifosfato de guanosina) ou ATP] Em plantas e bactérias: ATP (trifosfato de adenosina) ATP e GTP se inter-convertem facilmente na presença da enzima nucleosídeo difosfato cinase, estabelecendo-se o equilíbrio: GTP + ADP GDP + ATP ΔG°’ = 0guanina adenina Succinil coenzima-A sintetase – E. coli (estrutura incompleta para facilitar visualização) Coenzima-A Grupo fosfato da His246 estabilizado por cargas positivas de resíduos de hélices próximas 6a Reação: Desidrogenação estereoespecífica do succinato • Oxidação de alcano a alqueno é suficientemente exergônica para reduzir FAD a FADH2, porém não é suficiente para reduzir NAD+ (oxidação de álcool a cetona consegue reduzir NAD+). • FAD está covalentemente ligado à succinato desidrogenase. 7ª Reação: Hidratação de Fumarato carbânion 8a Reação: Oxidação de Malato para Oxalacetato O valor de DG°’= +29,7kJ/mol indica que a [oxaloacetato] nas condições celulares é relativamente baixa em relação ao malato; No entanto, a primeira reação do CAC, catalisada pela citrato-sintase é altamente exergônica (DG°’=-32,2kJ/mol) devido à clivagem da ligação tio éster da citril-CoA. Tal processo aparentemente dispendioso, permite que a formação do citrato seja exergônica mesmo a baixas concentrações do oxaloacetato presente nas células; ajudando a manter o CAC em funcionamento. Mecanismos de Regulação do Ciclo do Ácido Cítrico O CAC é controlado por mecanismos de feedback. Quando os produtos essenciais do CAC (NADH e ATP) se acumulam inibem algumas enzimas do ciclo: Citrato-sintase (1ª etapa); isocitrato desidrogenase (3ª etapa); -cetoglutarato desidrogenase (4ª etapa). Garrett, R.H.; Grisham, C.M. (1999) Biochemistry, 2nd ed. Saunders College Publishing. Nelson, D.L. & Cox, M. M. Princípios de Bioquímica de Lehninger, 6a Ed. Artmed, Porto Alegre, 2014. Donald Voet & Judith G. Voet (2013) Bioquímica, 4a Ed. Artmed, Porto Alegre. Mary K. Campbell & Shawn O. Farrell (2007) Bioquímica (Combo), 5a Ed. Cengage Learning. Harvey, R. A.; Ferrier, D. R. Lippincott’s Ilustrated Reviews: Biochemistry, 5th Ed, Lippincott williams & Wilkins/wolters Klumer Health Inc. USA Koolman (2005) Color Atlas of Biochemistry, 2nd ed., Thieme. Raven & Johnson - Fueling Body Activities: Digestion Ciclo do Ácido Cítrico Transferência de Elétrons e Fosforilação Oxidativa
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