ELISA-200610-013154-1592255369

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SUMÁRIO
1. O que é ELISA? ........................................................... 3
2. Como é realizado? ..................................................... 3
3. Tipos de ELISA ........................................................... 4
4. Comparação entre elisa por detecção 
direta e indireta ................................................................ 9
5. Qual a importância do ELISA? ............................11
Referências bibliográficas ........................................14
3ELISA
1. O QUE É ELISA?
O Elisa (Enzyme Linked Immuno Sor-
bent Assay) é um teste sorológico 
imunoenzimático cuja metodologia 
se baseia em reações antígeno-an-
ticorpo detectáveis através de rea-
ções enzimáticas. 
Existem vários modelos de ELISA, e 
eles envolvem testes usando anticor-
pos como reagentes. Imunoensaios 
enzimáticos como estes utilizam en-
zimas ligadas a um dos reagentes. A 
presença de antígenos e/ou anticor-
pos no espécime clínico é revelada 
pela produção de cor com a adição do 
substrato da enzima e de uma subs-
tância cromógena, indicando uma 
reação positiva. As enzimas mais co-
mumente utilizadas como marcado-
res nos ELISA são peroxidase e fos-
fatase alcalina.
SE LIGA! Os testes sorológicos utilizam 
o soro como amostra para detectar a 
presença de anticorpos contra parasitas, 
fungos, bactérias ou vírus, indicando que 
o indivíduo esteve em algum momen-
to em contato com estes agentes. Mas 
também podem detectar a presença dos 
antígenos, indicando diretamente a sua 
presença no organismo. 
SAIBA MAIS! 
O teste ELISA foi desenvolvido e descrito por Peter Perlmann e Eva Engvall na Universidade 
de Estocolmo, Suécia, em 1971, quando demonstraram a medida quantitativa de IgG no soro 
de coelho utilizando a enzima fosfatase alcalina como marcador. Antes do surgimento do 
ELISA, as técnicas de imunoensaio usavam marcadores radioativos, o que trazia riscos para 
a saúde dos pacientes. O ELISA então surge como um método imunoenzimático alternativo, 
cuja técnica permite a análise de amostras de proteínas imobilizadas em poços de micropla-
cas usando anticorpos específicos e enzimas como marcadores. 
2. COMO É REALIZADO?
Para a realização do teste imunoenzi-
mático a técnica, em sua forma mais 
simples, segue o seguinte passo a 
passo: 
• Um reagente é conectado a uma 
fase sólida, geralmente uma placa 
de plástico com um formato de vá-
rios pequenos poços.
• Adição de reagentes, ou seja, do 
soro como amostra clínica. É nessa 
etapa que ocorre o reconhecimen-
to de antígeno-anticorpo, caso 
haja especificidade. O anticorpo 
ADICIONADO É LIGADO A UMA 
ENZIMA. 
• Após período de incubação, a 
separação dos reagentes liga-
dos e livres, que são adicionados 
4ELISA
subsequentemente à fase sólida, 
é feita por uma simples etapa de 
lavagem.
• Uma reação enzimática é utiliza-
da para produzir cor e quantificar 
a reação, através da adição do 
substrato específico para a enzima 
utilizada.
• A leitura dos resultados se faz pela 
medida da ação enzimática sobre 
substrato cromogênico, levan-
do à mudança de cor da solução 
quando há reação antígeno-anti-
corpo, configurando um resultado 
positivo. 
SE LIGA! Qualquer forma ou superfície 
disponível em uma molécula que pos-
sa ser reconhecida por um anticorpo 
constitui um determinante antigênico ou 
epítopo. Antígenos polivalentes contêm 
múltiplos epítopos idênticos aos quais 
moléculas de anticorpos idênticos po-
dem se ligar. As funções dos anticorpos 
são dependentes de sua habilidade em 
se ligar especificamente a antígenos. 
Devido essa ligação específica de an-
tígeno-anticorpo, tem-se a precisão do 
teste ELISA.
3. TIPOS DE ELISA
ELISA direto
O ELISA direto pode ser considera-
do como a forma mais simples do 
ELISA. É utilizado na dosagem de 
anticorpo, logo, identifica se o indi-
víduo foi exposto à determinada 
doença. Nessa reação, o antígeno é 
fixado a um suporte sólido contendo 
vários pequenos poços onde a amos-
tra contendo anticorpo é adicionada 
para reagir. Como mostrado na Figura 
1, esse anticorpo, ligado a uma enzi-
ma é chamado de anticorpo primário. 
Nessa etapa ocorre o reconhecimento 
de antígeno-anticorpo e, após proce-
dimentos intermediários (incubação e 
lavagem) há retirada dos componen-
tes não fixados. Em seguida, a reação 
positiva é visualizada com a adição 
do substrato específico da enzima 
utilizada, em que ocorre mudança de 
cor na solução através de catálise en-
zimática. A intensidade da cor é esti-
mada colorimetricamente e é propor-
cional à concentração do anticorpo 
pesquisado.
Figura 1. ELISA por detecção direta. 
Fonte: Sanarflix.
ELISA indireto
O ELISA indireto é o mais ampla-
mente empregado e também é uti-
lizado na dosagem de anticorpo. 
5ELISA
Neste método, a placa de microtitu-
lação contendo vários pequenos po-
ços é sensibilizada com preparações 
antigênicas. A seguir, como se obser-
va na Figura 2, coloca-se sobre estas 
amostras de soro em teste (ex. soro 
humano), em diluições recomendadas 
pelo fabricante, para incubação por 
período preestabelecido, para permi-
tir a reação dos anticorpos presentes 
na amostra com o antígeno fixado na 
microplaca. Se houver anticorpos no 
soro em teste ocorrerá a formação da 
ligação antígeno-anticorpo. Após la-
vagem dos poços, essa ligação é pos-
teriormente detectada pela adição de 
um segundo anticorpo dirigido contra 
imunoglobulinas da espécie onde se 
busca detectar os anticorpos. Esse 
anticorpo antiimunoglobulina o qual 
é ligado à enzima (peroxidase, por 
exemplo) e denomina-se conjugado, 
ou anticorpo secundário. Esse conju-
gado antiimunoglobulina humana re-
age com o anticorpo capturado pelo 
antígeno da fase sólida. Após incuba-
ção e posterior lavagem para retirada 
dos anticorpos não ligados, a reação 
é revelada com adição do substra-
to específico para a enzima utilizada. 
Em casos de reações positivas, ocorre 
mudança de cor na solução e a inten-
sidade da cor é estimada colorimetri-
camente, sendo proporcional à con-
centração do anticorpo pesquisado.
Figura 2. ELISA por detecção indireta. Fonte: Sanarflix.
ELISA sanduiche
A característica desse ensaio é 
utilizar antígenos recombinantes 
ou peptídeos sintéticos tanto na 
fase sólida quanto sob a forma de 
conjugado. Esse formato permite 
6ELISA
dos anticorpos não ligados, é adicio-
nada uma substância que irá reagir 
com a enzima, ocorrendo mudança 
de cor na solução através de catálise 
enzimática. 
A possibilidade de detectar anticor-
pos da classe IgM torna esse ensaio 
mais sensível do que os demais para 
identificação da fase aguda de doen-
ças. Além disso, há aumento da es-
pecificidade do exame, pois o conju-
gado liga-se apenas à fração livre do 
anticorpo que está no complexo imu-
ne (antígenos na fase sólida do ensaio 
e anticorpos da amostra).
a detecção simultânea de imuno-
globulinas de diferentes classes. 
Conforme se observa na Figura 3, 
para a realização da técnica do ELI-
SA sanduiche, o antígeno específico 
e conhecido é fixado aos poços conti-
dos em uma placa sólida à qual serão 
adicionados dois anticorpos contidos 
na amostra sorológica. Após proce-
dimentos intermediários (incubação 
e lavagem) será adicionado um con-
jugado (anticorpo ligado à enzima). 
Esse complexo do anticorpo ligado à 
enzima reage com os dois primeiros 
anticorpos adicionados. Após incuba-
ção e posterior lavagem para retirada 
 Figura 3. ELISA sanduíche. Fonte: Sanarflix.
ELISA por competição
A técnica ELISA por competição é um 
teste em que a presença de antíge-
nos em determinado soro é reve-
lada pela competição com um an-
tígeno marcado por um anticorpo 
específico. É utilizado principalmen-
te quando o antígeno testado possui 
poucos epítopos de ligação ou é mui-
to pequeno.
No método, conforme mostra a Figu-
ra 4, a amostra contendo o antígeno 
7ELISA
Entretanto, a coloração aparecerá nos 
orifícios onde não havia ligação entre 
anticorpos e antígenos teste. Ou seja, 
a positividade do exame se dá pela 
ausência de mudança decoloração.
Figura 4. ELISA por competição. Fonte: Sanarflix.
teste e anticorpo específico é adi-
cionado à placa contendo antígeno 
ligado à uma enzima. Esse antígeno 
ligado irá competir com o antígeno da 
amostra, pois o anticorpo possui afi-
nidade para ambos. Quanto maior a 
concentração de antígenos teste que 
se ligam, maior o grau de inibição dos 
antígenos marcados. Dessa forma, o 
grau de competição é proporcional à 
quantidade de antígenos contidos na 
amostra. Como nos demais tipos de 
ELISA, após procedimentos interme-
diários de incubação e lavagem, com 
a adição do substrato enzimático que 
irá reagir com o conjugado (neste caso, 
será um antígeno ligado a uma enzi-
ma), ocorrerá mudança de cor na so-
lução através de catálise enzimática. 
SAIBA MAIS! 
Existem ensaios usados para quantificar as células T efetoras e secretoras de citocinas dentro 
dos tecidos linfoides. O ELISpot, outra forma de ELISA, é um exemplo. Nele, as células T são 
cultivadas em placas e à medida que as citocinas são secretadas das células T individuais, 
elas se ligam aos anticorpos específicos em pontos correspondentes à localização de cada 
célula. Os pontos são visualizados pela adição de uma enzima secundária ligada ao anticorpo, 
como em um ELISA padrão, e o número de pontos é contado para se determinar a medida do 
número de células secretoras de citocina. 
8ELISA
MAPA MENTAL 1: TIPOS DE ELISA
TIPOS DE 
ELISA
Direto
ELISpot Competição
Indireto Sanduiche
Enzima ligada ao 
anticorpo primário 
Positividade do exame se dá 
pela mudança de coloração
Utilizado quando o alvo 
possui poucos epítopos 
Pesquisa de antígenos
Utiliza antígeno marcado 
para competir com o alvo
Positividade do exame se dá pela 
ausência de mudança de coloração
Ensaio usado para quantificar as 
células T efetoras e secretoras de 
citocinas dentro dos tecidos linfoides
Enzima secundária ligada ao 
anticorpo como no ELISA padrão
É o mais usado
Pesquisa de anticorpos
Utiliza anticorpos 
primário e secundário
Enzima ligada ao 
anticorpo secundário
Positividade do exame se dá 
pela mudança de coloração
É a técnica básica do ELISA
Pesquisa de anticorpos
Utiliza apenas um 
anticorpo primário 
Técnica com maior especificidade
Detecta diferentes classes de 
imunoglobulinas simultaneamente
Anticorpo fica entre dois antígenos
Enzima ligada a antígenos 
recombinantes ou peptídeos sintéticos 
Positividade do exame se dá 
pela mudança de coloração
9ELISA
4. COMPARAÇÃO ENTRE 
ELISA POR DETECÇÃO 
DIRETA E INDIRETA
O método de detecção direta tem 
como vantagens:
• Mais simples por usar apenas um 
anticorpo primário;
• Mais rápido porque menos etapas 
são usados;
• A reatividade cruzada do anticor-
po secundário é eliminada.
Por outro lado, possui como 
desvantagens:
• A especificidade do anticorpo 
primário pode ser afetada adver-
samente pela ligação ao marcador 
(enzima);
• Não há flexibilidade na escolha 
do marcador de anticorpo pri-
mário de um experimento para 
outro.
• Amplificação mínima do sinal 
para a detecção. 
Já o método de detecção indireta 
possui como vantagens: 
Uma grande variedade de anti-
corpos secundários com diferen-
tes marcadores está disponível 
comercialmente; 
Versátil porque muitos anticor-
pos primários podem ser usados no 
mesmo teste enquanto apenas um 
anticorpo secundário pode ser usado 
para detecção;
A especificidade do anticorpo pri-
mário não é afetada;
Maior sensibilidade e possibilidade 
de amplificação do sinal, pois o anti-
corpo secundário pode se ligar a dife-
rentes epítopos do anticorpo primário; 
Apresenta maior especificidade no 
teste por usar anticorpo secundá-
rio, tendo que garantir duas reações 
específicas para resultar em uma 
reação positiva com a mudança de 
coloração. 
Porém, este método possui como 
desvantagens:
• Maior complexidade devido a 
mais uma etapa para adição do 
anticorpo secundário;
• Uma etapa de incubação extra é 
necessária no procedimento;
• A reatividade cruzada pode ocor-
rer com o anticorpo secundário, 
resultando em sinal não específico 
e um resultado falso-positivo. 
10ELISA
MAPA MENTAL 2: COMPARAÇÃO ENTRE ELISA POR DETECÇÃO DIRETA E INDIRETA
DIRETO ELISA
Vantagens
Mais simples por 
usar apenas um 
anticorpo primário
Menos etapas
Ausência de reatividade 
cruzada do anticorpo 
secundário
INDIRETO
Especificidade do 
anticorpo primário 
pode ser afetada
Amplificação mínima do 
sinal para a detecção
Sem flexibilidade na 
escolha do marcador de um 
experimento para outro
Especificidade do 
anticorpo primário 
não afetada
Amplificação do sinal
Maior especificidade 
Maior complexidade
Mais etapas
Possibilidade de 
reatividade cruzada 
Variedade de 
anticorpos secundários 
com diferentes marcadores 
Diferentes anticorpos 
primários podem ser 
usados no mesmo teste 
Desvantagens
Vantagens
Desvantagens
11ELISA
5. QUAL A IMPORTÂNCIA 
DO ELISA?
Elisa é uma técnica imunoenzimática 
atualmente mais usada tanto na prá-
tica médica como também em pes-
quisa, que tem a vantagem de ser um 
método muito sensível, de fácil exe-
cução e aplicável diretamente sobre 
as amostras sorológicas coletadas 
e permitir rápido diagnóstico. Tem 
como características unir a especi-
ficidade de uma ligação antígeno-
-anticorpo com a sensibilidade de 
uma reação enzimática, sendo am-
plamente usado para diagnóstico de 
várias doenças que induzem a produ-
ção de imunoglobulinas, como tam-
bém para dosagem de antígenos. 
Dentre as patologias para as quais o 
ELISA é utilizado na busca do agen-
te etiológico ou pesquisa de anticor-
pos específicos no soro de pacientes 
infectados temos: HIV; HTLV-1 e 2; 
Hepatite C; Doença de Chagas; Ro-
tavírus, entre outras. 
Além disso, os métodos imunoenzi-
máticos, por apresentar como vanta-
gens a possibilidade de automação e 
alta sensibilidade, são os de escolha 
na triagem de doadores de sangue.
SE LIGA! O teste ELISA pode ser padro-
nizado para privilegiar a sensibilidade ou 
especificidade. Essa padronização é im-
portante quando se trata de investiga-
ção de doenças na triagem de doadores 
em banco de sangue. Neste caso deve 
ser privilegiada a sensibilidade do tes-
te para detectar pequenas quantidades 
de antígenos ou anticorpos no sangue 
dos doadores, mesmo que os resultados 
indiquem falsos–positivos, pois, esses 
resultados podem ser posteriormente 
confirmados por outros métodos. Dessa 
forma, essa conduta aumenta a segu-
rança nos procedimentos de transfusão 
sanguínea.
SAIBA MAIS! 
No Brasil, nos hemocentros, conforme a Resolução da Diretoria Colegiada - RDC n° 153, de 
14 de julho de 2004 da ANVISA, emprega-se como reste de triagem sorológica para HTLV-
1 e 2 o reste de ELISA. O resultado pode ser POSITIVO (reativo); NEGATIVO (não-reativo) 
ou INDETERMINADO (valor de absorbância próximo do valor de ponto de corre). Se for po-
sitivo, uma nova coleta deverá ser feita e a nova amostra é testada em duplicata. Diante da 
reatividade em uma ou ambas dessas duplicatas, deve-se realizar um teste confirmatório, o 
Western Blot (WB).
12ELISA
MAPA MENTAL 3: RESUMO DO TEMA
Indireto: Chagas e HIV.
Sanduiche: teste de gravidez (detecção de 
gonadotropina coriônica humana (HCG) no soro); 
HIV Como regra geral, o M1n1sténo da 
Saúde, através do Programa Nacional de 
DST/AIDS, sugere um ensaio imunoenzimático 
para teste de triiagem, sendo indicação 
absoluta a realização de testes confirmatórios, 
diante de resultado positivo.
Fazer casos clínicos com resultados do 
ELISA, mostrando qual é mais utilizado em 
casa doença e qual o padrão em cada uma 
delas (as mais relevantes).
ELISA
(Ensaio de 
Imunoabsorção 
Enzimática)
Definição
Teste sorológico imunoenzimático cuja 
metodologia se baseia em reações antígeno-anticorpo 
detectáveis através de reações enzimáticas. 
O que pesquisa Antígenos e anticorpos
Tipo de amostra Soro ou plasma
Tipos Por detecção direta
Por detecção indireta
Sanduíche
Por competição
ELISpot
Importância
Diagnósticode doenças que induzem a produção 
de imunoglobulinas, como também para dosagem de 
antígenos (HIV; HTLV-1 e 2; Hepatite C; Doença de Chagas)
Triagem de doação de sangue/órgãos
Marcadores 
mais usados Peroxidase e Fosfatase alcalina
Como é realizado 1. Um reagente é conectado a uma fase sólida
2. Adição de reagentes acoplados
3. Etapas de incubação e lavagem
4. Adição do substrato da enzima
5. Os resultados são obtidos através 
do desenvolvimento da cor
13ELISA
Agora vamos ver alguns casos clí-
nicos para sedimentar o conteúdo e 
testar nossos conhecimentos:
• Paciente masculino, 25 anos, com-
pareceu ao consultório de Clíni-
ca Médica com queixa de febre, 
cansaço, aumento de linfonodos e 
perda ponderal. Revela nunca ter 
realizado exames sorológicos para 
doenças virais. Qual o tipo de ELI-
SA você considera o ideal para a 
detecção de anticorpos contra o 
vírus de imunodeficiência humana 
(HIV) em sua fase aguda?
• Uma paciente feminina, com sus-
peita de HTLV, realizou triagem so-
rológica cuja metodologia adotada 
foi o ensaio de imunoabsorção li-
gado a enzima (ELISA). A ordem 
das amostras da técnica de ELISA 
empregada pode ser resumida da 
seguinte forma: 1) Partículas frag-
mentadas do HTLV (antígeno); 2) 
Soro do paciente; 3) Anticorpos 
anti-IgG conjugados à enzima; 4) 
Substrato enzimático. Qual o tipo 
de ELISA usado?
RESPOSTAS: 
• O ELISA sanduíche. O Ministério 
da Saúde, através do Programa 
Nacional de DST/AIDS, sugere um 
ensaio imunoenzimático para teste 
de triagem, sendo indicação abso-
luta a realização de testes confir-
matórios, diante de resultado po-
sitivo. Se tratando de um paciente 
em fase aguda da doença, essa 
técnica é a mais adequada para a 
triagem do paciente, uma vez que 
é possível detectar anticorpos an-
ti-HIV IgM e IgG nos testes de HIV. 
• O ELISA indireto. Nessa técnica a 
presença de anticorpos específi-
cos é detectada por um conjugado 
constituído por Anticorpos anti-I-
gG conjugados à enzima. 
14ELISA
REFERÊNCIAS 
BIBLIOGRÁFICAS 
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. H. I. V. Imunologia celular e molecular. 8. ed. Rio 
de Janeiro: Elsevier, 2015.
Brasil. Ministério da Saúde. Manual Técnico para o Diagnóstico da Infecção pelo HIV em 
Adultos e Crianças. – Brasília : Ministério da Saúde, 2016
Erichsen ES, Viana LG, Faria RMD; Santos SME. Medicina laboratorial para o clínico. Belo 
Horizonte, COOPMED, 2009.
John R. Crowther, Methods in Molecular Biology, The ELISA Guidebook. Segunda edição. 
Humana Press, parte da Springer Science + Business Media, LLC 2009.
Teste de ELISA, 2000, Universidade Federal da Bahia, Faculdade de Medicina, Departamen-
to de Anatomia Patológica e Medicina Legal. 
Teste de ELISA, 2010, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. 
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