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Tutorial 2 1- Discutir o ciclo celular, considerando diferentes tecidos. 1.1 Regulação do ciclo celular Alberts - Fundamentos da Biologia Molecular, 4ª Edição. Capítulo 18, página 633 1.2 Fases Alberts - Fundamentos da Biologia Molecular, 4ª Edição. Capítulo 18, página 648 1.3 Controle do número e tamanho das células Alberts - Fundamentos da Biologia Molecular, 4ª Edição. Capítulo 18, página 660 2- Explanar acerca das células tronco, ressaltando seus tipos, funções e capacidade de originar diferentes tecidos. Geoffrey - A Célula, 3ª Edição. Capítulo 15, página 30 Alberts - Fundamentos da Biologia Molecular, 4ª Edição. Capítulo 20, página 705 3- Discorrer sobre os órgãos regulamentadores e as questões bioéticas na obtenção e no uso de células tronco na terapêutica em humanos. Regulamentação das terapias celulares no Brasil - Narahashi e colaboradores A ética no uso de células tronco revisão de literatura - Matias e colaboradores OBJETIVO 01 CICLO CELULAR Função básica do ciclo: duplicar,de forma exata, o DNA nos cromossomos e segregar as cópias em duas células filha que são geneticamente idênticas. - Em células eucarióticas os estágios do ciclo são divididos em duas fases: Interfase e fase mitótica (Fase M). Controle do ciclo celular A organização básica do ciclo celular é essencialmente a mesma em todas as células eucarióticas, e todos os eucariotos parecem usar uma maquinaria e mecanismos de controle similares para conduzir e regular os eventos do ciclo celular. O sistema de controle é como um cronômetro rigidamente programado que propicia uma quantidade fixa de tempo para a conclusão de cada evento do ciclo celular. DO QUE O CICLO CELULAR DEPENDE? ● Proteína-cinases dependentes de ciclinas (Cdks) - Componentes centrais - impulsiona a progressão aos pontos de verificação do Início e de G2/M - dependentes de ciclinas para sua atividade: a menos que estejam fortemente ligadas a uma ciclina, elas não têm atividade de cinase. - O aumento e a diminuição dos níveis de ciclinas são os determinantes primordiais da atividade das Cdks durante o ciclo celular. As atividades dessas cinases sobem e descem à medida que a célula avança no ciclo, levando a mudanças cíclicas na fosforilação de proteínas intracelulares que iniciam ou regulam os principais eventos do ciclo celular. As mudanças cíclicas nos níveis proteicos de ciclinas resultam na montagem e na ativação cíclica dos complexos de ciclina-Cdk; por sua vez, essa ativação desencadeia eventos do ciclo celular. Classes de ciclinas: 1. As G1/S-ciclinas ativam Cdks no final de G1 e, com isso, ajudam a desencadear a progressão ao Início, esultando no comprometimento à entrada no ciclo celular. Seus níveis caem na fase S. 2. As S-ciclinas se ligam a Cdks logo após a progressão ao Início e ajudam a estimular a duplicação dos cromossomos. Os níveis das S-ciclinas permanecem elevados até a mitose, e essas ciclinas também contribuem para o controle de alguns eventos mitóticos iniciais. 3. As M-ciclinas ativam Cdks que estimulam a entrada na mitose no ponto de verificação G2/M. Na ausência de ciclinas, o sítio ativo da proteína Cdk é parcialmente ocultado por uma placa de proteína, como uma pedra bloqueando a entrada de uma caverna.A ligação da ciclina faz com que a placa se afaste do sítio ativo, resultando na ativação parcial da enzima Cdk.A ativação total do complexo de ciclina-Cdk ocorre, então, quando uma outra cinase, a cinase ativadora de Cdk (CAK), fosforila um aminoácido próximo à entrada do sítio ativo da Cdk.Isso causa uma pequena mudança conformacional que aumenta ainda mais a atividade da Cdk, permitindo que a cinase fosforila eficientemente suas proteínas-alvo e, desse modo, induz eventos específicos do ciclo celular. ● Proteólise cíclica O principal regulador da transição entre metáfase e anáfase é o complexo promotor da anáfase, ou ciclossomo (APC/C). O APC/C catalisa a ubiquitinação e a destruição de duas proteínas principais : Securina: que normalmente protege as ligações proteicas que mantêm os pares de cromátides-irmãs unidos no início da mitose. A destruição da securina na transição entre metáfase e anáfase ativa uma protease que separa as irmãs e desencadeia a anáfase. S-ciclinas e as M-ciclinas: são os segundos principais alvos do APC/C. A destruição dessas ciclinas inativa a maioria das Cdks da célula. O resultado é que muitas proteínas fosforiladas por Cdks da fase S ao início da mitose são desfosforiladas por várias fosfatases presentes na célula em anáfase. Essa desfosforilação de alvos das Cdks é necessária para a conclusão da fase M, incluindo as etapas finais da mitose e o processo de citocinese. Quando as G1 /S-Cdks são ativadas no final de G1 ,o APC/C é desligado, permitindo com isso o acúmulo de ciclinas para o início do próximo ciclo celular. ligase de ubiquitina chamada de SCF. Esta ubiquitina certas proteínas CKIs no final de G1, ajudando assim a controlar a ativação das S-Cdks e da replicação do DNA. O SISTEMA DE CONTROLE DO CICLO CELULAR FUNCIONA COMO UMA REDE DE INTERRUPTORES BIOQUÍMICOS Sinais externos e internos estimulam a ativação de G1-Cdk, que por sua vez estimula a expressão de genes que codificam G1 /S-ciclinas e S-ciclinas. A ativação resultante de G1 /S-Cdk conduz, então,a progressão ao ponto de verificação do Início. As G1/S-Cdks desencadeiam uma onda de atividade das S-Cdks, que iniciam a duplicação dos cromossomos na fase S e também contribuem para alguns eventos iniciais da mitose. A ativação das M-Cdks desencadeia, então, a progressão ao ponto de verificação G2 /M e aos eventos do início da mitose, levando ao alinhamento das cromátides-irmãs no equador do fuso mitótico. Finalmente, o APC/C, juntamente com seu ativador Cdc20, provoca a destruição da securina e de ciclinas na transição entre metáfase e anáfase, desencadeando assim a segregação das cromátides-irmãs e a conclusão da mitose. CHECKPOINT : controle de progressão do ciclo em 3 momentos. 1) Entre G1 e S: célula ira conferir se a sinalização mitogênica favorável 1) Entre G2 e início da Fase M: células confirmam se todo o seu conteúdo genético foi duplicado corretamente. 2) Entre Metáfase e Anáfase: a célula se certifica de que todos os cromossomos que foram duplicados estão corretamente ligados ao fuso mitótico. FASES DO CICLO CELULAR Interfase: G1, S, G2: Momento de crescimento celular ● Fase G1 - fase inicial - célula recebe estímulo mitogênico = inicia a duplicação do DNA. Intensa produção de proteínas e organelas que as células que serão necessárias na próxima fase do ciclo. Todo esse processo é desencadeado a partir do momento que o mitógeno, ao se ligar ao receptor na membrana da célula, desencadeia uma cascata de sinalização intracelular que ativa proteínas da família Ras e sequencialmente da família das MAP cinases. Proteínas reguladoras de transcrição gênica, como MYC, são ativadas e promovem a decodificação de diversas proteínas inclusive da ciclina G1. A partir do momento que a ciclina G1 é produzida, esta complexa-se com sua CDK e este complexo uma vez ativado irá agir fosforilando entre outros alvos, a proteína retinoblastoma (Rb). Ao ser fosforilada, a retinoblastoma torna-se inativa e assim deixa de inibir a proteína E2F, a qual é um fator de transcrição. Uma vez ativada a E2F vai promover a transcrição de vários genes relacionados a duplicação do DNA que ocorre na fase S. Entre os produtos dessa ativação estão a produção das ciclinas A e E e da CDK2 , que irão dar origem aos complexos ciclina S-CDK e ciclina G1/S-CDK. O complexo G1/S-CDK vai promover o avanço da célulapela fase G1, além de promover a ativação cada vez maior da E2F, num processo chamado de retroalimentação positiva. A partir do momento que o complexo S-CDK se tornar ativo a célula passa para fase S, mas isso só irá ocorrer caso a célula passe pelo seu primeiro checkpoint, sob o controle majoritário do G1/SCDK. Dessa forma, havendo um ambiente favorável para a multiplicação, este complexo também irá promover a degradação das proteínas inibidoras da fase S, permitindo que a célula avance para essa próxima etapa. ● Fase S Nessa fase o foco central é a duplicação de todo o DNA. Este processo além de ter que promover a geração de uma cópia idêntica de DNA, sem erros, só pode ocorrer uma única vez. Durante a fase S, a iniciação da replicação do DNA ocorre nessas origens, quando máquinas proteicas especializadas (às vezes chamadas de proteínas iniciadoras) desenrolam a dupla-hélice na origem e enchem os dois moldes de fita simples com enzimas de replicação do DNA. Isso leva à fase de alongamento da replicação, quando a maquinaria de replicação se distancia da origem em duas forquilhas de replicação. Para garantir que a duplicação dos cromossomos ocorra somente UMA vez por ciclo celular, a fase de iniciação da replicação do DNA é dividida em duas etapas distintas, que ocorrem em tempos diferentes do ciclo celular. 1. Final da mitose e início de G1 - complexo de proteínas iniciadoras (complexo pre replicativo - pré-RC) agrupa- se nas origens de replicação A iniciação da síntese de DNA é permitida somente em origens que contêm um pré- RC. 2. Início da Fase S - quando componentes do pré-RC nucleiam a formação de um complexo proteico maior, denominado complexo de pré-iniciação Esse complexo desenrola a hélice de DNA e transporta DNA-polimerases e outras enzimas de replicação às fitas de DNA, iniciando assim a síntese de DNA. Uma vez ativada a origem de replicação, o pre-RC é desmantelado e não pode ser remontado até a próxima G1. A montagem do pré-RC é inibida pela atividade das Cdks, e, na maioria das células, é estimulada pelo APC/C. Portanto, a montagem do pré-RC ocorre somente no final da mitose e no início de G1, quando a atividade de Cdk é baixa e a atividade de APC/C é alta. Assim, a duplicação de um cromossomo não é simplesmente uma questão de duplicar o DNA em sua essência, mas também requer a duplicação dessas proteínas da cromatina e sua montagem adequada no DNA. A produção de proteínas da cromatina aumenta durante a fase S para que sejam fornecidas as matérias-primas necessárias para empacotar o DNA recém-sintetizado. As S-Cdks estimulam um grande aumento da síntese das quatro subunidades de histonas. Estas subunidades são montadas nos nucleossomos no DNA por fatores de montagem de nucleossomos, que tipicamente se associam à forquilha de replicação e distribuem nucleossomos para ambas as fitas do DNA à medida que emergem da maquinaria de síntese de DNA. No final da fase S, cada cromossomo replicado consiste em um par de cromátides- irmãs idênticas. A coesão de cromátides-irmãs depende de um grande complexo proteico chamado de coesina. ● Fase G2 Nesta fase a célula ainda sob o comando do complexo S-CDK, irá apresentar alta síntese proteica para preparação dessa célula para a fase M. Entre as proteínas produzidas está a ciclina M (ciclina B) que irá se acumular na célula, e essa passa pelo seu segundo checkpoint. O complexo ciclina M-CDK só será fosforilado e assumirá sua conformação ativa após a célula passar por esse checkpoint, certificando-se que todo seu DNA foi duplicado corretamente e liberando a célula para a próxima fase. Fase M: Prófase,Prometáfase,Metafase,Anafase,Telofase,Citocinese As cromátides-irmãs sao separadas e segregadas a um par de núcleos-filhos idênticos, cada um com a sua própria cópia do genoma. A M-Cdk ocasiona todos os rearranjos celulares que ocorrem nos estágios iniciais da mitose. - aciona a condensação dos cromossomos replicados em estruturas semelhantes a bastões compactos preparando-os para segregação. - induz também a montagem do fuso mitótico que separará os cromossomos condensados e os segregará para suas células-filhas. - Em células animais, a M-Cdk também promove a desintegração do envelope nuclear. A ativação de M-Cdk inicia com o acúmulo de M- ciclina. É esse acúmulo abrupto de M-CDK ativado que irá dar início a mitose. Os complexos M-Cdk são formados ainda inativos, e sua ativação súbita no final de G2 é acionada pela ativação de uma proteína- fosfatase (Cdc25) que remove as fosfatases inibidoras que mantêm a atividade das Cdks bloqueada. Uma vez ativada, cada complexo M-Cdk pode ativar indiretamente mais M-Cdk, ao fosforilar mais Cdc25. ● PRÓFASE Caracteriza pela condensação gradual das fibras de cromatina, que vão progressivamente tornando-se mais curtas e espessas, até formar cromossomos. O processo torna os cromossomos visivelmente individualizados e nitidamente compostos por seus dois elementos longitudinais idênticos, as cromátides-irmãs, Enquanto isso, no citoplasma, centrossomos agem na formação do fuso mitótico. - Os centrossomos são estruturas que, nas células animais, são constituídas por um par de centríolos (denominado diplossomo) e um material pericentriolar amorfo e eletrondenso, a partir do qual emanam fibras de microtúbulos radiais. 1. Migração dos centrossomos para os polos opostos da célula promovida pelas proteínas motoras dineína e cinesina. 2. polimerização dos microtúbulos a partir desses centrossomos de modo a ancorar eles na membrana plasmática e um em direção ao outro, apresentando nesses feixes de microtúbulos a presença das proteínas. 3. inicia a construção do fuso mitótico. 4. cromossomos nessa etapa começam a se condensar ainda mais. ● PROMETÁFASE E vista a chegada dos centrossomos nos polos opostos da célula e a desintegração completa da membrana nuclear. A desintegração da carioteca acontece em decorrência da fosforilação de proteínas que compõem a membrana e dos poros nucleares. Todas essas fosforilações desestabilizam a estrutura do núcleo e esse se fragmenta em vesículas. Com a desintegração da membrana do núcleo não há mais a separação entre o núcleo e o citoplasma e assim os microtúbulos que estão sendo polimerizados e estão formando o fuso mitótico no citosol, podem se ligar aos cromossomos. os cromossomos não ficam aguardando essa nucleação dos microtúbulos de forma passiva, eles também promovem essa nucleação ao redor deles ao levar a ativação de proteínas da família RAN GTPase, uma vez que na própria cromatina há um fator de troca do nucleotídeo guanina (GEF) que vão promover nessas proteínas a troca de GDP por GTP. Uma vez ativadas, as proteínas RAN GTPases liberam proteínas estabilizadoras de microtúbulos de complexos proteicos no citosol. Com todos esses estímulos, os microtúbulos se conectam aos cromossomos na região do cinetócoro, presente em cada uma das cromátides-irmãs. O cinetocoro é um grande complexo de proteínas que não só são sítios de ligação desses microtúbulos como vão determinar a ligação correta desses microtúbulos aos cromossomos. A prometáfase então é finalizada com os cromossomos sendo conectados ao fuso mitótico. ● METÁFASE Marcada pela localização dos centrossomos nos pólos opostos da célula e pelo alinhamento das cromátides- irmãs no plano equatorial dela. Formando a placa metafásica. O alinhamento das cromátides na placa metafásica, através do fuso mitótico, garante ao processo de divisão celular, que o conteúdo genético, duplicado na interfase, seja distribuído de forma homogênea para ambas as células filhas. A ligação aos polos opostos, chamadade biorientação, gera tensão sobre os cinetócoros, que estão sendo puxados para direções opostas. Essa tensão sinaliza para os cinetócoros-irmãos de que eles estão ligados de forma correta e estão prontos para serem separados. Todos esses eventos verificados até aqui foram coordenados e comandados majoritariamente pelo complexo M-CDK, mas no final da metáfase esse complexo ativa a proteína cdc20 e esta promove a ativação do complexo proteico chamado de complexo promotor da anáfase/ciclossomo, ou APC/C. Essa ativação vai promover o avanço da célula para a próxima fase. ● ANÁFASE Começam os eventos finais da mitose, quando ocorre a ruptura do equilíbrio metafásico, com a separação e a migração das cromátides- irmãs, que passam a ser chamadas de cromossomos filhos. A partir da anáfase a progressão do ciclo celular irá se dar sob o comando do complexo proteico APC/C que é integrante da família das proteínas ubiquitinases. A liberação das cromátides-irmãs, que permite sua segregação, decorre da degradação da coesina centromérica por uma proteína chamada separase. Uma vez que as cromátides-irmãs se separam, elas são puxadas para o polo do fuso ao qual estão ligadas. O movimento é consequência de dois processos independentes que envolvem diferente partes do fuso mitótico. Os dois processos são denominados anáfase A e anáfase B e ocorrem mais ou menos simultaneamente. 1) Anafase A os microtúbulos do cinetócoro, encurtados pela despolimerização, e os cromossomos ligados se movem em direção aos polos. A força que coordena os movimentos da anáfase A é fornecida, principalmente, pela ação das proteínas motoras associadas aos microtúbulos que se localizam no cinetócoro, auxiliadas pelo encurtamento dos microtúbulos do cinetócoro. 2) Anáfase B Os pólos do fuso se distanciam contribuindo para a segregação dos dois conjuntos cromossômicos. Assim, no final da anáfase, os cromossomos duplicados na fase S estão dispostos nos pólos opostos da célula. ● TELÓFASE Eventos são voltados a restabelecer a individualidade das células. Ocorrem, então, a reconstituição dos núcleos e a divisão citoplasmática, levando à formação das células-filhas. A descondensação da cromatina, acompanhada da reaquisição da capacidade de transcrição, a reorganização dos nucléolos e a reconstituição do envoltório nuclear. Esses eventos ocorrem pela inativação do complexo ciclina-Cdk, que foi responsável por iniciar a mitose fosforilando determinadas proteínas celulares. ● CITOCINESE Ela consiste na separação do citoplasma das duas células filhas geradas. Caracterizada pelo aparecimento de um sulco na superfície celular. Esse sulco aparece devido à ação do anel contrátil que é formado na região do citoplasma da célula logo abaixo da membrana plasmática e é constituído principalmente por filamentos de actina e miosina tipo II A clivagem avança a partir de contrações dos filamentos de actina e miosina, puxando a membrana plasmática para dentro e, finalmente, separando a célula pela metade. CONTROLE DA DIVISÃO E DO CRESCIMENTO CELULAR O tamanho de órgãos e do corpo é determinado por três processos celulares fundamentais: crescimento, divisão e morte. Cada um é fortemente regulado – tanto por programas intracelulares como por moléculas-sinal extracelulares que controlam esses programas. As moléculas-sinais extracelulares que regulam o tamanho celular e o número de células geralmente são proteínas secretadas solúveis, proteínas ligadas à superfície das células ou componentes da matriz extracelular. Elas podem ser operacionalmente divididas em três classes principais: 1. Mitógenos, que estimulam a divisão celular, fundamentalmente desencadeando uma onda de atividade de G1/S-Cdk que atenua controles intracelulares negativos que, de outra maneira, bloqueariam a progressão ao ciclo celular. 2. Fatores de crescimento, que estimulam o crescimento celular (aumento da massa celular) ao promover a síntese de proteínas e outras macromoléculas e ao inibir sua degradação. 3. Fatores de sobrevivência, que promovem a sobrevivência celular ao suprimir a forma de morte celular programada conhecida como apoptose. OBJETIVO 02 PESQUISAS COM CÉLULAS-TRONCO: ASPECTOS CIENTÍFICOS, ÉTICOS E SOCIAIS O que são células tronco? - São tipos de células que podem se diferenciar em células com funções muito especializadas, constituindo diferentes tipos de tecidos do corpo. - são células que têm o potencial de recompor tecidos danificados e, assim, auxiliar no tratamento de doenças como câncer, mal de Parkinson, mal de Alzheimer e doenças degenerativas e cardíacas. Propriedades fundamentais das células tronco a) Auto-renovação - ocorre por mitose;geração de células idênticas de si mesmas. O importante, nesse caso, é que a população dessas células pode manter seu número mais ou menos constante, mesmo quando parte delas segue o caminho da diferenciação (ou seja, o organismo mantém um “estoque” permanente daquelas células-tronco). b) Proliferação - também por mitoses, garante um número adequado de células-tronco num dado local do organismo, em um determinado momento de seu desenvolvimento. c) Diferenciação - Permite o surgimento de tipos celulares distintos, em termos morfológicos e funcionais e, por extensão, de tecidos e órgãos especializados.O processo de diferenciação é regulado pela expressão preferencial de genes específicos nas células-tronco, mas ainda não se sabe em detalhes como ocorre. Já dissemos que a célula-tronco por excelência é o zigoto célula totipotente, isto é, capaz de formar tanto o embrião (e, portanto, todo o organismo adulto) como também uma estrutura extraembrionária, a placenta. células-tronco pluripotentes são capazes de dar origem a todas as estruturas do embrião, mas não aos tecidos placentários. multipotentes capazes de dar origem a um número menor de células especializadas) e destas para as células progenitoras. As células progenitoras já não podem ser consideradas como células-tronco, pois ao se dividir não produzem outras células progenitoras similares. A partir dos galhos mais grossos (células- tronco pluripotentes), os ramos vão se bifurcando (células-tronco multipotentes) e ficando cada vez mais finos (células progenitoras), até chegarem às folhas (que representam os tipos celulares já completamente diferenciados). Mais recentemente, pesquisas feitas com célulastronco adultas do corpo humano indicaram uma certa capacidade de transformação de um tipo celular em outros, quando a célula-tronco é submetida a procedimentos diversos. Assim, por exemplo, demonstraram-se, entre outras, as seguintes transformações: • de células-tronco neurais em músculo; • de células-tronco do tecido adiposo em cartilagem, osso e músculo; • de células-tronco da medula óssea em músculo, células nervosas, fígado, osso, cartilagem e gordura. Aplicações médicas potenciais de células-tronco A medicina regenerativa ou terapia celular procura empregar células-tronco embrionárias ou de adultos, dirigindo sua diferenciação no sentido de um tecido específico para repor ou reparar tecidos lesados ou destruídos, como a recuperação de tecido neurológico (doença de Parkinson, lesão da medula espinal), tecido endócrino do pâncreas (diabete), células musculares e vasos cardíacos (insuficiência cardíaca, enfarte). OBJETIVO 04 A polêmica da utilização de células-tronco embrionárias com fins terapêuticos Carlos Augusto Takeuchi No Brasil, a Lei Federal 11.105, de 24 de março de 2005, regulamentou as pesquisas nessa área e permite o uso de célula-tronco embrionária parapesquisa e terapia. Essas células devem ser obtidas de embriões humanos produzidos por fertilização in vitro, não utilizados no procedimento, devem ser embriões inviáveis e que tenham sido mantidos congelados por mais de três anos. É obrigatória a obediência às seguintes condições: - haver consentimento dos genitores, bem como a submissão prévia dos projetos à apreciação - aprovação dos respectivos comitês de ética em pesquisa. Vale ressaltar que a clonagem humana foi proibida pela mesma lei. O senador Eduardo Girão (Podemos-CE) apresentou um projeto de lei, o PL 5.153/2020, que proíbe, para quaisquer fins, a utilização de células-tronco obtidas de embriões humanos. Na justificativa do projeto, o senador reconhece que as células-tronco adultas, na medicina, representam uma importante ferramenta terapêutica para doenças graves, a exemplo de linfoma, leucemia e mielodisplasia. Além de, no âmbito de pesquisas científicas, abrirem perspectivas para o desenvolvimento de novos tratamentos para doenças como o mal de Parkinson. Contudo, Girão destacou a necessidade de se proibir o uso de células-tronco embrionárias em pesquisas, pois, para serem extraídas, ocorre a destruição e morte dos embriões humanos. “Os Comitês de Ética em Pesquisa em seres humanos (CEP) são institutos que, além de protegerem o participante da pesquisa, fazem o balanço entre os riscos e benefícios previstos da pesquisa, esclarecendo ao investigador as normas de conduta aceitas da sociedade” Por conta das restrições legislativas para se trabalhar com as células-tronco embrionárias, os pesquisadores do Centro de Terapia Celular (CTC) encontraram uma possibilidade. “As pesquisas conseguiram avançar através das células iPSC (células-tronco pluripotentes induzidas), que vêm se consolidando como uma alternativa à altura das células-tronco embrionárias, sem a necessidade da manipulação de embriões humanos”, afirma Solano. O CTC é autorizado pela ANVISA para produzir as células-tronco para o uso em estudos clínicos.
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