Estudo da Polifenoloxidase (PPO) extraída da batatinha

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Estudo da Polifenoloxidase (PPO) extraída 
da batatinha 
Polifenoloxidases (PPO) – Enzimas 
oxidorredutases que atuam em fenóis 
ortoquinonas na presença de oxigênio 
molecular. 
Grande impacto na indústria de alimentos -> 
principal enzima envolvida no escurecimento de 
produtos durante o processamento. 
 
 
 
 
 
 Polifenoloxidase (PPO) – enzima 
cúprica que catalisa dois tipos de 
reações envolvendo oxigênio. 
 1° Hidroxilação de monofenóis, 
formando ortodifenóis; 
 2° oxidação de ortodifenóis, formando 
ortoquinonas. 
 
Ortoquinonas polimerizam-se facilmente 
formando compostos escuros, denominados 
melaninas. 
 Compartimentalização da PPO 
A PPO está compartimentalizada nos 
plastídeos, ficando limitada quanto ao acesso 
dos substratos; 
 
Há compostos fenólicos na parede celular e 
no vacúolo, quando a célula é rompida (ex. 
do corte das frutas), ocorre contato com o ar, 
e os substratos fenólicos podem ser 
oxidados pela PPO resultando no 
escurecimento. 
Importante na defesa vegetal, as ortoquinonas atuam 
como barreiras contra penetração de microrganismos. 
 Especifidade da PPO 
 
 Fatores que influenciam nas 
reações enzimáticas 
 
 
 
 
 
 
 
 
Introdução 
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Entender a ação enzimática e suas 
características, como especificidade pelo 
substrato e efeito da temperatura. 
 Preparar um extrato enzimático, 
 Montar um ensaio enzimático, 
 Conhecer os fatores que afetam a 
atividade enzimática e saber como 
controlá-los, 
 Verificar a especificidade da PPO em 
relação aos substratos enzimáticos, 
 Verificar o efeito da temperatura na 
atividade da PPO. 
 Preparo do extrato de PPO 
 
 
 
 Efeito da temperatura 
 Banho fervente 
 
 Banho de gelo 
Objetivo Geral 
Objetivos Específicos 
Material 
Cuidados Necessários 
Métodos 
Resultados e Discussão 
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Banho de Fervura: a enzima desnaturou e a 
amostra ficou com o mesmo aspecto 
transparente do controle negativo. 
Banho de Gelo: a amostra ainda apresentou 
coloração, mas mais clara pela diminuição da 
atividade enzimática. Só que elas não foram 
desnaturadas. 
 
 
 
1. Trituração da batata 
Primeiramente deve-se descascar a batata, 
batê-la no liquidificador e depois filtrar e 
deixar em repouso por 5 minutos. O extrato 
foi colocado no tampão 0,1 mol L-1, para 
manter o pH adequado para a enzima. 
Posteriomente, coloca-se o béquer em 
banho de gelo para evitar que a enzima seja 
alvo de outras enzimas. 
2. Pipetagem dos substratos 
Os tubos de ensaio foram enumerados (1-
11) e pipetou-se 1 mL dos substratos em 
cada, de acordo com a tabela abaixo. Sendo 
1 controle negativo (com 1 mL de água) e 1 
controle positivo (com o substrato PPO). 
 
Após a pipetagem, os tubos foram colocados 
em banho-maria a 37°C por 5 minutos. 
3. Pipetagem da enzima 
polifenoloxidase (PPO) 
Sem retirá-los do banho foi adicionado 1 mL 
do extrato da PPO e ficou descansando por 
5 minutos para que a enzima tivesse tempo 
de agir sobre os possíveis substratos. 
 
 
 
 
 
Tubos controles 
Controle 
Positivo/Negativo 
Tubo 2 Ácido cafeico 
Tubo 3 Hidroquinona 
Tubo 4 Ácido quínico 
Tubo 5 Glicosa 
Tubo 6 Floroglucinol 
Tubo 7 Resorcinol 
Tubo 8 Ácido gálico 
Tubo 9 Catecol 
Tubo 10 Fenol 
Tubo 11 Tirosina 
Aula Prática 
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4. Comparação dos substratos com o 
controle positivo e negativo 
Substratos 
Intensidade relativa de 
coloração 
Controle Positivo +++ 
Controle Negativo - 
Ácido cafeico + ou ++ 
Hidroquinona + ou ++ 
Ácido quínico - 
Glicose - 
Floroglucinol - 
Resorcinol - 
Ácido gálico - 
Catecol +++ 
Fenol - 
Tirosina - 
 
5. Comparação entre a atividade 
enzimática em diferentes temperaturas 
Seguindo com os experimentos, foi realizado 
uma comparação entre a atividade enzimática 
em três temperaturas distintas: Banho de gelo 
(aproximadamente 4°C), temperatura de 37°C 
(ideal para a atividade dessa enzima) e banho 
fervente (100°C). 
Primeiro separou-se 1 mL de água (controle 
neg.), 1mL do substrato (controle pos.) e 1mL 
da enzima + 1mL da enzima. 
Foram numerados 4 tubos de ensaio, 1 e 2 com 
água e catecol e 3,4 com extrato de PPO e 
deixados em banho de gelo por 5 minutos e em 
banho fervente por 5 minutos para serem 
comparados. O extrato de PPO foi misturado 
com nos tubos 1 e 2 após tempo suficiente nas 
temperaturas indicadas. 
 
 Temperatura Resultado 
Catecol 
4° 
Teve reação, mas 
menos que em 37°C 
100° Não houve reação 
 
Por meio da análise da tabela e do gráfico foi 
possível perceber que no banho de gelo houve 
uma reação de pequena intensidade, isso 
ocorreu pois as colisões entre a enzima e o 
substrato foram menos frequentes devido a 
baixa temperatura. 
 
 
No banho fervente, a enzima não foi capaz 
de atuar pois teve sua estrutura desnaturada 
e perdeu sua capacidade catalítica, devido a 
alta temperatura, impedindo a reação da 
enzima com o substrato.