Aula 1 - Obtenção e produção de enzimas

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ENZIMOLOGIA
Universidade Federal de Juiz de Fora
Faculdade de Farmácia
Disciplina: Tecnologia das Fermentações e Enzimologia
Enzimologia: é a ciência que
estuda as enzimas e os fatores
relacionados às suas ações
Histórico
 Há mais de 2000 anos a.c. → 
pão, queijo, cerveja e vinho
• Década de 1830 → preparado extraído do malte
da cevada (enzima diastase) capaz de hidrolisar o
amido por conter a malte amilase
• Isolamento da pepsina a partir do extrato do
tecido estomacal
Presença de de substâncias em tecidos animais e 
vegetais com capacidade de digestão
Histórico
Louis Pasteur
O processo fermentativo era
dependente da presença de
microrganismos – Teoria do
Vitalismo
Justus von Liebig
O processo fermentativo trata-
se de um processo estritamente
químico
Eduard Buchner
Demonstrou que a produção de etanol a partir do açucar poderia ser 
obtida através de macerado de células de levedura filtrado (ausência de 
células no extrato)
William Kuhne → “enzyme” – dentro da levedura
Enzimas: macromoléculas protéicas que atuam
como catalisadores biológicos
Reações químicas → Teoria das colisões – moléculas presentes em uma solução
devem colidir e a colisão deve levá-las a adquirir uma quantidade mínima de
energia que lher permita atingir um estado reativo chamado ESTADO DE
TRANSIÇÃO
Energia de ativação: necessária para
levar todas as moléculas de um mol de
um substância até o estado de
transição
Aumento da velocidade das reações
 Aumento do número de moléculas em solução;
 Aumento do número de choques entre as moléculas;
 Diminuição da barreira imposta pela energia de ativação
Catalisadores biológicos - ENZIMAS
atuam na redução da energia de ativação
aumentam a velocidade da reação sem alterar a
proporção de reagentes e produtos encontrada no final da
reação
participam ativamente da reação, sofre alterações na
estrutura e retorna à sua forma original no final da reação
Enzimas – Catalisadores biológicos
Enzimas – Catalisadores biológicos
 Reações químicas catalisadas por enzimas tem velocidades MUITO
altas ( 106 a 1012 vezes maiores que as não catalisadas)
 Eficácia das enzimas é maior que a dos catalisadores orgânicos
VANTAGENS DAS ENZIMAS
Altamente específicas (forma complementar, carga e
características hidrofílicas/hidrofóbicas);
Sintetizadas pelas próprias células onde atuam;
Concentração celular variável de acordo com as condições
fisiológicas;
Podem ser reguladas através de fatores extrínsecos à reação
(ativadores e inibidores)
“
Enzimas – Catalisadores biológicos
Ação catalítica das enzimas
enzima
Composto A (substrato)
Composto B (produto)
Centro ativo ou sítio catalítico:
porção da molécula onde ocorre a
atividade catalítica
Observe que não há consumo ou
modificação permanente da enzima
Reação 
catalisada pela 
enzima
Especificidade Enzima-Substrato
O substrato se liga à enzima por ligação não covalentes
(interações eletrostáticas, pontes de hidrogênio, interações
de van der Waals e interações hidrofóbicas)
Uma das explicações da especificidade das enzimas é de
que suas estruturas tridimensionais permitem um encaixe
perfeito com o substrato
Existem dois modelos propostos para explicar a
especificidade das enzimas:
Modelo chave-fechadura
Modelo encaixe induzido
Especificidade Enzima-Substrato
 Modelo chave-fechadura (Fisher, 1890): As
enzimas são estruturas rígidas que permitem a inserção de
substratos somente com uma determinada configuração.
Especificidade Enzima-Substrato
 Modelo do encaixe induzido (Koshland, 1958):
 Os sítios ativos das enzimas não estão completamente pré-formados e a
interação inicial com o substrato com a enzima induz uma alteração
conformacional na enzima promovendo um melhor encaixe;
Ocorre um reposicionamento dos aminoácidos catalíticos da enzima para
interagir com os grupos funcionais do substrato
Inibição da atividade enzimática
• o inibidor é análogo
estrutural do substrato e
compete com ele pela
ligação ao sítio ativo
• com aumento da [ ] do
substrato ocorre diminuição
da inibição caracterizando
uma competição entre
substrato e inibidor
•o inibidor não possuiu
qualquer semelhança com a do
substrato.
•A inibição se dá pela ligação
fora do sítio ativo (no centro
alostérico) alterando o centro
ativo da enzima
•O aumento da [ ] do substrato
não diminui a inibição
Inibição da atividade enzimática
INIBIÇÃO NÃO COMPETITIVAINIBIÇÃO COMPETITIVA
Regulação da atividade enzimática
Controle da velocidade da reação enzimática
Regulação da síntese da enzima → processo de transcrição
do gene que codifica a enzima inibindo ou induzindo a
síntese
Modulação da atividade da enzima → para enzimas já
sintetizadas
Modulação
da atividade
da enzima
1) Regulação alostérica
2) Modificação covalente
Regulação da atividade enzimática
1) Regulação alostérica
Ligação de compostos a sítios alóstéricos (diferente do sítio ativo) da
enzima que modifica a estrutura da enzima podendo AUXILIAR ou
PREJUDICAR a catálise
 Efetuador alostérico positivo  Efetuador alostérico negativo
CONTROLE DO METABOLISMO!!!!
 Mecanismo de feedback
Regulação da atividade enzimática
1) Regulação alostérica
Inibição por
“Feedback”
Regulação da atividade enzimática
“Conta uma lenda nórdica que o capitão de um navio roubou a um feiticeiro um
moinho mágico, que moía aquilo que o seu amo mandasse. Tendo necessidade de
sal, mandou ao moinho produzi-la. O moinho começou a moer sal, até encher o
navio. O infeliz capitão, embora soubesse como pôr o moinho a trabalhar, não
sabia a palavra mágica necessária para o fazer parar, e o peso do sal arrastou o
navio, com o capitão, os marinheiros e o moinho para o fundo do mar. Lá
continuou a moer sal, e ainda hoje continua. É por isso que a água de mar é
salgada...
Seja a história verdadeira ou não, ensina claramente a necessidade de saber parar
quando é necessário. Uma enzima é apenas um catalisador, uma molécula que
não decide o que deve ou não fazer. Poderia, portanto, acontecer algo parecido à
triste história do capitão distraído, e a célula morrer afogada nos produtos de
alguma reação enzimática.”
Regulação da atividade enzimática
2) Modificação covalente
Ligação covalente de um grupo químico à estrutura da enzima acarretando em
mudança da conformação da enzima inativando-a ou formando um sítio ativo
funcional
Ex: fosforilação
Fatores que alteram a atividade enzimática
1. Condições do meio que afetam a estabilidade da enzima
pH
Temperatura
2. Tempo da reação
3. Concentração dos reagentes
Enzima
Substrato
Co-fatores
Influência do meio sobre a atividade enzimática
 pH
•Valor ótimo – geralmente próximo do neutro
•A influência do pH é exercida sobre os grupos dissociáveis dos aminoácidos
que podem fazer parte do sítio ativo
• Enzima e substrato devem ter conformação e carga adequadas para a interação
%
 a
ti
v
id
a
d
e
 e
n
z
im
á
ti
c
a
 m
á
x
im
a
pH ótimo=1,5 pH ótimo=6,8 pH ótimo=9,9
Influência do meio sobre a atividade enzimática
Temperatura
•Aumento da temperatura → aumento da energia cinética e da
probabilidade de choque entre as moléculas → aumento da velocidade
da reação
• Temperaturas acima da temperatura ótima provocam rompimento das
ligações químicas prejudicando a estrutura espacial da enzima →
DESNATURAÇÃO
Influência do meio sobre a atividade enzimática
 Desnaturação: perda da estrutura que propicia a função da proteína
Agentes desnaturantes
Temperatura
pH : protonação ou desprotonação de grupos
Detergentes: contém porções hidrofóbicas que
interferem nas interações entre os grupos
Solventes apolares: mudam a constante
dielétrica do meio, alteram a força das ligações
eletrostáticas
Co-fatores e coenzimas
Muitas enzimas necessitam da associação com outras
moléculas ou íons para exercer o papel catalítico. Essas
moléculas são chamadas de CO-FATORES
CO-FATOR
 Íons metálicos
 Coenzimas: moléculas orgânicas
não protéicasCo-fatores e coenzimas
1)Íons metálicos
 Metais de transição: Fe+2, Zn+2 e Cu+2
 Metais alcalinos e alcalinos terrosos: Na+, K+, Mg+2 e Ca+3
 São eletrófilos efetivos que participam na orientação do substrato para a 
reação
ANIDRASE 
CARBÔNICA
Co-fatores e coenzimas
2) Coenzimas
 Moléculas orgânicas pequenas geralmente derivadas de vitaminas
 Pode ser ligada à enzima como grupo prostético(ex: FAD) ou se
unir à enzima no momento da catálise (ex: NAD)
 Coenzima e substrato ficam alojados no centro ativo da enzima e
a reação consiste na remoção de um grupo do substrato e sua
transferência para a coenzima ou vice-versa
Enzima ativaGrupo protéico
inativo
Co-fatores e coenzimas
Co-fatores e coenzimas
Classificação das enzimas
1) Oxidorredutases: reações de óxido-redução;
2) Transferases: reações de transferência de grupos de uma
molécula a outra;
3) Hidrolases: reações de hidrólise;
4) Liases: catalisam a clivagem de ligações C-C, C-O, C-N,
entre outras, através de hidrólise ou oxidação. ;
5) Isomerases: reações de mudança intramolecular em que o
substrato é transformado em um produto isômero
6) Ligases: ligação covalente de moléculas com simultânea
quebra de uma ligação de alta energia
Código da Enzima (EC number –
Enzyme Comission)
Composto por 4 algarismos:
1o - refere-se a classe da enzima (1-6);
2o - refere-se a subclasse (tipo de ação ou grupo sobre o qual atua);
3o - refere-se a classe subclasse;
4o - refere-se ao número de ordem da enzima dentro da subclasse
considerada.
Ex: enzima tripéptido aminopeptidase tem o código EC 3.4.11.4
3 por hidrolase (enzima que usa a água para catalisar algumas
moléculas),
3.4 por hidrolase, que atua sobre as ligações peptídicas,
3.4.11 por aquelas que atuam sobre o amino-terminal de
aminoácidos de um polipeptídeo,
3.4.11.4 por aquelas que atuam sobre o amino-terminal final de um
tripeptídeo.
Atividade Enzimática
Atividade → avaliada pela velocidade da reação que a
enzima catalisa
A velocidade da reação é expressa em Unidades
Internacionais (U), que é a quantidade de enzima capaz
de formar 1 µmol de produto por minuto em condições
ótimas de ensaio definidas (pH, temperatura, etc).
Atividade específica → número de Unidades de enzima
por miligrama de proteína. É um parâmetro que permite
a comparação com outras preparações e com etapas
posteriores do processo de purificação. Serve como um
controle do processo de purificação.
 Estudo da velocidade da reação
enzimática e como ela se altera em
função de diferentes parâmetros
 Estudo da ação catalítica das
enzimas
Cinética das reações enzimáticas
Cinética das reações enzimáticas
 Objetivos
a) Medir as velocidades das transformações;
b) Estudar a influência das condições de trabalho (pH,
temperatura, [ ] de reagentes e enzimas, etc) naquelas
velocidades;
c) Correlacionar as velocidades das transformações com
alguns fatores que as afetam;
d) Colaborar na otimização do processo;
e) Estabelecer critérios para o controle do processo;
f) Projetar o reator mais adequado.
Cinética das reações enzimáticas
A velocidade da reação é função crescente da concentração do
substrato até um determinado valor dessa concentração, mantendo-se
praticamente constante para concentrações de substrato superiores a esse
valor
Cinética das reações enzimáticas
Cinética das reações enzimáticas
Quanto menor for o valor de Km , maior a velocidade de 
ligação da enzima com o substrato
Cinética das reações enzimáticas
Km → É a CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO onde se
obtém metade da VELOCIDADE MÁXIMA da reação
Construção dos gráficos e determinação 
de Km e Vmáx. 
Análise gráfica de Vmáx e Km
Primeiro gráfico: Vo x [S]
 gráfico a partir dos valores da tabela
Vmáx.
½ 
Vmáx
Km
Segundo Gráfico: inverso do anterior
 Gráfico a partir dos valores inversos da tabela
Achando a Velocidade Máxima e o Km
 Depois de encontrar a equação da reta, é possivel calcular a
Vmáx e o Km através dos valores de X eY:
 Y = 3,768x + 2,0993 (Equação da reta)
 -0,557 quando Y = 0 e 2,099 quando X = 0
Referências
 Borzani W, Schmidell W, Lima UA, Aquarone E.
Biotecnologia Industrial . Fundamentos.Volume I.
Engenharia Bioquímica. São Paulo: Editora Blucher,
2001, 254 p.
 Lima UA, Aquarone E, Borzani W, Schmidell W.
Biotecnologia Industrial . Processos fermentativos
e enzimáticos.Volume III. Engenharia Bioquímica.
São Paulo: Editora Blucher, 2001, 254 p.
Obtenção e produção
de enzimas
Universidade Federal de Juiz de Fora
Faculdade de Farmácia
Disciplina: Tecnologia das Fermentações e Enzimologia
Enzimas comercializadas
 A maioria das enzimas aplicadas industrialmente são
hidrolases as quais despolimerizam substâncias naturais
Hidrolases (75%)
Proteases (40%): indústrias de
detergentes, alimentos, couros e
farmacêutica
Carboidrases: panificação, cervejarias,
indústrias de amido, têxteis e de papel
Aplicações de enzimas
 Principais indústrias consumidoras de enzimas
Obtenção de enzimas
Origem vegetal → Obtidas nos sucos, sementes, polpas,
raízes, entre outras partes do vegetal por trituração do tecido
Ex: papaína, bromelina, ficina e amilases
Origem animal → Extraídas de tecidos como mucosa gástrica,
pâncreas, fígado, glândulas, sangue.
Ex: pepsina, quimiotripsina, tripsina, elastase, amilases, lipases,
hialuronidase e catalase
Origem microbiana → obtidas por cultura de bactérias,
fungos e leveduras. Possuem grande importância comercial:
Mais utilizadas, menor custo e tempo de produção, provém de
microrganismos selecionados, maior especificidade
Enzimas de origem vegetal
Papaína
Obtenção: látex do fruto verde do mamão (Carica
papaya), além de folhas e talos
Possui alta atividade proteolítica
É facilmente inativada por oxidação (necessidade de
agentes redutores como sulfeto de hidrogênio, etc)
Extraída principalmente como incisões longitudinais na
casca e como prensado do fruto, folhas e talos
Aplicações: clarificação da cerveja, amaciamento de
carnes, auxiliar da digestão
Enzimas de origem vegetal
Bromelina
Obtenção: presentes no caule e fruto do abacaxi. É obtida
do caule após moagem, prensagem, filtração e precipitação
do suco do talo
A bromelina contém várias proteases que diferem entre si
na ação em diversos substratos de acordo com variações no
pH
Aplicação: amaciamento de carnes, clarificação da cerveja e
auxiliar na digestão
Enzimas de origem vegetal
Ficina
É uma protease presente no látex de certas espécies de Ficus
Possui aplicações similares às da papaína
A papaína é mais utilizada comercialmente que a ficina
devido ao menor custo e maior disponibilidade
Enzimas de origem vegetal
Malte
O malte é o resultado do processo de germinação dos grãos (cevada,
trigo ou centeio). O malte é utilizado na produção de bebidas alcoólicas
Produção do malte:
1a Etapa: encobrir os grãos com uma camada de água (10-15 oC) por 2 a
3 dias
2a Etapa: germinação e formação das enzimas que compõem o malte tais
como as α-amilases e β-amilases, proteases, lipases, diastase e
hemicelulases
3a Etapa: secagem para paralizar a atividade biológica do grão e reduzir o
teor de umidade a níveis ideais para o armazenamento. É durante a etapa
de secagem que o aroma típico do malte é produzido
Enzimas de origem animal
Pancreatina, tripsina, pepsina, renina, quimotripsina e catalase
→ grande importância industrial
Os tecidos são secos, triturados em partículas pequenas e
finas e os tecidos ainda úmidos são totalmente desintegrados,
através de moinhos ou homogeneizadores
Os materiais são extraídos com água ou solução tampão e
os resíduos insolúveis eliminados por filtração ou
centrifugação
Enzimas de origem animal
Pancreatina
 Preparada a partir do pâncreas de porco
Apresenta atividade amilolítica, proteolítica e lipolítica
 Contém tripsina e quimotripsina
(duodeno)
Enzimas de origem animal
Pepsina
 Obtida a partir da mucosa do estômago de porco
Tratamento com ácidopara ativação do pepsinogênio a 
pepsina
 Precipitação com etanol
 Secagem em baixa temperatura
Enzimas de origem animal
Renina (coalho)
 É uma protease gástrica ácida
 Presente no suco gástrico do abomaso de bezerrros
 Extraída principalmente de bezerros lactentes
 Comercializada na forma líquida, em pó ou em pastas
Aplicação: fabricação de queijos e preparação de pudins
Atualmente, a maioria da renina comercial é produzida a partir
de leveduras (fungos unicelulares) ou bactérias geneticamente
modificadas
Enzimas de origem animal
Catalase
 Obtida a partir do fígado e sangue de animais, bem como
de fungos e bactérias
A catalase é comercializada pode ser comercializada na
forma líquida adicionada ou não de estabilizante (glicerol), na
forma de pó liofilizado ou cristalizada
Aplicação: indústria de alimentos para decomposição da
água oxigenada (sabor e cor do alimento); inibir o
desenvolvimento microbiano em vinhos; como antioxidante
em alimentos líquidos ou viscosos (maionese, manteiga, etc.)
Enzimas microbianas
Mais utilizadas em escala industrial;
Menor tempo e custo de produção;
Provenientes de microrganismos selecionados;
Apresentam maior especificidade
 Produção de enzimas em escala industrial → fermentação
submersa
 Em países orientais há uma tradição de utilização da
fermentação semi-sólida
 Utilização de resíduos agroindustriais de baixo custo em
processos fermentativos
Enzimas microbianas
Cultura Submersa Cultura Semi-sólida
 Maior controle do processo
 Adequada para microrganismos 
recombinantes
 Maior rendimento
 Necessidade de maior espaço
 Menor rendimento
 Dificuldades no aumento de
escala e controle das variáveis
 Vantagem: utilização de
resíduos industriais de baixo
custo
 Baixo gasto de energia
 Não há formação de espuma
 Baixo grau de umidade (menor
contaminação)
Microrganismos produtores: características e nutrição
Identificação do microrganismo produtor;
Características ideais;
 Seguro sob o ponto de vista biológico (status GRAS –
generally recognized as safe);
Apresentar elevada capacidade de síntese e excreção da
enzima;
 Suportar condições ambientais adversas, relacionadas com a
pressão osmótica,T e força iônica do meio;
 Ser tolerante à presença de substâncias
tóxicas que podem ser geradas
Meios de cultivo para a produção de enzimas
As características do meio são muito importantes para o
crescimento celular e para o rendimento do produto;
As células respondem aos estímulos químicos e físicos do
meio externo, o que pode interferir no desempenho na
formação do produto desejado;
Ex: síntese da proteinase extracelular de Bacillus subtilis é
reprimida pela presença no meio de cultivo de certos
compostos que contenham nitrogênio, como o glutamato e o
aspartato.
Processos microbianos industriais → meios de
composição química definida ou meios complexos;
Características:
Composição adequada para o crescimento e formação do
produto de interesse;
Baixo custo de obtenção, transporte e estocagem;
Elevada disponibilidade e facilidade de padronização dos
componentes;
Deve contribuir para os processos de separação do produto
Meios de cultivo para a produção de enzimas
Processo Fermentativo
Referências
 Borzani W, Schmidell W, Lima UA, Aquarone E.
Biotecnologia Industrial . Fundamentos.Volume I.
Engenharia Bioquímica. São Paulo: Editora Blucher,
2001, 254 p.
 Lima UA, Aquarone E, Borzani W, Schmidell W.
Biotecnologia Industrial . Processos fermentativos
e enzimáticos.Volume III. Engenharia Bioquímica.
São Paulo: Editora Blucher, 2001, 254 p.
 Said S, Pietro RCLR. Enzimas como agentes
biotecnológicos. Ribeirão Preto: Legis Summa,
2004, 412 p.