Prévia do material em texto

DISCIPLINA
IC -363 - CROMATOGRAFIA
Departamento de Química Orgânica
Instituto de Química
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
CROMATOGRAFIA PLANAR
Profa Rosane Nora Castro
Bibliografia básica: COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L.; BONATO,P.S. 
Fundamentos de Cromatografia. Campinas: Unicamp, 2006
Rosane Nora-2022 1
bruno
Realce
Rosane Nora-2022 2
 
Cromatografia 
CCD CP Líquida CSC 
Planar Coluna 
Centrifuga 
( Chromatotron) 
Clássica CLAE CG CGAR 
Gasosa 
Fonte: DEGANI et al, 1998
Classificação da Cromatografia
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
3
• Surgiu em 1941, desenvolvida por Martin e Synge e lhes rendeu o prêmio
Nobel de 1952, a mais a simples de todas as técnicas cromatográficas.
• Compostos polares hidrossolúveis: açúcares e aminoácidos
• Princípio: partição (solubilidade)
• Pouca quantidade de amostra
• Tipos: ascendente, descendente, bidimensional, circular
• F.M. - Sistema de solventes diferentes e miscíveis (água usada)
• F.E. - Água retida no polímero da celulose (papel Whatman)
• Métodos de detecção: físico-químicos
• Análise qualitativa:Rf(fator de retenção) - problema : reprodutibilidade
• Análise quantitativa: densitômetro, extração dos solutos
1. Cromatografia em papel (CP)- líquido-líquido
Cromatografia Planar
Rosane Nora-2022
bruno
Realce
bruno
Nota
- Analítico -> analisar 
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
4
A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza 
dois líquidos (FM e FE) sendo um fixado em um suporte sólido 
(papel de filtro). Um bom exemplo é a separação da tinta verde. 
Com o processo de cromatografia é possível verificar que a cor 
verde é uma mistura de tintura azul e amarela.
Fase estacionária líquida suportada na celulose.
Fase móvel Separação
Rosane Nora-2022
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
5
Análise pigmentos de pimentões por CP
Cromatogramas dos extratos de pimentões amarelos (1), verdes (2) e vermelhos (3). 
FM:Hexano:5% Acetona 
Análise de pigmentos de pimentão por cromatografia em papel. Ribeiro e Nunes, QN Escola, 29, 
34-37, 2008
Rosane Nora-2022
bruno
Nota
Cromóforos = ligações múltiplas em serie. 
- cor 
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Nota
mais polar
bruno
Nota
menos polar
Rosane Nora-2022
6
2. Cromatografia Centrifuga
. Chromatotron é uma cromatografia de
camada fina preparativa (isolar)
acelerada centrifugamente Pode
substituir pequenas colunas e HPLC.
Princípio de operação:
 A amostra a ser separada é aplicada, como uma solução, na área central de um
disco giratório revestida com uma fina camada de adsorvente.
 A eluição por solvente forma bandas circulares dos componentes separados, que
são giradas para fora em conjunto com o solvente. Um sistema de recolhimento
traz novamente o eluato para um tubo de saída simples.
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Nota
- separação por difusão radial.
bruno
Nota
- FE , pode ser sólida ou liquida. 
7
• Início em 1938 com Izailov e Shraiber, mas começou a ser largamente
utilizada na década de 1960.
• Técnica simples e barata, separação de uma mistura através da migração por
capilaridade diferencial de seus componentes sobre uma camada delgada de
adsorvente retido sobre uma superfície plana.
• A fase móvel (líquido) ascende por ação de capilaridade por uma camada fina
da fase estacionária (adsorvente) aplicada sobre um suporte plano (vidro,
alumínio ou filme plástico).
3. Cromatografia em Camada Delgada Analítica- CCDA
Okumura et al, Quim. Nova, Vol. 25, No. 4, 680-683, 2002
Rosane Nora-2022
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Nota
Analítico - analisar

Preparativa - isolar 
Rosane Nora-2022
8
Aplicações de CCDA
 Determinar a pureza do composto
 Identificar componentes em uma mistura comparando-os com padrões,
 Determinar o n de componentes de uma mistura.
 Determinar o solvente apropriado para a separação por CC,
 Monitorar uma separação realizada por CC,
 Verificar a eficiência de uma separação,
 Acompanhar o curso de uma reação pelo aparecimento dos produtos 
e desaparecimento dos reagentes.
CCD de óleos essenciais 
reveladas com anisaldeído 
sulfúrico
CCD das frações de P. oleacoides da coluna
sephadex LH20 - Hex/AcOEt 1:1; revelador:
vanilina sulfúrica
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
9
Cromatografia em Camada Delgada (CCD ou TLC)
Armin F. Isenmann, CEFER-MG 
Vantagens: fácil compreensão e execução, separações em breve espaço
de tempo, versatilidade, grande reprodutibilidade e baixo custo.
Rosane Nora-2022
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Nota
Solvente abaixo da linha.
bruno
Realce
Rosane Nora-2022 10
MEDIDA DO FATOR DE RETENÇÃO ( Rf)
ANÁLISE QUALITATIVA: A análise qualitativa com CCD, consiste na
determinação do Rf e sua comparação com Rf de padrões
Variáveis que influenciam Rf: 
• espessura da FE
• composição da FM, 
• temperatura ambiente, 
• grau de saturação da cuba
• quantidade da amostra. 
• Ativação e estocagem das 
placas
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Nota
Corrida única, assertiva. 

- ponto mais concentrado da amostra. 
bruno
Nota
Medida adimensional, não é um valor tabelado. 
Rosane Nora-2022 11
Revelação sob luz ultravioleta (254/363 nm): indicado para substâncias
com cromóforos (sistemas conjugados), pois absorvem radiação UV e
tornam-se fluorescentes.
Revelação com vapores de iodo (semidestrutivo): revelador universal
para qualquer substância orgânica. Forma manchas marrons.
Métodos químicos (destrutivo): a solução do revelador é borrifada com
ar comprimido. Após aquecimento ocorre a reação da substância com o
revelador formando manchas coloridas. Ex. CeSO4 (Universal)
Métodos biológicos: quando há procura por uma substância com
atividade biológica. Revelador é uma suspensão de fungos.
CCDA: Cromatografia em camada delgada
TÉCNICA GERAL DA CCD: Revelação 
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Nota
Fluorsceína = na placa. 
bruno
Nota
Iodo se adiciona nas ligações duplas, sofre sublimação = passagem do sólido para o estado gasoso.
- o revelador some, podendo ser utilizado novamente com outra método de revelação. 
12
Visualização da CCDA -Reveladores
Molibidato cérico de 
amônio
Destrutivos
Semidestrutivo
Rosane Nora-2022
13
CCDA: Cromatografia em camada delgada
Físicos:
Luz UV
(254 e 365 
nm)
Químicos:
FeCl3, 
vanilina 
sulfurica
Vapores de 
iodo
Biológicos:
Enzimas,
Antibióticos e
Substratos
Visualização:
Frações de P. oleacoides da coluna Sephadex LH20 - Hex/AcOEt 1:1; revelador: vanilina sulfúricaRosane Nora-2022
bruno
Realce
bruno
Nota
Atividades antioxidantes.
14
Formas de desenvolvimento :CCDA Bidimensional
Eluição efetuada em duas direções com solventes diferentes
Rosane Nora-2022
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Nota
Sem calculo de RF.
15
• Uso de eluente incorreto (Rf = 0 ou Rf =1)
• Concentração da aplicação das amostras (efeito de “bordo)
• Câmara mal saturada (usar papel de filtro na cuba)
• Aplicação da amostra próximo a borda da placa.
Alguns problemas em CCDA
Rosane Nora-2022
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
16
• As placas de HPTLC (CCDAE) permitem uma análise rápida e quantitativa
de amostras complexas, utilização manual ou automática. Atuam três vezes
mais rápido que placas de CCD convencionais e são mais sensíveis.
• As placas de CCDAE e CCD utilizam o mesmo tipo de sílica gel 60.
• CCDAE os tamanhos de partícula variam entre 4-8 mm (tamanho de
partícula médio 5-6 mm). Superfície mais homogênea e poder de separação
maior do que o oferecido porplacas de CCD convencionais.
• As bandas de amostragem altamente compactas (graças à menor difusão de
banda) e uma fina camada de 200 µm levam a uma sensibilidade bem maior.
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DE ALTA EFICIÊNCIA 
(CCDAE) 
CCDHPTLC
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Nota
Maior porosidade. 
17
 HPTLC: Uso de UV / visível / Fluorescencia scanner digitaliza o
cromatograma todo qualitativa e quantitativamente e o scanner é um tipo
avançado de densitômetro
Comparação de CCD x HPTLC
Rosane Nora-2019
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Nota
Placa mais fina.
18
-Exemplo de uso de eluente incorreto na avaliação da pureza da
curcumina comercial (Sigma-Aldrich)
a
b
Análises por CCDA (Silica) de uma
mistura de curcuminoides
comerciais
(a) Eluente: hexano/AcOEt (50%); 
(b) Eluente: CH2Cl2:MeOH (2%). 
As placas foram visualizadas sob 
luz UV a 365 nm.
b
Sueth, V. Tese, UFRRJ 2015
Rosane Nora-2019
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Nota
Grupo doador - ressonância. E tiram por indução. 
Rosane Nora-2022
Revista Virtual de Química, Vol. 7, No 3, 2015. DOI: 10.5935/1984-6835.20150056 (Vídeoaula de CCD-UFF)
1 - Etapa da CCDA: Preparo da placa e aplicação da amostra
A. Separar a CCDA B. Solubilizar amostra (1-2%) C. Aliquotar amostra
D. Aplicar na placa com capilar
http://dx.doi.org/10.5935/1984-6835.20150056
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Nota
- no solvente.
20
2 - Desenvolvimento da placa de CCDA
- Colocar placa em cuba previamente
saturada com FM adequada para a
separação das substâncias e aguardar até
o final da corrida
- Aplicação da amostra deve estar acima do 
nível do solvente, para evitar a dissolução 
das substâncias
Rosane Nora-2022
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
21
3 -Revelação: Visulalização da cromatografia/ medida Rf
2. Revelador químico
1. Revelador físico(UV)
3. Revelador Químico (I2)
 observar a placa na câmara de UV para
verificar se alguma substância apresenta
fluorescência (Figura 1), e/ou proceder a
revelação com reagente adequado mergulhando
diretamente a placa no revelador.
Figura 1 Vieira Jr et al, Quím. Nova 30 ,2, 491,2007
Rosane Nora-2022
bruno
Realce
22
4 - Calcular o fator de retenção (Rf)
Rosane Nora-2022
amostra
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Nota
- menor afinidade pela FE
bruno
Nota
- maior afinidade pela FE
bruno
Nota
Fator de identificação, utilizando padrões comparativos, submetidos as mesmas condições. 
- cm/cm
Cromatografia de Camada Delgada Preparativa -CCDP
Placa de CCDP para separação de  e  lapachona
-lapachona
Liebert & Klier, Revista de Iniciação Científica, 80-
80, 2014/2015
CCD - aplicação analítica ou preparativa, cuja escala está na dependência da espessura 
da camada de adsorvente e da amostra em análise. 
CCDA- analisar qualitativamente uma substância 
CCDP- finalidade ISOLAMENTO ou PURIFICAÇÃO de componentes da mistura
Desenvolvimento,observaçã
o na luz UV 254nm
Assistir ao vídeo 
https://www.youtube.com/watch?v=dtthSx6czh0
Retirando amostra 
da placa
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Nota
Tipo de sílica = espessura da placa e o quanto de amostra é aplicada. 

- inúmeros desenvolvimentos.
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
24
O esquema geral de fracionamento de TLC semi-preparativo bio-guiado
Choma & Jesionek, Chromatography 2015, 2(2), 225-238;
TLC-Direct Bioautography as a High Throughput Method for Detection 
of Antimicrobials in Plants
Preparar: 50g silica / 60 ml água destilada -
espalhar rapidamente / secar / ativar
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Realce
bruno
Nota
- recolhimento do solvente + amostra 
bruno
Realce