Relatorio de Metodos Instrumentais

Prévia do material em texto

1 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDADE PAULISTA – UNIP 
 
 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CURSO: Farmácia DISCIPLINA: Métodos Instrumentais de Análises 
 
NOME DO ALUNO: Caroline da Silva Porfirio 
 
R.A: 2162280 POLO: Artur Nogueira 
 
DATA: 13 / 10 / 2022 
 
2 
 
 
Métodos Instrumentais de Análises 
 
Os métodos analíticos são classificados em clássicos ou instrumentais. 
Esta classificação é histórica, com os métodos clássicos precedendo os 
instrumentais por um século ou mais (PASSOS, Elisangela, 2011) 
Os métodos analíticos instrumentais consistem na medida das 
propriedades físicas do analito, tais como condutividade, potencial de eletrodo, 
absorção ou emissão de luz, razão massa/carga e fluorescência (PASSOS, 
Elisangela, 2011). 
A medida das propriedades físicas do analito começou a ser empregada 
para análise quantitativa de uma variedade de analitos orgânicos, inorgânicos e 
bioquímicos. Um pouco mais tarde, surgiram as técnicas cromatográficas que 
substituíram a destilação, extração e precipitação de componentes em misturas 
complexas, antes da determinação qualitativa ou quantitativa (PASSOS, 
Elisangela, 2011). 
A cromatografia de camada delgada é um exemplo de cromatografia de 
adsorção. Esta técnica consiste de uma fase estacionária fixada em uma placa 
(de vidro ou alumínio) e uma fase móvel, que é composta por um solvente ou 
combinação de solventes, chamado eluente (BRONDANI, Patrícia, 2019). 
A amostra a ser analisada é aplicada sobre a fase estacionária, que é um 
adsorvente. Os principais adsorventes utilizados em CCD são sílica gel e 
alumina. As amostras a serem analisadas em CCD devem ser previamente 
dissolvidas em um solvente volátil. A aplicação dessa solução sobre a placa 
cromatográfica deve ser efetuada a aproximadamente 0,5 cm da base inferior da 
mesma (BRONDANI, Patrícia, 2019). 
Após a aplicação da(s) amostra(s), a CCD deve ser introduzida em uma 
cuba de vidro contendo o solvente ou a combinação de solventes apropriados 
(chamado de eluente ou fase móvel) (BRONDANI, Patrícia, 2019). 
Os pimentões verdes e amarelos devem sua coloração principalmente à 
presença de carotenos e de carotenóides oxigenados. 
 
 
 
 
3 
 
 
Os carotenóides são pigmentos encontrados na natureza e trazem 
benefícios para a saúde por sua atividade antioxidante e anticancerígena. Alguns 
desses compostos apresentam também atividade pró-vitamínica A (Bianchini e 
Penteado, 1998). 
 A maioria deles é estável à temperatura ambiente, porém devido ao 
elevado número de ligações duplas, quando purificados, devem ser mantidos na 
ausência de luz e oxigênio e em ambiente refrigerado. 
A coloração dos carotenóides varia do amarelo, passando pelo laranja, 
até o vermelho intenso e resulta da multiplicidade de duplas ligações conjugadas. 
Os carotenóides podem ser classificados de duas maneiras. A primeira 
considera a existência de duas grandes famílias: os carotenos (carotenóides 
hidrocarbonetos) e as xantofilas (carotenóides oxigenados). O segundo sistema 
divide os carotenóides em três grupos: acíclicos (por exemplo, o licopeno), 
monocíclicos (por exemplo, o gama-caroteno) e bicíclicos (por exemplo, o alfa-
caroteno e o beta-caroteno (RIBEIRO, N. M. & NUNES, C. R). 
Também temos a hemoglobina que é o pigmento que dá a cor vermelha 
ao sangue. No sangue, a glicose (açúcar) liga-se a hemoglobina, formando a 
hemoglobina glicada. A hemoglobina glicada (HbA1c) é o teste mais indicado na 
quantificação do risco de complicações crônicas em pacientes diabéticos. 
Quanto maior for o nível de glicose na corrente sanguínea, maior será a 
ligação da glicose com a hemoglobina e, consequentemente, maior o nível de 
hemoglobina glicada (BEM, Andreza, KUNDE, Juliana, 2006). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
 
 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
08/09/2022 (Aula 5) 
Análise por Cromatografia em Camada Delgada I Análise 
Cromatográfica de Ácido Acetilsalicílico e Paracetamol 
 
Nessa aula tivemos como objetivo avaliar a separação de princípios ativos 
de ação analgésica pela técnica da CCD. Estudar o emprego de técnicas 
cromatográficas para separação e análise de substâncias em função de sua 
estrutura química e do fenômeno de adsorção cromatográfica. Analisar amostras 
de aspirina, paracetamol e coristina D. 
 
Parte 1: Preparação das Amostras de Analgésicos 
 
1. Transferimos para béquer, a amostra triturada de Somalgin e de 
Coristina (um béquer para cada amostra), denominamos como (S A1 e C A2). 
 
Figura 1 - Somalgin e Coristina triturados 
 
Fonte própria 
 
 
 
 
 
 
5 
 
 
2. Na capela, a cada béquer, adicionamos 10 mL de solução de extração. 
 
Figura 2 - Padrão 1 e 2 
 
Fonte Própria 
 
Figura 3 - Coristina e Somalgin com solução de extração 
 
Fonte própria 
 
3. Com auxílio de bastão de vidro agitamos e levar os béqueres a banho 
de água deixando por 5 minutos em aquecimento moderado (40 °C). 
4. Aguardamos a decantação das partículas insolúveis. 
 
 
 
6 
 
 
Parte 2: Análise cromatográfica 
 
 O técnico deixou preparada uma cuba contendo a fase móvel (acetato de 
etila com 0,5% de ácido acético glacial). 
Nós alunos iniciamos o seguinte procedimento: 
1. Em uma placa de sílica (4 x 12 cm) efetuamos duas marcações (cerca 
de 1 a 2 cm da extremidade), indicando o ponto de aplicação da amostra e o 
ponto em que se indicará o final da corrida. 
2. Utilizando um capilar, aplicamos duas porções de cada extrato sobre 
uma placa de sílica (2 x 10 cm) a 1,0 cm de uma das extremidades. 
 
Figura 4 - processo de pipetagem na placa de sílica 
 
Fonte Própria 
 
3. Colocamos, a placa de sílica na cuba, evitando que o ponto de 
aplicação da amostra mergulhe no solvente. 
4. Aguardamos até que o solvente atinja cerca de 0,5 cm do topo da 
placa, removemos a placa e marcamos a frente do solvente (linha de 
chegada da fase móvel). 
 
 
 
7 
 
 
Figura 5 - Placa de sílica na cuba 
 
Fonte própria 
 
5. Levamos até uma lâmpada de UV para a visualização na placa sílica. 
 
Figura 6 - Placa sílica na lâmpada de UV 
 
Fonte tirada por alunos UNIP LIMEIRA, 2022 
 
 
 
8 
 
 
6. Marcamos, com auxílio de lápis, o ponto visualizado para cada 
analgésico após a corrida na placa de sílica. 
7. Determinamos com uma régua a distância de cada ponto e calculamos 
 os valores de Rf. 
 
Rf 
 
P1 = 4,8 cm - AAS = 4,8/10 = 0,48 
P2 = 4,9 cm - Paracetamol = 4,9/10 = 0,49 
A1 = 5,1 cm - Coristina = 5,1/10 = 0,51 
A2 = 7,2 cm - Somalgin = 7,2/10 = 0,72 
 
Discussão: 
 
1- Na cromatografia de camada delgada, o Rf é função do tipo 
de suporte (fase fixa) empregado e do eluente. Ele é definido como a 
razão entre a distância percorrida pela mancha do componente e a 
distância percorrida pelo eluente. Portanto: Rf = dc/ds 
Onde: 
dc = distância percorrida pelos componentes da mistura. 
ds = distância percorrida pelo eluente. 
 
2- Quando se aplica à CCD amostras contendo substâncias 
conjugadas e sistemas aromáticos, esses compostos impedirão a 
emissão de luz, aparecendo como pontos ou faixas escuras na 
superfície da placa. Foi feito a análise do padrão e duas amostras de 
fármacos. 
 
O melhor resultado foi o da coristina D. conforme dados 
literários RDC166 mais condizentes. 
 
 
 
 
9 
 
 
08/09/2022 (Aula 6) 
Cromatografia em Camada Delgada (CCD) II Análise Cromatográfica 
de Pigmentos 
 
O objetivo dessa aula foi avaliar a separação de pigmentos pela técnica 
da CCD. Estudar o emprego de técnicas cromatográficas para separação e 
análise de substâncias em função de sua estrutura química e do fenômeno de 
adsorção cromatográfica. 
 
Parte 1: PREPARAÇÃO DO EXTRATO 
Essa parte foi executada pela técnica do laboratório. 
 
Betacaroteno - amarelo 
Capsantina - vermelhoCriptoxantina – laranja 
 
Figura 7 - Moléculas presentes no extrato de pimentão 
 
Fonte: Tirado do material do roteiro da UNIP, 2022. 
 
 
 
10 
 
 
PARTE 2: ANÁLISE CROMATOGRÁFICA 
A técnica deixou preparada uma cuba contendo a fase móvel (hexano com 
5% de acetona). 
Assim fizemos o seguinte procedimento: 
 1. Em uma placa de sílica (2,5 x 7,5 cm) efetuamos duas marcações 
(cerca de 1 a 2 cm da extremidade), indicando o ponto de aplicação da amostra 
e o ponto em que se indicará o final da corrida. 
2. Utilizando um capilar, aplicamos o extrato concentrado de cada 
pigmento (em posições diferentes) sobre a placa de sílica na altura da marcação. 
 3. Colocamos, cuidadosamente, a placa de sílica na cuba, evitando que 
o ponto de aplicação da amostra mergulhe no solvente. 
4. Aguardamos até que o solvente atinja a segunda marcação do topo da 
placa (final da corrida). 
 5. Removemos a placa e marcar a frente do solvente (linha de chegada 
da fase móvel). 
6. Deixamos secar ao ar por 5 minutos e observamos o número de 
manchas coloridas formadas. 
 
Figura 8 - Análise cromatográfica de pigmentos 
 
Fonte própria 
 
11 
 
 
Cálculo Rf para as manchas observadas: 
 
Altura total = 5,3 cm 
 
VE = 2,2 cm - Rf = 2,2/5,3 = 0,42 
A = 3,7 cm - Rf = 4,9/5,3 = 0,57 
A1 = 3 cm - Rf = 3/5,3 = 0,70 
 
Discussão: 
 
O eluente (fase móvel líquida) elui (deslocar para cima) por uma camada 
fina de sílica-gel (fase estacionária adsorvente), por exemplo, estendida sobre 
um suporte. Ao fazer um “spot” (aplicação da amostra) na base da placa, a 
mesma é colocada verticalmente em uma cuba cromatográfica (recipiente 
fechado) contendo o eluente, sendo esse uma quantidade de um determinado 
solvente ou mistura de solventes. À medida que a placa cromatográfica é eluida, 
a amostra é “arrastada” pela fase móvel sobre a fase estacionária. 
Durante este processo, os diversos componentes da mistura serão 
separados de acordo com suas propriedades de solubilidade e adsorção. Cada 
“mancha” que aparecer na placa corresponde a um componente presente na 
mistura original. 
 
Figura 9 - Cromatografia em camada delgada (CCD) 
 
Fonte: https://www2.ufjf.br/quimica/files/2018/08/Cromatografia.pdf 
 
 
 
 
https://www2.ufjf.br/quimica/files/2018/08/Cromatografia.pdf
 
12 
 
 
08/09/2022 (Aula 6) 
Análise por Cromatografia em Coluna de Troca Iônica 
Hemoglobina Glicada em Amostra de Sangue 
 
O objetivo dessa aula foi avaliar a separação das frações de hemoglobina 
glicada e normal em coluna de troca iônica. Determinar a porcentagem de 
hemoglobina glicada em amostra de sangue. 
 
Parte 1: PREPARAÇÃO DA AMOSTRA DE HEMOLISADO 
Foi executado pela Técnica do Laboratório 
 
PARTE 2: PREPARAÇÃO DA COLUNA CROMATOGRÁFICA 
Foi executado pela Técnica do Laboratório 
 
PARTE 3: ANÁLISE CROMATOGRÁFICA 
- Adicionamos 0,05 mL (50 microlitros) de amostra de hemolisado sobre 
a resina. (Com cuidado para evitar formação de bolhas de ar). 
- Aguardamos que o hemolisado penetre no interior da resina. 
- Transferimos a coluna para um novo tubo de ensaio (enumerado como 
“1”). 
- Adicionamos, lentamente (com a adição pela parede da coluna), 3,5 mL 
de tampão (Frasco 1 – kit). 
- Aguardamos até que todo o tampão penetre no interior da resina. 
- Homogeneizamos o líquido coletado no Tubo “1”. 
- Enumeramos outro tubo de ensaio (seco e limpo) como “2”. 
- Adicionamos a este tubo 7,0 mL de água destilada e 0,02 mL (20 
microlitros) de amostra de hemolisado. 
- Homogeneizamos. 
 
 
 
 
 
 
13 
 
 
Figura 10 – Teste Hemoglobina Glicada em Amostra de Sangue 
 
Fonte própria 
 
Levamos os tubos “1” e “2” para o espectrofotômetro, previamente 
ajustado em = 415 nm, zerando com água destilada. 
Efetuamos a leitura das absorbâncias dos dois tubos (A1 e A2). 
Efetuamos o cálculo do teor de Hemoglobina Glicada na amostra de 
sangue: 
 
Branco = 0 A1 x f(14) x = 0,770 
A1 = 0,770 A2 1,126 
A2 = 1,126 x = 9,57% 
 
Discussão 
 
Na cromatografia por troca iônica, a hemoglobina não-glicada apresenta 
uma carga positiva, ajustando-se o pH do meio reacional, quando comparada à 
hemoglobina glicada, o que a faz interagir mais com uma coluna catiônica (carga 
negativa). O fluxo de um tampão adequado na resina permite eluir a fração 
glicada, portanto separando-a da não-glicada pela carga da molécula de 
hemoglobina 
 
 
14 
 
 
A cromatografia de afinidade utiliza derivados do ácido borônico, como o 
ácido m-aminofenilborônico, imobilizados em uma resina. O ácido borônico 
reage com cis dióis (compostos que apresentam duas hidroxilas no mesmo lado, 
como a molécula de glicose), portanto a separação das frações glicada e não-
glicada se dá pela porção açúcar, ficando a hemoglobina glicada retida na coluna 
enquanto a não-glicada (ou HbA0) é eluída da mesma pelo fluxo de um tampão. 
Este princípio metodológico quantifica primariamente a hemoglobina glicada 
total. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
15 
 
 
Referências 
 
 PASSOS, Elisangela. Métodos Instrumentais de Análise. CESAD, 2011. 
Disponível em: 
https://cesad.ufs.br/ORBI/public/uploadCatalago/18024916022012Metodos_Inst
rumentais_de_Analise_-_Aula_01.pdf. Acessado 13/10/2022. 
 
BRONDANI, Patrícia. Cromatografia de Camada Delgada (CCD). UFSC, 
2019. Disponível em: 
https://patyqmc.paginas.ufsc.br/files/2019/07/Cromatografia-de-Camada-
Delgada.pdf. Acessado 13/10/2022. 
 
RIBEIRO, N. M. & NUNES, C. R. Análise de pigmentos de pimentões por 
cromatografia em papel. Química Nova na Escola, n 20, 2008. 
 
Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ou Thin Layer 
Chromatography (TLC). 
http://w3.ufsm.br/larp/media/camada_delgada_teoria.pdf Acessado 13/10/2022. 
 
BEM, Andreza, KUNDE, Juliana. A importância da determinação da 
hemoglobina glicada no monitoramento das complicações crônicas do diabetes 
mellitus. J Bras Patol Med Lab, v. 42, n. 3, p. 185-191, junho 2006. Disponível 
em: 
https://www.scielo.br/j/jbpml/a/CBHLk8NR8pHZ85KkTWjfqcw/?format=pdf&lang
=pt. Acessado 13/10/2022. 
 
 
https://cesad.ufs.br/ORBI/public/uploadCatalago/18024916022012Metodos_Instrumentais_de_Analise_-_Aula_01.pdf
https://cesad.ufs.br/ORBI/public/uploadCatalago/18024916022012Metodos_Instrumentais_de_Analise_-_Aula_01.pdf
https://patyqmc.paginas.ufsc.br/files/2019/07/Cromatografia-de-Camada-Delgada.pdf
https://patyqmc.paginas.ufsc.br/files/2019/07/Cromatografia-de-Camada-Delgada.pdf
http://w3.ufsm.br/larp/media/camada_delgada_teoria.pdf
https://www.scielo.br/j/jbpml/a/CBHLk8NR8pHZ85KkTWjfqcw/?format=pdf&lang=pt
https://www.scielo.br/j/jbpml/a/CBHLk8NR8pHZ85KkTWjfqcw/?format=pdf&lang=pt