Aula__COLUNA_2022

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Rosane Nora -2021 -ECE 1
 A separação ocorre em função dos diferentes 
equilíbrios de distribuição dos componentes em 
duas fases imiscíveis distintas.
O que é cromatografia?
Cromatografia em Coluna Aberta (CC)
 Fase Estacionária (FE): permanece estacionada 
no suporte de separação (coluna ou tubo).
 Fase Móvel (FM): é a fase em movimento, que se 
desloca ao longo da FE.
Fase Móvel
Fase Estacionária
É uma técnica de separação dos componentes de uma mistura.
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CROMATOGRAFIA
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Nota
Objetivo de isolar = preparativa.
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Nota
Competição de interações. 
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Nota
Força de solvente -> 
- eluiu demais = diminui a força -> mais apolares 
- eluiu de menos = aumenta a força -> menos apolares 
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Nota
Ativação da sílica - > remover água, aquecer.
- favorecendo que a amostra interaja com a sílica por adsorção em comparação com o mecanismo de partição. Por conta da presença de água, ligações de hidrogênio que fazer um filme e dificultam a interação da amostra com os sítios de ligação (polares) da sílica. 
bruno
Nota
Modificação de força do solvente em fase reversa = 
- eluiu demais = diminui a concentração de solvente 
em relação a água, não muda. 
- eluiu menos = aumenta a concentração de solventes organicos, etanol, metanol, etc.
bruno
Nota
Diferença de solubilidade.
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Nota
Diferença de tamanho.
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Rosane Nora -2021-ECE 3
Tipos de Cromatogafia 
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CROMATOGRAFIA EM COLUNA GRAVITACIONAL
Tubo de vidro
com extremidade
superior aberta e
torneira na parte
inferior, para
controlar a vazão
da FM.
A FE é
suportada
por algodão,
lã de vidro,
placa porosa
de vidro
A FE pode
ser líquida,
sólida ou de
fase ligada.
Líquido Líquido
PARTIÇÃO
Líquido Sólido
ADSORÇÃO
Líquido Gel
EXCLUSÃO
Líquido Sólido
COMPLEXAÇÃO
Temos ainda os métodos de
interação de imunoafinidade,
bioafinidade e hidrofílica
(HILIC)
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Nota
Guia = antes, durante e depois. 
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Nota
- evaporar o solvente = fazer analise, rmn
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Nota
Troca iônica
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Classificação quanto ao tipo de interação FM x FE (mecanismo de 
separação)
Interação hidrofílica
Fase estacionária sólida funcionalizada com 
grupos polares promove a separação por partição
Rosane Nora -2021 -ECE
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•Adsorção (sólido-líquido)
•Partição (líquido-líquido)
•Troca iônica (interações eletrostáticas)
•Exclusão por tamanho (filtração)
• Bioafinidade 
• Interação hidrofílica (HILIC)
Tipos de cromatografia
•Classificadas em diferentes grupos, de acordo com o fenômeno físico ou 
químico envolvido no processo de separação
• Início da Cromatografia-Tswett 1906: Separação de pigmentos de 
plantas 
M. Twsett, Ber. Deut. Bot. Ges.,1906, 34, 316.
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 Técnica simples, não exige instrumentação sofisticada, boa para fins preparativo
purificação de substâncias orgânicas.
 COLUNA – Tubo cilíndrico com estrangulamento numa das extremidades. Geralmente 
de vidro. O tamanho vai depender da quantidade de material a ser separado.
 Pode-se utilizar um único solvente ou uma mistura de solventes;
 Durante a cromatografia pode-se aumentar a polaridade do eluente, afim de aumentar a 
capacidade de dessorção do mesmo.
Atividade cromatográfica
do sólido(FE), tendo
grupos polares (sílica),
aumenta adsorção sobre
grupos polares.
-CO2H> -OH> -NH2> -SH> 
-CHO> -C=O> -CO2R>
-OCH3> -CH=CH
Rosane Nora -2021 -ECE
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1. CROMATOGRAFIA EM COLUNA ABERTA(CC)
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Preparo da Coluna Cromatográfica:
1 – ESCOLHA DO ADSORVENTE (Depende da
característica da amostra)
2 – ESCOLHA DO ELUENTE (através da CCD)
3 – EMPACOTAMENTO DA COLUNA (FE na forma de
suspensão com vibração)
4 – ELUIÇÃO (por gotejamento pela força da gravidade ou
suave pressão –flash.)
1. CROMATOGRAFIA EM COLUNA ABERTA(CC)
Escolha da quantidade de adsorvente em relação a amostra
A CCD deve orientar na escolha do eluente e no preenchimento da 
coluna
Separação
Razão adsorvente 
(g)/ amostra (g)
Simples Média Difícil
20:1 50:1 100:1
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Nota
de Maior polaridade
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de Menor polaridade 
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Nota
Solventes miscíveis entre si.
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Nota
Quanto mais fina e longa, melhor = maior caminho cromatográfico. 
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Cromatografia em Coluna Aberta
POR ADSORÇÃO (LÍQUIDO – SÓLIDO)
Usa-se uma coluna recheada com um sólido (FE) e uma 
fase móvel líquida.
 SISTEMAS PRESSURIZADOS
- CL Baixa-pressão CL (ca. 5 bar/75 psi/0.5 MPa);
- CL Média-pressão (ca. 5–20 bar/75–300 psi/0.2–2.0 
MPa);
- CL alta-pressão HPLC (>20 bar/300 psi/2.0 MPa). 
Rosane Nora -2021 -ECE
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Fase Móvel
1. Tubo de vidro montado na vertical (chumaço de 
algodão)
2. Escolha do adsorvente e do solvente
(Proporção mínima de amostra/adsorvente 1:20)
3. Empacotamento da coluna
- seco ou suspensão (adsorvente+solvente)
Quanto mais uniforme  Maior eficiência
4. Aplicar amostra no topo 
(pastilha ou solubilizada no eluente)
5. Iniciar percolação com solvente adequado
6. Recolher frações
7. Acompanhar a separação por CCDA
Etapas para preparar a coluna
Rosane Nora -2020 -ECE
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Cuidados: Reações na coluna:
Alumina alcalina: condensação de aldeídos e
cetonas
Carvão ativo : decomposição química
Sílica: isomerização de terpenoides e
esteroides
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Nota
Solventes polares - fase reversa. 
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Nota
Solventes apolares - fase normal. 
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Nota
Pastilha = amostra + sílica 
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Nota
Em suspensão -> sem espaços vazios
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Na fase normal a porcentagem sempre está associada ao solvente mais forte -> 

75% de Hexano/ Acetato de etila 25% = 25 % do acetato de etila, mais polar. 

Dicloro/ Metanol 2% = esses 2% são do metanol.
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Procedimento para Preparar coluna
1. Base da coluna: Um pequeno 
algodão para reter a fase 
estacionária
2. Adicionar o adsorvente: seco 
ou misturado ao solvente
4. Aplicar amostra no topo, 
solubilizada com solvente ou 
na forma de pastilha (silica + 
amostra)
3. Não deixar a coluna secar!!
Rosane Nora -2020 -ECE 11
Procedimento para Preparar coluna
5. Eluir a amostra com um pouco de
solvente até quase a secura. Introduzir uma
nova quantidade de solvente e a
operação repetida. A coluna é, então,
preenchida com o solvente, e iniciada
a eluição propriamente dita.
6. Recolher frações, e adicionar mais 
solvente no topo.
7. Monitorar frações por CCD enquanto 
ela está sendo eluída.
8. Reunir frações puras e evaporar 
solvente. 
Rosane Nora -2020 -ECE 12
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Isolamento dos componentes da própolis verde a partir do EHP-2
 Aplicação: 300,0 mg de EHP-2 bruto; 
 Gradiente: CHCl3:Acetona (0 – 20%);
 Frações recolhidas: 118 frações com volume entre 10 e 15 mL; 
• frações monitoradas por CCDA, uma
coloração azul com vanilina sulfúrica;
• FM: CHCl3:Acetona 40% v/v;
• Frações reunidas e secas :
90 mg (30%);
Pires, L. O., Isolamento, caracterização e avalição da atividade antiparasitária de derivados 
prenilados da própolis verde, 2019
70 g de gel 
de sílica/ 
150 mL de 
CHCl3
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CROMATOGRAFIA EM COLUNA FLASH
Utilização de
uma bomba na
coluna para
aumentar a
pressão e
acelerar a
passagem do
eluente
(cromatografia
flash)
Cromatografia 
líquida à vácuo 
(CLV)
Cromatografia
Flash-ISOLERA
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Nota
Faz o recolhimentodas amostras sozinho. 
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- Técnica utilizada no fracionamento de uma mistura de compostos 
sob baixa pressão e com colunas curtas.
- É útil para uma separação preparativa rápida com boa resolução. 
- Vantagens: Baixo custo, Fácil montagem, Fácil empacotamento, 
Rapidez de eluição e Boa resolução.
- Combina capacidade analítica da CCDA com a capacidade de
aplicação em grande escala da cromatografia em coluna.
- Uso de sílica gel fina e tamanho uniforme (230-400Mesh; 32 -63 µm
partículas).
- Efetua separação de componentes com diferenças de Rf ≥ 0,05 em
tempo relativamente reduzido (1-3h).
-Uso de pressão para permitir velocidade de fluxo através da sílica:
Solvente elui na coluna na velocidade de 2-4 ml/min  aumenta
resolução por diminuir dispersão da banda e reduz tempo de corrida.
- Boas separações a relação amostra:adsorvente (1:20)
Rosane Nora -2021 -ECE
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1. Cromatografia em Coluna Rápida ( flash )- baixa pressão (30-75 psi)
Rosane Nora -2021 -
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Sistema manual
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Técnica de cromatografia líquida que utiliza
adsorvente de CCD (sílica gel 60 –
70-230mesh ou alumina) e um leve vácuo (20-70
mm Hg), o que permite uma separação rápida,
eficaz e barata de misturas complexas de
compostos orgânicos .
O adsorvente é aplicado seco em um funil de
vidro sinterizado. A amostra é aplicada por
método seco ou como solução. Em seguida, a fase
móvel é adicionada em porção e o vácuo é
aplicado após cada porção para coletar cada
fração.
3. Cromatografia líquida a vácuo (CLV) 
Vacuum Liquid Chromatography: An Alternative to Common Chromatographic 
Methods; N. M. Targett,’ J. P. Kilcoyne, and B. Green. J. Org. Chem., Vol. 44, 
No. 26, 1979
Rosane Nora -2021-ECE
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CLV: altura do sorvente não deve exceder 5 cm. 
Altura: 5,5 cm (± 3 cm de sílica)
Diâmetro: 4 cm
Amostra: ≈ 500 mg
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Nota
Sílica em seco = o vácuo promove o empacotamento da mesma. 
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Rosane Nora -2020
 técnica de separação rápida para a purificação de produtos para a síntese orgânica, ou
substâncias a partir de extratos naturais.
Isolera Prime – Biotage
 Sistema purificação flash – permite pressão até 
10 bar (145 psi)
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4. Cromatografia Flash
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