Imunoensaios com reagentes não marcados (imunodifusão, aglutinação, precipitação, testes rápidos, fixação por complemento e outros) - Imunologia clínica

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Os imunoensaios são técnicas para a detecção ou 
quantificação de antígenos ou anticorpos, podendo 
utilizar reagentes marcados ou não marcados. 
 Técnicas com reagentes não marcados: imuno 
difusão, aglutinação, precipitação. 
 Técnicas com reagentes marcados: radioativo, 
enzimático, fluorescente e quimioluminescente. 
 Cada técnica apresenta vantagens, desvantagens, 
aplicação específica; 
 Podem ser manuais, semi ou totalmente 
automatizados; 
 São utilizados anticorpos monoclonais (Ac) e 
antígenos recombinantes (Ag) para que ocorra o 
processo de antígeno-anticorpo. 
 Ac monoclonais: produção, homogêneos e 
caracterizáveis. 
 Ag recombinantes: produção em larga escala, 
caracterizáveis e especificidade. 
IMUNODIAGNÓSTICO 
 Designa o diagnóstico por técnicas imunológicas 
que revelam a presença de determinado antígeno 
(Ag) ou anticorpo (Ac) no organismo. 
 Ensaios ou Testes de Precipitação; 
 Fixação do complemento; 
 Neutralização ou Imunoensaios; 
 Imunofluorescência; 
 Radioimunoensaio; 
 Imunoenzimáticos; 
 Imunofluorimétricos; 
 Quimiluminescência. 
TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS 
REAGENTES NÃO MARCADAS 
 Técnicas rápidas; 
 Sistema homogêneo; 
 Sensibilidade reduzida; 
 Boa especificidade; 
 Direta – detecção de antígeno; 
 Indireta – detecção de anticorpo; 
 Baixo custo; 
 Dificultam automação; 
 Problemas com reprodutibilidade. 
 Não permitem detectar anticorpo de uma classe 
específica que sejam específicos para um 
determinado antígeno – de uma só vez. 
 
As reações de precipitação envolvem a 
combinação de antígeno solúvel com anticorpo 
solúvel par a produzir complexos insolúveis que são 
visíveis. 
 Quando as quantidades de antígeno e anticorpo 
são equivalentes (zona de equivalência) há a 
formação máxima de precipitado, decrescendo à 
medida em que um dos dois reagentes está em 
excesso. 
 precipitou: resultado positivo. 
 não precipitou: resultado negativo. 
 
 
imunoensaios com reagentes não marcados 
AULA 1 – IMUNOLOGIA CLÍNICA 
introdução 
precipitação
 
 
 
 
 É um teste de diagnóstico que envolve a difusão 
através de substância como o ágar, que geralmente é 
ágar de gel macio ou agarose, usado para a detecção 
de anticorpo ou antígeno. 
 Difusão de Ag e Ac solúveis em meio fluido ou 
semi sólido – complexo Ag-Ac; 
 Imunodifusão simples: fixa-se um dos reagentes 
no suporte e difunde-se o outro – complexo; 
 Imunodifusão dupla: ambos se movem = 
encontro – complexo; 
 Pode ser linear ou radial; 
IMUNODIFUSÃO RADIAL SIMPLES 
(MANCINI) 
 Nesta técnica o anticorpo é uniformemente 
distribuído no gel e o antígeno (amostra teste) é 
aplicado em um orifício. 
 É a variação quantitativa da imunodifusão radial 
dupla; 
 Amostra teste difunde radialmente no gel, 
formando um halo de precipitação circular em 
torno do orifício da amostra; 
 A difusão depende do tamanho do orifício, 
temperatura, consistência do gel, concentração 
do anticorpo incluído no gel, tempo de difusão e 
outros parâmetros; 
 Utiliza-se placa de vidro – mistura de ágar com 
solução de anticorpos específicos; 
 Perfurações em locais apropriados do gel – as 
amostras +3 concentrações conhecidas do Ag; 
 Quantificação de concentração em soro ou 
líquor; 
 Sensibilidade de 1 a 3ug/mL de antígeno; 
 Uso: Ig séricas, proteína C reativa (PCR) e 
proteínas do sistema complemento (C3, C4); 
 
 
 
IMUNODIFUSÃO RADIAL DUPLA 
(OUCHTERLONY) 
 É um método semiquantitativo baseado na 
premissa que quando ambos os reagentes (um 
antígeno desconhecido e moléculas de um anticorpo 
poliespecífico) são colocados a difundir em um meio 
suporte, o ponto onde os reagentes se encontram 
pode ser visualizado como uma linha ou banda de 
precipitação. 
 Precipitação Ag-Ac – linhas ou arcos – ausência 
de linhas indica ausência de Ag ou Ac; 
 Depende de concentração e tamanho da 
molécula, tamanho dos poros do gel, 
temperatura, concentração e pureza do ágar; 
 Camada de ágar sobre lâmina de vidro – 
perfuração – aplicação da amostra; 
 Desvantagens: lenta e baixa sensibilidade; 
 Uso: vários sistemas antigênicos (lúpus, artrite 
reumatóide, caxumba, esclerose sistêmica). 
 
 
 É uma técnica de imunoprecipitação, que 
combina eletroforese e imunodifusão radial em meio 
gelificado, em tempos distintos, mas com alto poder 
de resolução. 
 
imunodifusão
imunoeletroforese 
 
 
 
  É realizada em duas etapas: 
 Primeira etapa: envolve a separação 
eletroforética das proteínas. 
 Segunda etapa: imunodifusão de cada 
componente, a partir do seu centro de 
difusão, contra o anti-soro específico, 
formando uma linha ou arco de precipitação 
na região de equivalência. 
 Após a migração das moléculas por eletroforese, 
anticorpos específicos para as moléculas 
estudadas são adicionados a uma canaleta, de 
onde irão se difundir e se ligar aos antígenos, 
evidenciando cada uma das moléculas 
separadamente. 
 
 
 Baseada no princípio de que um 
imunocomplexos em solução dispersa luz em vários 
ângulos em relação à luz incidente. 
 Um nefelômetro utiliza uma fonte de luz de alta 
intensidade que incide em uma cubeta contendo 
os imunorreagentes; 
 A quantidade e a natureza da dispersão 
dependem da forma e do tamanho das partículas, 
da concentração, do comprimento de onda e do 
índice de refração do meio. 
 Ag-Ac em suspensão – dispersão de luz; 
 Vantagens: automatizada, fácil, rápida, precisa, 
com sensibilidade adequada e pequenos volumes 
de amostra, não necessita de separação de fases; 
 Desvantagens: alto custo do anti-soro, reações 
inespecíficas, múltiplas diluições de antígenos 
muito concentrados; 
 Uso: Ig, componentes do complemento, fator 
reumatóide, proteína C reativa, fatores de 
coagulação, imunocomplexos e hormônios. 
 
 
 É uma técnica analítica que se baseia no método 
de espectrofotometria, capaz de medir a turbidez de 
uma amostra. Neste método, mede-se a redução da 
transmissão de luz em um meio causado pela 
formação de partículas (suspensão ou colóides). 
 Ag-Ac em suspensão – luz transmitida; 
 Vantagens: não necessita separação de fases, 
rápida, precisa, econômica e automatizada; 
 Desvantagens: não pode ser usada em amostras 
muito turvas; 
 Uso: Ag, Ac, lipoproteínas, proteína C reativa, 
albumina. 
 
 
 
 A ligação cruzada com produção de agregados 
ocorre quando um anticorpo reage com um antígeno 
multivalente presente em uma partícula (insolúvel). 
 A partícula insolúvel pode ser um antígeno 
insolúvel nativo, antígenos expressos em células 
ou partículas cobertas com antígenos; 
 Complexo Ag-Ac – agregados visíveis; 
 Semiquantitativa – 500x mais sensível que 
precipitação; 
 Vantagens: baixo custo, facilidade e rapidez; 
 Desvantagens: reprodutibilidade, estabilidade 
do complexo formado e acessibilidade; 
 Vários tipos de sistemas; 
 Fatores interferentes: 
 classes de Ac – IgM 750 vezes mais 
eficientes que IgG. 
 eletrólitos; 
 pH (ideal entre 6,0 e 8,0); 
 tempo; 
 temperatura; 
 estabilidade da ligação ao suporte 
(adsorção); 
 concentração de Ag ou Ac (falso negativo). 
 nefelometria 
turbidimetria 
aglutinação 
 
 
 
 
REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO 
 Tipos de reações de aglutinação: 
 Aglutinação direta; 
 Aglutinação indireta; 
 Reação de inibição de aglutinação; 
REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO DIRETA 
 Nesta reação utilizam-se partículas antigênicas 
insolúveis em sua forma íntegra ou fragmentada: 
hemácias, bactérias, fungos e protozoários podem 
ser aglutinados diretamente por anticorpo. São 
realizadas diluições em série do anticorpo frente a 
uma quantidade constante do antígeno. Após um 
período de incubação a aglutinação se completa e o 
resultado é geralmente expresso como a máxima 
diluição em que ocorre a aglutinação. 
 Partículas antigênicas insolúveis íntegras ou 
fragmentadas; 
 Realizada em tubo ou lâmina; 
 Uso: toxoplasmose,brucelose, identificação de 
grupo sanguíneo, diagnóstico de mononucleose 
infecciosa, Salmonelose, leptospirose 
 Para a identificação de antígenos – teste direto. 
 
 
 
REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO INDIRETA 
 Nas reações de aglutinação indireta ou passiva, 
as hemácias e as partículas inertes (bentonita, látex, 
sepharose, leveduras, gelatina) podem ser 
sensibilizadas por adsorção passiva. 
 Devido à grande diversidade de antígenos que 
podem ser ligar às células ou partículas, a 
aplicação dos testes de aglutinação indireta é 
muito variada. 
 Detecta IgG e IgM; 
 Uso: diagnóstico da toxoplasmose, doença de 
Chagas, fator reumatóide, proteína C reativa, 
aslo. 
 
 
 
 Os testes rápidos (aglutinação em placa – 
teste de látex). 
 Partículas de látex são esferas de poliestireno 
utilizadas como suporte na adsorção de proteína 
solúvel e antígeno polissacarídicos, funcionando 
como sistema indicador da reação Ag-Ac. 
 O teste pode ser empregado na pesquisa de 
antígenos ou anticorpos. A aplicação mais 
comum é na detecção de fator reumatóide IgM, 
dirigido contra isotipos de IgG, IgA, IgM ou IgE. 
testes rápidos
 
 
 
 
 
 
 
 
 VDRL 
 RPR (rapid plasm reagin) 
 Uso: pesquisa de reaginas. 
 
 
 
 Reação de fixação por complemento: 
 
 
hemaglutinação passiva 
reação de microfoculação 
fixação por complemento