5 TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS - REAGENTES NÃO MARCADOS (PRECIPITAÇÃO, AGLUTINAÇÃO, REAÇÃO DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO)

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TESTES SOROLÓGICOS 
MÉTODOS IMUNOLÓGICOS DE DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
Introdução:
Detecção do imunocomplexo
Visualização (precipitação, floculação, aglutinação, fixação do complemento)
= Reações biológica
Os imunoensaios são técnicas para a detecção e quantificação de antígenos ou
anticorpos, podendo utilizar reagentes tanto marcados como não marcados.
Anticorpos monoclonais.
Obtenção de Ag (recombinantes, sintéticos).
Aperfeiçoamento dos testes existentes.
Complementação ao diagnóstico
PRECIPITAÇÃO
As técnicas de precipitação permitem a quantificação de precipitados formados
pela reação Ag - Ac.
Primeiros a serem utilizados.
Baixa sensibilidade.
Limite de detecção: 0,1 a 0,5 mg/ml (limita a aplicação dos testes).
Visualização macrocomplexos.
A interação dos anticorpos com os antígenos correspondentes pode ser
visualizada diretamente e utilizada em testes laboratorias.
O tipo de método utilizado depende anticorpo produzido.
Interferentes físico-químicos e imunológicos (proporções adequadas de Ag e
Ac).
Antígenos solúveis combinados aos anticorpos específicos. 
Os complexos antígeno-anticorpo formam agregados insolúveis grandes, malhas
que consomem um grande número de moléculas de anticorpo
 Teoria das Malhas: 
Baseia-se na formação de malha ou rede, alternando moléculas de Ag e Ac, que
quando em equilíbrio, isto é, quantidade de Ag=Ac (zona de equivalência) ocorre
precipitação. A formação de linhas de precipitação em qualquer tipo de imunodifusão
é dependente das concentrações de antígeno e anticorpo.
pró-zona: excesso Ac (realizar diluição dos soros). 
pós-zona: excesso de Ag
Zona de equivalência: ocorre precipitação (equilíbrio, isto é, quantidade de
Ag=Ac).
Pró-zona: excesso anticorpo (realizar diluição dos soros)
Pós-zona: excesso de antígeno
Técnicas baseadas nas reações de precipitação 
Imunodifusão: 
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Simples: ou o antígeno ou o anticorpo permanece fixado ao suporte e o outro
migra (move-se).
Dupla: tanto o Ag como o Ac migram.
Linear (unidimensional): em uma direção. 
Radial (bidimensional): em várias direções. 
Imunoeletroforese. 
Eletroimunodifusão. 
Imunodifusão Simples Linear (Unidimensional de Oudin).
Difusão Unidimensional Dupla (Dupla Linear).
Imunodifusão Radial Simples (ou de Mancini).
Imunodifuão Radial Dupla (Imunodifusão Dupla ou de Ouchterlony).
Eletroimunodifusão Dupla Unidimensional (Contra-Imunoeletroforese,
Imunoeletroforese Cruzada).
Eletroimunodifusão Simples Unidimensional (De Foguete ou de Laurell)
Técnicas de precipitação - Imunodifusão
1) Difusão unidimensional simples: o gel é colocado em tubo, anticopo fixo enquanto
e o antígeno é adicionado no topo da coluna e migra, na zona de equivalência forma-
se o precipitado na forma de halos baixa S, 72 horas para observar o halo; pouco
utilizada.
2) Difusão Unidimensional Dupla entre o antígeno e o anticorpo coloca-se mais uma
camada de gel sem reagente); ambos se difundem formando linhas ou bandas de
precipitação baixa S, tempo longo, técnica pouco utilizada. 
3) Difusão Radial Simples Placa de Petri com ágar com anticorpo, em que são feitos
orifícios, adicionar o antígeno que migra radialmente a partir do um orifício feito no
gel, formando um precipitado (halo circular) após 48 – 72h observa-se precipitado,
kits comerciais, reprodutível, elevada precisão, detecção de proteínas séricas (Ig e
complemento). 
4) Difusão Radial Dupla adição de antígeno e anticorpo em diferentes orifícios, que
migram simultaneamente um contra o outro, formam-se linhas (arcos de
precipitação) comparação simultânea de vários sistemas antigênicos (amostras x
soro anticorpo ou antígeno - padrão).
ELETROFORESE
5) Imuoeletroforese:
Separação.
Imunodifusão de cada componente contra seu centro de difusão, formando uma
linha ou arco de prcipitação.
Método qualitativo, diiagnóstico de paraproteinemias, distinguir aumentos
policlonais e monoclonais.
ELETROIMUNODIFUSÃO 
6) Contra-Imunoeletroforese: antígeno e anticorpo migram juntos, eletrosmose que
arrasta a Ig ao sentido contrário da corrente, e o ntígeno migra no sentido da
corrente (Ag carga+/Ac carga -); semelhante a dupla difusão, a corrente elétrica
acelera a interação Ag-Ac, 20 minutos; pouco utilizada.
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7) Eletroimunodifusão Simples Unidimensional: anticorpo incorporado ao ágar, o
antígeno é colocado em pq orifício submetido a eletroforese, formando-se um cone
de precipitação (margens) ( quantificação de antígeno). 
 
REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO
O princípio das técnicas de aglutinação é o mesmo das de precipitação, mas o
componente conhecido, antígeno ou anticorpo, está adsorvido a
partículas/células, o que facilita em muito a visualização do complexo AgAc na
forma de agregados. 
A aglutinação é a formação de agregados suficientemente grandes de células
interligadas por pontes moleculares de anticorpos que se combinam
simultaneamente com dois epítopos iguais, porém situados à superfície de duas
células diferentes. 
Vantagens
depende somente do tamanho dos agregados formados.
semiquantitativas. 
mais sensíveis que precipitação (as partículas amplificam a reação/elevada
sensibilidade).
simples, rápido.
partículas com determinantes antigênicos naturais em sua superfície (hemácias,
bactérias protozoários).
partículas inertes (látex, poliestireno, bentonita).
baixo custo.
leitura visual.
facilidade de execução
Desvantagens
reprodutibilidade dos lotes. 
acessibilidade para a interação AgAc.
estabilidade da ligação AgAc no suporte
Fatores importantes nas técnicas de aglutinação:
padronização adequada da suspensão de partículas/células.
concentração ótima do antígeno ou anticorpo a ser fixado nas partículas/células.
estabilidade da ligação ao suporte, que geralmente é por simples adsorção.
acessibilidade da molécula ligada ao suporte.
meio (pH, íons, proteínas e conservantes) onde será realizará a interação. 
concentração de antíeno ou anticorpo (falso ngativo).
Emprego
Para diagnóstico de doenças causadas por vírus, bactérias, protozoários e
fungos, doenças auto-imunes, detecção de hormônios, tipagem sangüínea
Tipos:
Direta.
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indireta ou passiva
Inibição de aglutinação
Teste de Aglutinação Direta
Na aglutinação direta o antígeno faz parte naturalmente da partícula/célula,
como por exemplo, antígenos eritrocitários (sistema ABO) em hemácias
humanas, antígeno I de hemácias humanas tipo O, antígenos heterófilos
heterófilos em hemácias de carneiro e de cavalo, antígenos O, H e Vi na
Salmonella, etc. 
Teste de Aglutinação Indireta
Tem-se partículas ou células sensibilizadas com antígenos ou anticorpos, de
modo que a partícula/célula é apenas um suporte inerte na interação AgAc. São
muito empregadas partículas de poliestireno (látex), carvão e gelatina e
hemácias de aves e carneiros (quando as células são hemácias, a técnica é
chamada de hemaglutinação).
Inibição de Aglutinação 
Para amplificar a sensibilidade do método de aglutinação para a detecção de
antígenos, a variante de inibição introduz uma segunda etapa no ensaio. Na
primeira etapa a amostra com suspeita de conter o antígeno é incubada com o
primeiro reagente de Ac específico em solução para formar o complexo AgAc.
Anticorpo em solução têm maior facilidade (acessibilidade) de interagir com o
antígeno na amostra, se houver, do que se estiverem acoplados a
partículas/células. Se a amostra não contiver o antígeno, os anticorpos ficarão
livres e na segunda fase reagirão comAg adsorvidos em um suporte (segundo
reagente). Ou seja, se ao final se observa aglutinação, o teste é negativo para
antígeno na amostra, se não há aglutinação é porque os Ac do reagente foram
utilizados pelo antígeno na amostra (teste positivo).
Na aglutinação indireta, a tecnologia permite sensibilizar partículas ou células
com antígenos ou anticorpos, de modo que a partícula/célula é apenas um
suporte inerte na interação. Exemplos de testes de aglutinação muito
empregados em Imunologia Clínica.
 
Bibliografia:
"Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e Auto-Imunes" autores
Antonio Walter Ferreira e Sandra Ávila, 2001, Guanabara Koogan.
 
Exercício 1:
O método de imunodifusão de Mancini é
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A)
Utilizado para a determinação de anticorpos em meio líquido.
 
B)
Uma reação de aglutinação.
C)
Uma reação de dupla imunodifusão.
 
D)
Utilizado para a determinação quantitativa de antígenos.
E)
Emprega hemácias como suporte.
Comentários:
Essa disciplina não é ED ou você não o fez comentários 
Exercício 2:
O teste de Aglutinação Indireta utiliza antígenos solúveis adsorvidos na superfície da
partículas inertes. As hemácias são um tipo de suporte. Para a pesquisa de
anticorpos para a Doença de Chagas, 
A)
O teste Aglutinação Passiva apresenta sensibilidade e especificidade.
B)
Emprega partículas de látex como suporte.
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C)
Emprega hemácia como suporte, o que reduz a sensibilidade.
D)
É um teste amplamente empregado em bancos de sangue.
E)
O teste Aglutinação Passiva é específico e sensível, mas não diferencia a fase da doença.
Comentários:
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Exercício 3:
O teste de aglutinação indireta ou passiva emprega a adsorção de anticorpos ou
antígenos solúveis proteicos ou polissacarídeos na superfície de micropartículas
inertes (suportes) que não interferem na interação antígeno-anticorpo. Um suporte
muito utilizado são micropartículas de poliestireno (látex), homogêneas quanto ao
tamanho, com a vantagem de permitir a realização de testes rápidos de aglutinação
em lâminas ou placas planas e com leitura em minutos. A técnica de látex
A)
apresenta baixa sensibilidade e baixa especificidade, o que não caracteriza o teste para bancos de sangue.
B)
é um teste de alto custo além de ser empregado somente para apesquisa de antígenos.
C)
apresenta baixo custo e boa sensibilidade, pode ser empregado para a pesquisa de antígenos e anticorpos.
D)
apreasenta baixo custo, mas não é reprodutível o que não permite padronização.
E)
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pode ser um teste automatizado para a pesquisa simultânea de antígenos e
anticorpos.
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Exercício 4:
O teste de VDRL é uma técnica empregada para a investigação de Sífilis. Trata-se de um teste de floculação 
A)
que emprega partículas de látex sensibilizadas com antígenos.
B)
que emprega hemácias como suporte.
C)
que emprega partículas de látex como suporte.
D)
que apresenta baixa sensibilidade e especificidade.
E)
que emprega o antígeno de cardiolipina, com colesterol e lecitina.
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