DNA recombinante

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DNA recombinante
 Como um gene é isolado e amplificado pela clonagem?
 Como um DNA específico é identificado?
 Como o DNA é amplificado sem clonagem?
 Como as tecnologias de DNA são aplicadas?
Tecnologia do DNA recombinante
Termo que descreve técnicas coletivas para obter, amplificar e manipular
fragmentos específicos de DNA. 
Engenharia genética
(aplicação da tecnologia do DNA a problemas específicos biólogicos, 
médicos e relacionados a agricultura)
Como amplificar um gene de interesse?
DNA recombinante
Clonagem de DNA
1- Fonte de DNA
2- Clivagem do DNA em locais específicos
3- Utilização de um vetor de clonagem
4- Ligação do fragmento de DNA de interesse ao vetor de clonagem 
formando o DNA recombinante
5- Introdução do DNA recombinante em um organismo hospedeiro 
para que ocorra a replicação do DNA
6- Seleção ou identificação de células hospedeiras que contêm o DNA 
recombinante
Etapas de criação do DNA recombinante
1) Fonte do gene a ser clonado
 DNA genômico 
Interesse em regiões regulatórias
Clivagem por Enzimas de restrição
 cDNA (DNA complementar de um RNA mensageiro) 
Interesse na sequência codificante
Não necessita ser fragmentado
Síntese do cDNA
2) Clivagem por Enzimas ou endonucleases 
de restrição
•Descobertas em 1960 e isoladas de inúmeras espécies de bactérias as quais têm a função 
de protegê-las de infecções virais. 
• Reconhecem, na dupla hélice do DNA, sítios de clivagem que são sequências específicas de 4 ou 6 pb
E são palindrômicas (a seq. de reconhecimento, lida na direção 5’-3’, é a mesma em ambas as direções do DNA) 
Uma vez reconhecido, é realizado um corte específico em cada ponto ou sítio em que as moléculas da enzima se ligam.
• Esses sítios, além de estarem presentes no vírus, também existem no DNA de todos os outros organismos, 
inclusive na própria bactéria que produz a enzima. 
Enzimas ou endonucleases de restrição
Reconhecimento de diferentes sítios de clivagem 
Tipos de cortes: 
- Produção de extremidades coesivas
- Produção de extremidades cegas
COESIVAS CEGAS
3) Vetores de clonagem
Características:
- Possuir origem de replicação
- Múltiplos sítios de clonagem (MCS)
- Gene de resistência a antibiótico (marcador de seleção)
Alguns tb contém um marcador rastreável 
(produz uma ptn colorida ou fluorescente)
São moléculas de DNA usadas para “transportar” sequências 
clonadas em diferentes organismos 
Tipos de Vetores de clonagem
Cosmídeos: híbridos modificados de fagos e plasmídeo. Os cosmideos são 
inseridos em particulas de fago que atuam como seringas.
Cromossomo artificial P1: vetor derivado do bacteriofago P1. Bacteriófagos: vírus
que infectam bactérias
BACs
Cromossomos Artificiais Bacterianos
Marcardor rastreável
Gene de resistência ao antibiótico
cloranfenicol
Codificam ptns que direcionam a 
distribuição fidedigna dos cromossomos
Recombinantes para as células-filhas
YACs
Cromossomos artificiais de levedura
Contêm todos os elementos necessários para
manter um cromossomo eucariótico no núcleo
da levedura:
- Origem de replicação
- marcadores de seleção
- sequências especializadas derivadas de
Centrômeros e telômeros (garantem a estabilidade
E segregação dos cromossomos na divisão celular
3) Preparação do vetor
4) Ligação do inserto ao vetor – DNA ligase
Uma bacteria competente é uma bactéria que está apta a receber DNA exógeno. 
A competência pode ocorrer naturalmente ou pode ser induzida
5) Introdução do DNA recombinante nas bactérias
- Método químico associado ao choque térmico
Transformação de bactéria
Solução de cloreto de cálcio
Choque térmico: 42°C
Transformação de bactéria
- Eletroporação
Transformação de bactéria
As bactérias são submetidas a um curto pulso elétrico fazendo
Com que poros transientes sejam formados. Os plasmídeos
entram por estes poros que são rapidamente fechados
- Eletroporação
Transformação de bactéria
Formação de poros na membrana
6) Seleção dos clones recombinantes
Crescimento em placas de ágar para obtenção dos clones
a
Bibliotecas
São coleções de sequencias de DNA usadas 
para armazenar informação-> coleção de 
genes recombinantes.
• isolamento de um gene específico;
• sequenciamento;
• clonagem;
• identificação de genes em diferentes 
espécies;
Bibliotecas genômicas
(genoma completo é clivado
E clonado em vetores de clonagem)
Sequenciamento do genoma, descoberta
de genes ou determinação da função
gênica
Bibliotecas de cDNA
(sequencias de DNA expressas, ou seja,
transcritas em mRNA)
DNA que representa uma população de mRNAs. Objetivo é gerar ESTs 
(Expressed Sequence Tags) que amostrem os genes expressos (induzidos ou 
reprimidos) sob uma determinada condição (tecido, célula ou estresse).
Métodos alternativos para a identificação do insert em
uma colônia de bacteria
 Digestão com enzimas de restrição do plasmídeo
obtido de diferentes clones 
- Isolamento do DNA plasmidial
- Análise do tamanho do plasmídeo
- Análise do tamanho do insert
 PCR se a sequência do inserto for conhecida
Sequenciamento do fragmento de DNA clonado 
Última etapa
Sequenciamento do gene clonado
Obtenção da sequência completa de nucleotídeos 
de um fragmento de DNA
Métodos de Sequenciamento
Notable 
awards •Nobel Prize in 
Chemistry (1958)
•Royal Medal (1969)
•Gairdner Foundation 
International Award (1971)
•William Bate Hardy 
Prize (1976)
•Copley Medal (1977)
•Louisa Gross Horwitz 
Prize(1979)
•Nobel Prize in 
Chemistry (1980)
http://en.wikipedia.org/wiki/Nobel_Prize_in_Chemistry
http://en.wikipedia.org/wiki/Royal_Medal
http://en.wikipedia.org/wiki/Gairdner_Foundation_International_Award
http://en.wikipedia.org/wiki/William_Bate_Hardy_Prize
http://en.wikipedia.org/wiki/Copley_Medal
http://en.wikipedia.org/wiki/Louisa_Gross_Horwitz_Prize
http://en.wikipedia.org/wiki/Nobel_Prize_in_Chemistry
Nucleotídeos
Sanger modificado
Cada ddNTP é marcado com um fluoróforo diferente
(cerca de 200pb)
Ion Torrent
Expressão de proteínas 
recombinantes
Genes clonados podem ser expressos para amplificar 
a produção protéica
Proteínas que possuem:
- Valor comercial
- Terapêutico
- Pesquisa
Purificação de proteínas para:
- Estudo da função
- Mecanismos enzimáticos
- geração de anticorpos
- estudo de interações protéicas
Vetores de Expressão
Funções do tag
O tag é uma sequência curta de nucleotídeos que codifica um peptídeo com
poucos aminoácidos
• Pode ser inserido à extremidade N ou C do produto do gene clonado
• Permite a detecção e purificação de proteínas
• Diferentes tags podem ser usados:
Inserto contendo epítopo
A tecnologia do DNA recombinante é utilizada na produção de insulina artificial que é obtida através da 
bactéria Escherichia coli, sendo geneticamente modificada e capaz de sintetizar o hormônio. A insulina é o principal 
meio utilizado no tratamento do Diabetes Mellitus (DM), uma doença crônica que ocorre quando o pâncreas não 
produz insulina suficiente ou quando o corpo não utiliza eficazmente a insulina produzida. Com essa tecnologia a 
insulina artificial é produzida em menor tempo e em maior escala, beneficiando os portadores do DM, para que dessa 
forma possam levar uma vida normal. 
Uso das técnicas de engenharia genética
Gene transferido (transgene) – organismo transgênico
A introdução de um gene em um organismo tornou-se um aspecto
Central da biologia básica, mas também tem ampla aplicação comercial. 
Estudos de transgênese utilizando diferentes organismos
 S. cerevisiae
 Plantas
(plasmídeo Ti)
 Animais
C. elegans
D. melanogaster
M. musculus
Humanos Terapia gênica
Como se transfere o DNA para célula hospedeira humana?
• Tratamento de doenças hereditárias: imunodeficiência 
combinada grave (“menino da bolha”), fibrose cística, 
Parkinson, etc
• Doenças degenerativas, 
• Câncer 
• Doenças infecciosas 
Alvos da terapiagênica
Retrovírus possuem a habilidade de integrar o seu DNA nos
cromossomos da célula infectada. Eles infectam somente as
células que estão proliferando.
Lentivírus permitem também transferir material genético para
células que não proliferam (como os neurônios e células do
fígado) e que proliferam ou para células refratárias para o
retrovírus (como as células retiradas da medula óssea).
Adenovírus não são capazes de integrar o seu DNA ao
cromossomo da célula hospedeira. Eles podem transportar
genes de grandes dimensões, mas a expressão deles não dura
muito tempo.
Vetores Virais
Vírus manipulados geneticamente, de modo a reduzir a sua patogenicidade, 
sem anular totalmente o seu poder de infectar as células do hospedeiro
Eficiência da transferência
Vetores que possam transferir o DNA de modo eficiente, principalmente para células 
alvo. 
Duração da expressão
As pesquisas estão orientadas de maneira a desenvolver sistemas que apresentem 
uma expressão duradoura, de modo a submeter o paciente a um único tratamento, ou a 
tratamentos repetidos em períodos maiores (anos).
Segurança do procedimento
Alguns destes derivam de vírus como o HIV. É então necessário que antes do uso 
destes vetores sejam submetidos a critérios de segurança, particularmente no que 
concerne a presença de genes que podem determinar a patogenicidade do vírus 
utilizado para infectar.
Reação imunitária
O produto do gene novo, o gene propriamente dito ou seu vetor podem desencadear 
uma resposta imunitária no organismo. Isto pode causar a eliminação das células 
modificadas geneticamente, ou a inativação da proteína produzida pelo gene novo. 
Os limites da terapia gênica