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INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE CURSO DE FARMÁCIA ROTEIRO PARA AULAS PRÁTICAS DISCIPLINA BIOQUÍMICA CLÍNICA Curso: FARMÁCIA Disciplina: Bioquímica Clínica Título da Aula: Coleta de material biológico AULA 1 Roteiro 1 OBJETIVO: Relembrar coleta de material biológico. Explicar diferença entre soro, plasma, sangue total. Explicar como é feita a coleta de urina e outros líquidos biológicos como líquor Explicar a função de anticoagulantes na punção venosa, mostrando os tubos com as respectivas tampas. Caso seja necessário fazer a conservação de amostras, explicar como é feita PROCEDIMENTO: Passos para a coleta com sistema a vácuo e coleta múltipla (demonstrativa em braço de plástico ou fazer apenas o item 3 e 4 em braço do colega, com supervisão do professor pois não pode ficar garroteado muito tempo): 1. Rosqueie a agulha no adaptador (canhão). Não remova a capa protetora de plástico da agulha; 2. Oriente o paciente quanto ao procedimento; 3. Ajuste o garrote e escolha a veia; 4. Faça a antissepsia do local da coleta com algodão umedecido em álcool 70%; 5. Faça a punção e após introduza o tubo no suporte, pressionando-o até o limite; 6. Solte o garrote assim que o sangue começar a fluir no tubo; 7. Separe a agulha do suporte com a ajuda do frasco desconectador ou com uma pinça e 8. Descarte-a no recipiente adequado para material perfurocortante; 9. Oriente o paciente a pressionar com algodão à parte puncionada, mantendo o braço estendido, sem dobrá-lo. Cor Tampa Anticoagulante Setor Material Roxo EDTA Hematologia Vidro ou plástico Amarelo Gel separador com ativador de coágulo Sorologia e bioquímica Vidro ou plástico Verde Citrato de Sódio Hematologia (Coagulação) Vidro Vermelho Siliconizado sem anti-coagulante Sorologia e bioquímica Vidro ou plástico Cinza Fluoreto de sódio + EDTA Bioquímica Vidro ou plástico MATERIAIS QUANTIDADE · Tubos de coleta à vácuo Ver procedimento · algodão · álcool EQUIPAMENTOS QUANTIDADE garrrote Ver procedimento Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança: Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança. As soluções presentes nos tubos deverão ser desprezadas na pia, com água corrente. Os materiais perfurocortantes e materiais biológicos devem ser descartados em DESCARPAK ATIVIDADE DE FIXAÇÃO 01 – Uma técnica enganou e durante a coleta de sangue usou o tubo com tampa vermelha para hemograma. Discutir se será possível fazer o exame e porquê. 02 – H.M.G., homem 30 anos, atleta, chegou ao laboratório para coletar sangue para fazer check-up após corrida de 5 km e relatou que no dia anterior tomou cerveja. Não relatou que toma sinvastatina. Discutir se o exercício físico minutos antes do teste, ingesta de álcool e não relatou do medicamento pode interferir nos resultados. Curso: FARMÁCIA Disciplina: Bioquímica Clínica Título da Aula: Princípios de fotometria AULA 1 Roteiro 2 OBJETIVO: Determinar o espectro de absorção de uma solução de albumina com reagente de biureto. Caracterizar o comprimento de onda (λ) onde ocorre absorção máxima. Construir uma curva padrão da uma solução de padrão de albumina, com o comprimento de onda escolhido e descobrir qual a concentração do tubo teste PROCEDIMENTO: PREPARO DO APARELHO 1- Após ligar o aparelho 2- Selecionar o comprimento de onda adequado. 3- Ajustar para o zero de absorbância e 100% de transmitância com água destilada para zerar o aparelho 4- Colocar tubo branco e zerar o experimento 5- Verificar o tubo padrão 2- Fazer um tubo chamado de branco (1,5 mL de água + 2,5 mL de reagente de biureto) e um tubo chamado de padrão (1,0 mL de padrão de albumina (8 mg/mL) + 0,5 mL de água + 2,5 mL de reagente de biureto). Agitar e incubar os tubos por 15 min a 370C. Zerar com branco e proceder a leitura do tubo padrão Ler a absorbância do tubo teste nos comprimentos de onda 400, 420, 450, 470, 500, 520, 550, 580, 600, 630, 650, 680 e 700 nm, usando o branco entre as medições. Construir uma curva de absorbância em função do comprimento de onda. Estabelecer qual é o máximo do produto da reação de biureto. 3- Preparar um tubo chamado de teste (que não sabemos a concentração), contendo (1,0 mL de solução problema – preparada pelo professor + 0,5 mL de água + 2,5 mL de reagente de biureto) e outros 3 tubos padrão chamados de: A= (0,1 mL de padrão de albumina (8 mg/mL) + 1,4 mL de água + 2,5 mL de reagente de biureto). B= (0,3 mL de padrão de albumina (8 mg/mL) + 1,2 mL de água + 2,5 mL de reagente de biureto). C= (0,5 mL de padrão de albumina (8 mg/mL) + 1,0 mL de água + 2,5 mL de reagente de biureto), D= (1,0 mL de padrão de albumina (8 mg/mL) + 0,5 mL de água + 2,5 mL de reagente de biureto) Proceder como no item anterior: agitar e incubar os tubos por 15 min a 370C. Ler a absorbância a 540nm. Construir uma curva, e tentar calcular a concentração de proteína da solução problema nesta amostra (comentar a necessidade de uso de triplicatas e mais pontos na curva). MATERIAIS QUANTIDADE Solução de albumina (8mg/mL) 10mL por grupo Tubos 10 estante 1 cubeta Pelo menos 2 por grupo Água Reativo de biureto 20 mL por grupo EQUIPAMENTOS QUANTIDADE Pipetas automáticas com ponteiras 1 de cada volume a ser utilizado espectrofotômetro 1 Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança: As soluções presentes nos tubos deverão ser desprezadas na pia, com água corrente ATIVIDADE DE FIXAÇÃO 1- Um estudante percebe que a identificação do tubo apagou e ele tem 1 tubo com cor muito clara (A), um mais escuro (B) e outro bem mais escuro (C). Sabendo-se que o padrão desta medida tem 100mg/dl, podemos sugerir que (A) é branco? E o padrão é (B) ou (C)? Discutir por sim ou não. 2- O aluno percebeu que pipetou albumina com a pipeta automática errada, e ao invés de usar P200 usou P20. Quais as implicações deste erro na dosagem de albumina de soro de paciente? Curso: FARMÁCIA Disciplina: Bioquímica Metabólica Título da Aula: Perfil Renal - Ureia, creatinina e ácido úrico AULA 2 Roteiro 1 OBJETIVO: Revisar conceitos sobre função renal e como que a análise de ureia, creatinina e ácido úrico podem explicar a saúde renal. Comentar a prova de depuração de creatinina Explicar a necessidade de ter os Gráficos de Levey-Jennings e regras de Westgard para os testes de laboratório clinico PROCEDIMENTO: O aluno deverá receber a bula de instruções do fabricante do kit de determinação do analito, e com o auxílio do professor, interpretá-la: tanto no procedimento como no resultado, explicando as implicações patológicas do exame. MATERIAIS QUANTIDADE Por grupo Kit de ureia , creatinina e ácido úrico Suficiente para 1 grupo Soro (normal ou patológico) Suficiente para 1 grupo Cubetas 2 unidades Papel absorvente 1 rolo pipetas automáticas e ponteiras 1 pipeta de 20ul ou 100ul, 1 pipeta de 1ml ou 5 ml Tubos de ensaio 4 tubos por grupo Estante 1 por grupo EQUIPAMENTOS QUANTIDADE Espectrofotômetro 1 por bancada Banho maria 1 por bancada Descarte Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança. As soluções presentes nos tubos deverão ser desprezadas na pia, com água corrente. ATIVIDADE DE FIXAÇÃO: 01-Homem, 67 anos, sente muitas dores nos tornozelos e joelho após comer frutos do mar. Estes locais ficam vermelhos e inchados. Há possiblidade de ter litíase biliar pela mesma causa? 2- Explicar por que é comum em pacientes com insuficiência renal crônica ocorrer anemia, hipercalcemia e hipertensão Curso: FARMÁCIA Disciplina: Bioquímica Metabólica Título da Aula: Perfil Renal- Uroanálise AULA 2 Roteiro 2 OBJETIVO: Relembrar a formação de urina e explicar a função dos exames físicos, químicos e microscópicos da urina (EAS-Elementos Anormais do Sedimento) Relembrar a função renal e as substâncias que são reabsorvidas e que excretadaspelos rins. Explicar por que a proteinúria (“urina espumosa”) é um marcador da doença renal, especificando a microalbuminúria e macroalbuminúria. Explicar o fundamento da fita de teste de urina e sua interpretação Discutir influências pré-analíticas como uso de medicamentos ou outras situações (menstruação, desidratação etc.) PROCEDIMENTO: O aluno deverá receber a tira de teste de urina. Emergir a fita na urina, tirar o excesso fazer a leitura colorimétrica usando o padrão de cores que acompanha a fita. Observar o tempo correto de leitura MATERIAIS QUANTIDADE Por grupo Tira de teste para glicosúria Suficiente para 1 grupo urina (normal ou patológico) Suficiente para 1 grupo microscópio Suficiente para 1 grupo Descarte Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança. A urina deverá ser desprezada na pia, com água corrente e as fitas descartadas em lixo para material infectante. RECORDAÇÃO SOBRE UROANÁLISE Volume - Não possui significado clínico e seu relato é opcional. O valor normal de urina produzida em 24 horas em adultos é de 1200 a 1500 mL e em crianças 15 mL/ Kg de peso. Cor - A cor da urina depende da presença e concentração de pigmentos de origem alimentar, medicamentosa e até mesmo endógena A urina normal geralmente é amarelada devido à presença de um pigmento chamado urocromo, produto do metabolismo endógeno e produzido em velocidade constante. Como variações de coloração nas amostras de urina anormais encontramos: · Amarelo Palha- Recente ingestão de líquidos ou no caso de diabetes (tanto insípidus quanto mellitus). · Âmbar- Presença de bilirrubina na amostra. · Alaranjada- Interferência de medicamentos, como Piridium ou mesmo vitamina A. · Vermelha- Presença de hemácias, hemoglobina, mioglobina e porfirinas. · Castanha / Preta - Alcaptonúria (presença de ácido homogentísico), presença de melanina. · Verde - Interferência de medicamentos (Amitriptilina, metocarbamol, indican e azul-de-metileno). Aspecto - Termo que se refere à transparência da amostra de urina analisada. A urina “normal” tem aspecto límpido, porém pode sofrer alterações devido à presença de numerosas células epiteliais, de leucócitos, hemácias, bactérias e leveduras, filamentos de muco e de cristais. Exame Físico Químico Realizado através de tiras reativas (reagentes) contendo seguintes áreas reagentes: pH, proteínas, glicose, cetona, sangue, bilirrubina, urobilinogênio, nitrito, leucócitos e densidade. As tiras reagentes baseiam-se em metodologia de química seca cujos resultados podem ser determinados visualmente ou através de instrumentos semi-automatizados ou automatizados. Com relação a utilização das tiras reagentes, é necessário, inicialmente, homogeneizar bem a amostra e a seguir mergulhar rapidamente a tira reagente na amostra e retirar o excesso de urina da mesma. A leitura visual é realizada comparando as cores obtidas com a escala-padrão, respeitando o tempo de cada reação. Já as leitoras semi-automatizadas ou automatizadas são fotômetros de reflectância que medem a luz refletida a partir da área reagente. pH - Os rins são os responsáveis pela manutenção do equilíbrio ácido-base do organismo, eles são capazes de manter a homeostasia do corpo eliminando grandes quantidades de ácidos ou bases através da urina. Densidade - Ajuda a avaliar a função de filtração e concentração renais e o estado de hidratação do corpo. Proteínas - Normalmente, as proteínas urinárias são constituídas pela albumina e por globulinas secretadas pelas células tubulares. Entre as proteínas não plasmáticas observadas na urina, destaca-se a mucoproteína de Tamm-Horsfall, proveniente dos túbulos distais. Sua importância decorre do fato de que esta proteína é a base dos cilindros encontrados na urina. Glicose – em situações normais quase toda a glicose filtrada pelos glomérulos é reabsorvida pelos túbulos proximais. Cetonas – O termo cetonas envolve três produtos intermediários do metabolismo de gorduras: acetona, ácido acetoacético e ácido beta-hidroxibutírico. Sangue (hemácias / hemoglobina) - Pode estar presente na urina na forma de hemácias íntegras ou na forma de hemoglobina (produto da destruição de hemácias in vivo ou in vitro). Sofre interferência da mioglobina. Bilirrubina - Produto intermediário da degradação da hemoglobina. Presente no organismo de duas formas: bilirrubina não-conjugada e bilirrubina conjugada, porém, somente a última é excretada pelos rins e pode aparecer na urina. Urobilinogênio – pigmento resultante da degradação da hemoglobina. Nitrito - Aparece devido a capacidade de algumas bactérias gram negativas fermentadoras reduzirem o nitrato (constituinte normal da urina) em nitrito. Leucócitos – detecta esterases presentes nos granulócitos Análise do Sedimento Tem a finalidade de detectar e identificar todos os elementos insolúveis, como hemácias, leucócitos, cilindros, cristais, células epiteliais, bactérias, leveduras, parasitas e possíveis artefatos. Pode ser realizado através de: . Microscopia óptica comum: Câmara de contagem, entre lâmina e lamínula ou sistemas padronizados; Preparo do sedimento para exame microscópico A padronização do preparo do sedimento é fundamental para a boa performance do exame microscópico da urina. Assim deve-se padronizar: . Volume de urina centrifugada . Tempo de centrifugação . Velocidade de centrifugação RCF = 1,118 x 10-5 x r x N2 RCF = força centrífuga relativa = 400 r = raio do rotor (em cm) N = rotações por minuto . Fator de concentração do sedimento . Volume do sedimento analisado . Sistema de contagem: Lâminas e lamínulas / Câmaras de Contagem / Sistemas padronizados Exame microscópico A maneira pela qual o exame microscópico é realizado tem que ser consistente, incluindo a observação de no mínimo dez campos em menor e maior aumento (100 e 400x). A observação em menor aumento tem por objetivo avaliar a disposição dos elementos, a composição geral do sedimento e a presença ou não de cilindros. A identificação e contagem de todos os elementos presentes são realizadas em aumento de 400x. Identificar e Relatar Hemácias – aparecem em diversas situações, tais como: lesões no parênquima renal, lesões de trato urinário, alterações hematológicas e outras causas. Leucócitos – aparecem em infeções do trato urinário e em processos inflamatórios Cilindros - formam-se no interior do túbulo contorcido distal e ducto coletor e têm matriz primariamente composta de mucoproteínas de Tamm-Horsfall, sendo sua aparência influenciada pelos elementos presentes no filtrado durante a sua formação. . Cilindros Celulares - hemáticos, leucocitários, epiteliais. . Cilindros Acelulares - hialinos, granulosos, céreos, lipoídico. . Cilindros pigmentares - hemoglobínicos e bilirrubínicos. Cristais - São freqüentemente achados na análise do sedimento urinário, têm ligação direta com tipo de dieta e raramente possuem significado clínico. Eles são formados pela precipitação dos sais da urina submetidos a alterações de pH, temperatura e concentração. * Cristais Não Patológicos . Urina ácida - ácido úrico, oxalato de cálcio, urato amorfo . Urina alcalina – fosfato triplo (fosfato amoníaco-magnesiano), fosfato amorfo, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio * Cristais Patológicos - Leucina, Tirosina, Cistina, Colesterol, Bilirrubina, Hemossiderina Células Epiteliais- Freqüentemente podemos encontrar células epiteliais na urina, já que são partes do revestimento do sistema urogenital. Células pavimentosas- freqüentes tanto em homens quanto em mulheres, provenientes de células da vagina e das porções inferiores da uretra. Células de transição- originárias da bexiga e porção superior da uretra. Células do túbulo renal- sua presença indica lesão tubular. Microrganismos – bactérias, fungos e parasitas. Outros elementos- muco, contaminantes e espematozóides. Estes últimos podem ou não ser relatados na dependência da padronização de cada laboratório ATIVIDADE DE FIXAÇÃO 01 - Urina com proteinúria, sangue, células cilíndricas e sangue com ureia e creatininaalta, albumina baixa, poderiam caracterizar qual (is) patologia(s)? 02 – Mãe deixou a frauda com urina da criança no chão e quando foi pegar estava com formigas. Sugerir o que pode ter acontecido. Curso: FARMÁCIA Disciplina: Bioquímica Metabólica Título da Aula: Perfil hepático AULA 3 Roteiro 1 OBJETIVO: Revisar conceitos sobre função hepática e relacionar com possíveis patologias. Explicar a metodologia cinética (que pode ser gama-glumatil transferase, ALT/TGP (Alanina transaminase), AST/TGO (Asparto transaminase), desidrogenase láctica, ou fosfatase alcalina) e metodologia de ponto final (bilirrubinas). Explicar a necessidade desse ampliar o perfil hepático PROCEDIMENTO: PROCEDIMENTO: O aluno deverá receber a bula de instruções do fabricante do kit de determinação do analito, e com o auxílio do professor, interpretá-la: tanto no procedimento como no resultado, explicando as implicações patológicas do exame. MATERIAIS QUANTIDADE Por grupo Kit (1 das enzimas acima e bilirrubinas) Suficiente para 1 grupo Soro (normal ou patológico) Suficiente para 1 grupo Cubetas 2 unidades Papel absorvente 1 rolo pipetas automáticas e ponteiras 1 pipeta de 20ul ou 100ul, 1 pipeta de 1ml ou 5 ml Tubos de ensaio 4 tubos por grupo Estante 1 por grupo EQUIPAMENTOS QUANTIDADE Espectrofotômetro 1 por bancada Banho maria 1 por bancada Descarte Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança. As soluções presentes nos tubos deverão ser desprezadas na pia, com água corrente. ATIVIDADE DE FIXAÇÃO: 01- Um senhor de 45 anos, comerciante e com história pregressa de alcoolismo crônico, após ser encontrado desmaiado na rua, foi transportado imediatamente para um pronto socorro. No exame físico, foi constatado um estado semi-comatoso, hálito alcoólico, desidratação, debilidade física, edema de membros inferiores e fígado aumentado. Os testes da função hepática apresentaram as seguintes alterações: TGO (transaminase glutâmica oxaloacética) = 100UI/L (normal = 16 a 40,0) TGP (transaminase glutâmica pirúvica) = 370 UI/L (normal = 7,0 a 27,0) BILIRRUBINA total = 6,1 mg/dl (normal= 0,2 a 1,3) Discutir o caso clínico. 02- Homem, ictérico deu entrada no PS com dores abdominais. No lab foi dosado Bilirrubina total (BT) que deu acima do valor de referência, mas BI deu normal e BD elevada. Quais outros exames que completariam o diagnóstico, e qual seria o diagnóstico? Curso: FARMÁCIA Disciplina: Bioquímica Metabólica Título da Aula: Perfil pancreático AULA 3 Roteiro 2 OBJETIVO: Revisar conceitos sobre função pancreática (endócrina e exócrina) e metabolismo glicídico. Cometar a prova de glicemia, TTOG, frutosamina, hemoglobina glicada e relacionar com os vários tipos de diabetes e resistência à insulina. Explicar as relações entre perfil pancreático, renal e hepático PROCEDIMENTO: O aluno deverá receber a bula de instruções do fabricante do kit de determinação do analito, e com o auxílio do professor, interpretá-la: tanto no procedimento como no resultado, explicando as implicações patológicas do exame. MATERIAIS QUANTIDADE Por grupo Kit de glicemia Suficiente para 1 grupo Soro (normal ou patológico) Suficiente para 1 grupo Cubetas 2 unidades Papel absorvente 1 rolo pipetas automáticas e ponteiras 1 pipeta de 20ul ou 100ul, 1 pipeta de 1ml ou 5 ml Tubos de ensaio 4 tubos por grupo Estante 1 por grupo EQUIPAMENTOS QUANTIDADE Espectrofotômetro 1 por bancada Banho maria 1 por bancada Descarte Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança. As soluções presentes nos tubos deverão ser desprezadas na pia, com água corrente. ATIVIDADE DE FIXAÇÃO: 01- Mulher com hálito cetônico foi elevada ao hospital desacordada. Apresentava 469mg/dl de glicemia. Descreva os achados da gasometria. Pode-se encontrar glicose na urina dela? 02- Por que o exame de fezes está relacionado com o pâncreas? Curso: FARMÁCIA Disciplina: Bioquímica Metabólica Título da Aula: Perfil lipídico AULA 4 Roteiro 1 OBJETIVO: Revisar conceitos sobre perfil lipídico (principalmente colesterol total e suas frações, triglicérides, apolipoproteínas e homocisteína total). Proceder a determinação de HDL-col e TG no soro de paciente e relacionar com LDL (explicar a equação de Friedwald e agora Fórmula de Martin. Equação de Friedwald: Colesterol LDL = colesterol total - (colesterol HDL + colesterol VLDL) Colesterol VLDL = triacilglicerol/5 Relacionar com doenças cardio-circulatórias, dando ênfase as dislipidemias e dentre elas a arterosclerose. PROCEDIMENTO: O aluno deverá receber a bula de instruções do fabricante do kit de determinação do analito, e com o auxílio do professor, interpretá-la: tanto no procedimento como no resultado, explicando as implicações patológicas do exame. MATERIAIS QUANTIDADE Por grupo Kit HDL-col e TG Suficiente para 1 grupo Soro (normal ou patológico) Suficiente para 1 grupo Cubetas 2 unidades Papel absorvente 1 rolo pipetas automáticas e ponteiras 1 pipeta de 20ul ou 100ul, 1 pipeta de 1ml ou 5 ml Tubos de ensaio 4 tubos por grupo Estante 1 por grupo EQUIPAMENTOS QUANTIDADE Espectrofotômetro 1 por bancada Banho maria 1 por bancada Descarte Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança. As soluções presentes nos tubos deverão ser desprezadas na pia, com água corrente. ATIVIDADE DE FIXAÇÃO: 01- Homem, 45 anos, fumante, sedentario. Check-up: HDL de 30 mg/dl, TG= 320 mg/dl, razão TG:HDL 3:1, VLDL: 360 mg/dl. Explique como estes resultados podem ser preocupantes e diga pelo menos 2 outros exames que devem ser feitos de grande importância para a vida deste paciente e por quê. 02- Quando é a hora de começar tomar estatinas? Curso: FARMÁCIA Disciplina: Bioquímica Metabólica Título da Aula: Sais minerais AULA 4 Roteiro 2 OBJETIVO: Revisar conceitos sobre a constituição dos ossos, dando ênfase na importância dos sais minerais, principalmente cálcio, fosforo e magnésio Relacionar com enfermidades ósseas e hormônios tireoidianos. PROCEDIMENTO: O aluno deverá receber a bula de instruções do fabricante do kit de determinação do analito, e com o auxílio do professor, interpretá-la: tanto no procedimento como no resultado, explicando as implicações patológicas do exame. MATERIAIS QUANTIDADE Por grupo Kit de cálcio, fosforo ou magnésio Suficiente para 1 grupo Soro (normal ou patológico) Suficiente para 1 grupo Cubetas 2 unidades Papel absorvente 1 rolo pipetas automáticas e ponteiras 1 pipeta de 20ul ou 100ul, 1 pipeta de 1ml ou 5 ml Tubos de ensaio 4 tubos por grupo Estante 1 por grupo EQUIPAMENTOS QUANTIDADE Espectrofotômetro 1 por bancada Banho maria 1 por bancada Descarte Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança. As soluções presentes nos tubos deverão ser desprezadas na pia, com água corrente. ATIVIDADE DE FIXAÇÃO: 01- Relacionar hormônios com osteopenia e osteoporose 02- Relacionar dieta com os suplementos vitamínicos+ sais minerais 1
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