Introdução Espectrofotometria teórica

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Bioquímica II Prática -Introdução teórica (espectrofotometria) 
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ESPECTROFOTOMETRIA 
 
 
Os métodos espectroscópicos baseiam-se na absorção e/ou emissão de radiação 
electromagnética por muitas moléculas, quando os seus electrões se movimentam entre 
níveis energéticos. A espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos 
comprimentos de onda entre o ultravioleta e o infravermelho (Fig. 1). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig..1. Espectro electromagnético. A espectrofotometria utiliza a radiação compreendida entre o ultravioleta 
(ultraviolet) e o infravermelho (infrared). 
 
 
A chamada radiação luminosa corresponde a uma gama de comprimentos de onda 
que vai desde o ultravioleta ao infravermelho no espectro da radiação electromagnética 
(Fig. 2). 
 
 
 
 
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Fig2. Radiação luminosa. 
 
O espectro do visível está contido essencialmente na zona entre 400 e 800 nm (Tabela 1). 
 
 
Tabela 3.1: Comprimentos de onda da luz visível. 
 
Cor Comprimento de onda (nm) 
 violeta 390 - 455 
 azul 455 - 492 
 verde 492 - 577 
 amarelo 577 - 597 
 laranja 597 - 622 
 vermelho 622 - 780 
 
 
Um espectrofotómetro é um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromática 
através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa solução 
(Fig. 3). Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes 
comprimentos de onda (tal como acontece no arco-íris com a separação das cores da luz 
branca). Pode-se assim fazer passar através da amostra um feixe de luz monocromática (de 
um único comprimento de onda, ou quase). O espectrofotómetro permite-nos saber que 
quantidade de luz é absorvida a cada comprimento de onda. 
Ultra 
violeta 
Infra 
vermelho 
400 
nm 
500 
nm 
600 
nm 
700 
nm 
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Fig. 3. Espectrofotómetro. A luz é dividida em feixes de diferentes comprimentos de onda por meio de um 
prisma óptico e passa através da amostra, contida numa cuvette ou célula de espectrofotómetro. 
 
 
1. Espectros de absorção 
 
O conjunto das absorvâncias aos vários comprimentos de onda para um composto chama-
se espectro de absorção e varia de substância para substância. Se uma substância é verde, 
por exemplo, então deixa passar ou reflecte a cor nesse comprimento de onda, absorvendo 
mais a luz na região do vermelho. A seguir podem ver-se espectros de várias substâncias 
diferentes (Fig. 4). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 4. Espectros de absorção de absorção de diferentes substâncias (1: bacterioclorofila; 2: clorofila a; 3: 
clorofila b; 4: ficoeritrobilina; 5: beta-caroteno). A substância 1, por exemplo, absorve pouco na região do 
visível, logo deve ser praticamente incolor para os nossos olhos. 
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Uma vez que diferentes substâncias têm diferentes padrões de absorção, a 
espectrofotometria permite-nos, por exemplo, identificar substâncias com base no seu 
espectro. Permite também quantificá-las, uma vez que a quantidade de luz absorvida está 
relacionada com a concentração da substância, como vamos ver adiante. 
Às vezes uma substância, quando alterada quimicamente, pode passar a apresentar 
um espectro de absorção diferente. Quando isto acontece, temos uma maneira de detectar 
essas mesmas alterações. Por exemplo, o NADH reduzido absorve a 340 nm, enquanto que 
a forma oxidada não tem absorvância significativa a esse comprimento de onda (Fig. 5). 
 
 
Fig. 5. Espectros de absorção do NAD+ e do NADH. 
 
Essas diferenças de espectro podem ser utilizadas laboratorialmente para seguir o percurso 
de reacções que se esteja a estudar, por exemplo, reacções metabólicas que envolvam a 
oxidação do NADH ou a redução do NAD+. 
 
 
3.2. Espectrofotometria e quantificação 
 
3.2.1. Princípios de absorção da luz: 
 
1. A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela 
atravessada: 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig.6. Relação entre a 
concentração de uma 
solução e a luz absorvida. 
A solução 20g/l absorve 
o dobro da solução 
10g/l. 
solução 10 g/l 
Io IT1 
solução 20 g/l 
 
IT2 
 
Io 
feixe de luz de 
intensidade Io 
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2. A absorção da luz é tanto maior quanto maior for a distância percorrida pelo feixe 
luminoso através das amostras: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 7. Relação entre a distância percorrida pelo feixe luminoso e a a luz absorvida por uma solução. A 
solução contida na cuvette com 3 cm absorve 3 vezes mais luz que a contida na cuvette de 1 cm. 
 
Juntando (1) e (2), temos a lei de Beer-Lambert: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 cm 
Io IT1 
Io IT3 
3 cm 
feixe de luz de 
intensidade Io 
 absorvância (l fixo) 
= 
constante 
(para um l fixo) 
Al el.c.l 
concentração 
da solução 
absorvente 
distância percorrida 
pelo feixe luminoso 
através da amostra 
 
Al=log10 
Io 
IT 
Io – luz incidente 
IT – luz transmitida 
el – coeficiente de extinção molar ao comprimento de onda l 
c – concentração da substância (em moles/l) 
l – distância percorrida pela luz através da substância 
 
Nesta equação, 
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Normalmente usam-se cuvettes com 1 cm de comprimento, de modo que a equação fica: 
 
Al= el.c 
 
Ou seja, a absorvância da luz a cada comprimento de onda l é directamente 
proporcional à concentração da solução contida na cuvette. Esta linearidade deixa de 
ocorrer a concentrações muito elevadas da substância, podendo nesses casos diluir 
previamente a amostra a medir. 
 
3.2.2. Métodos colorimétricos 
 
 Com alguma frequência é necessário quantificar substâncias em misturas 
complexas, ou que não absorvem significativamente a luz a nenhum comprimento de onda. 
Nestes casos utilizam-se os chamados métodos colorimétricos - o composto a quantificar é 
posto em contacto com um reagente específico, de modo a desenvolver uma cor cuja 
intensidade é directamente proporcional à concentração da substância na mistura original. 
 Por exemplo, para quantificar proteínas numa solução pura pode medir-se a 
absorvância a 280 nm, sendo esta proporcional à concentração de proteína. Mas se 
quisermos saber a concentração de proteína num extracto impuro, este método já não pode 
ser utilizado, porque outras substâncias, como por exemplo os ácidos nucleicos, também 
absorvem a este comprimento de onda. Neste caso podemos utilizar, por exemplo, o 
reagente de Biureto, que reage de modo quantitativo com as proteínas, originando um 
complexo violeta, que absorve fortemente a radiação a 540 nm. 
Para quantificar espectrofotometricamente uma substância é necessário, 
obviamente, saber o valor de e. Para isso é necessário preparar uma série de soluções do 
composto a quantificar, de concentração conhecida, fazê-las contactar com o reagente e 
medir as absorvâncias aocomprimento de onda adequado (Fig. 8). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 8. Calibração de um método colorimétrico. A absorvância ao comprimento de onda escolhido é 
directamente proporcional à concentração do composto na solução. 
0 0.1M 0.2M 0.3M 0.4M 0.5M 
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No exemplo da Fig. 8, há uma relação linear perfeita entre a concentração da 
substância (expressa em molaridade, M) e a absorvância ao comprimento de onda l de 
medida. Podemos assim obter uma recta do tipo 
 
 Al= el.c (ou Al= el.c + b, caso a recta não passe na origem) 
 
em que Al é a absorvância ao comprimento de onda l de medida, c a concentração em M 
e el a constante de proporcionalidade. Sabendo esta relação, podemos fazer corresponder 
uma absorvância medida,a uma concentração de substância na soluçãoa analisar. 
 Muitas vezes o método só é linear até uma certa concentração da substância. Nesse 
caso, utiliza-se a zona em que a relação é linear, diluindo a solução a medir, sempre que 
necessário, de modo a que a absorvância resultante esteja contida no intervalo da recta de 
calibração. 
 
 
 
 
Bibliografia: 
 
GORDON, D.B. 1995. Spectroscopic Techniques.pp. 324-344 in Principles and 
Techniques in Practical Biochemistry. K. Wilson & J. Walker Eds., Cambridge University 
Press, Cambridge 
 
REED, R., HOLMES, D., WEYERS, J. & JONES,A.J. 1998. Practical Skills in 
Biomolecular Sciences. Ed. Prentice Hall 
 
 
 
Páginas da Internet: 
 
"Photographic Chemistry 2076-302 Laboratory: 5 Spectrophotometry and Beer's 
Law": 
http://www.rit.edu/~bekpph/Chemistry/5_Spectrophotometry.html (teoria e prática da 
espectrofotometria quantitativa) 
 
"Color and Vision": 
 http://www.glenbrook.k12.il.us/gbssci/phys/Class/light/u12l2c.html 
(breve descrição da luz e das suas propriedades, e da sua relação com a visão) 
 
"Spectrophotometry": 
http://fig.cox.miami.edu/~ddiresta/bil256/Lab1.htm 
 (Princípios da espectrofotometria) 
 
"Visible Light Waves": 
http://imagers.gsfc.nasa.gov/ems/visible.html (O espectro da radiação luminosa na região 
do visível)