Apostila Biologia de Micro-organismos PRÁTICA

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Universidade Federal de Minas Gerais 
Instituto de Ciências Biológicas 
Departamento de Microbiologia 
 
 
 
 
Apostila de Aulas Práticas 
Ciências Biológicas 
 
 
 
 
Aluno: _______________________________________________ 
Matricula:_____________________________________________ 
Professor (a):__________________________________________ 
 
VERSÃO 2012 
 
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Sumário 
 
Normas para Trabalhos Práticos em Microbiologia ......................................................... 3 
Técnicas de Semeadura ................................................................................................. 4 
Meios de cultura .............................................................................................................. 6 
PRÁTICA 1: UBIQUIDADE MICROBIANA .......................................................................... 8 
PRÁTICA 2: MORFOLOGIA DE FUNGOS .......................................................................... 12 
PRÁTICA 3: IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS .................................................................... 22 
PRÁTICA 4: MORFOLOGIA BACTERIANA E TÉCNICAS DE ISOLAMENTO ......... 24 
PRÁTICA 5: IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA I .............................................................. 30 
PRÁTICA 6: IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA II ............................................................ 34 
PRÁTICA 7: RESPIRAÇÃO DE MICRORGANISMOS ...................................................... 50 
PRÁTICA 8: CONTROLE DE POPULAÇÕES MICROBIANAS ........................................ 52 
PRÁTICA 9: CRESCIMENTO E TITULAÇÃO DE VÍRUS BACTERIANO EM MEIOS 
LÍQUIDO E SÓLIDO ............................................................................................................... 56 
 
 
 
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Normas para Trabalhos Práticos em Microbiologia 
 
1. Os alunos deverão adquirir e trazer para todas as aulas práticas: 
 Fósforo ou Isqueiro (para uso do bico de Bunsen) 
 Caneta para Retroprojetor (para identificação do material em uso) 
 Guarda-pó/jaleco 
2. O uso do Guarda-pó/jaleco é OBRIGATÓRIO. 
3. Observar RIGOROSAMENTE o horário da aula prática. 
4. Manter sobre a área de trabalho apenas o material estritamente necessário para 
a realização da atividade prática (material supérfluo deve ser depositado nos 
escaninhos ao fundo da sala). 
5. Manter o ambiente de trabalho calmo. Evite deslocamentos desnecessários. 
6. EM CASO DE ACIDENTE COMUNICAR O OCORRIDO IMEDIATAMENTE AO 
PROFESSOR. 
7. O material de trabalho deve ser mantido nos suportes adequados e não 
abandonados sobre a bancada. 
8. Ao acender o bico de gás, aproximar primeiro à chama ao bico, em seguida abrir 
a torneira. Ao fim do procedimento experimental, apagar imediatamente a 
chama. 
9. As alças, agulhas e espátulas metálicas de repicagem devem ser flambadas 
antes e após a sua introdução nos tubos ou placas de cultura. Os tubos deveram 
ter as bocas flambadas após a retirada da rolha e antes de sua recolocação. 
10. LER O ROTEIRO DE AULA PRÁTICA ANTES DE INICIAR O TRABALHO. 
11. Identificar todo o material produzido. 
12. Lavar as mãos antes e após o procedimento experimental. 
13. NUNCA LAVAR MATERIAL CONTAMINADO NAS PIAS DO LABORATÒRIO. 
14. NÂO LEVAR NADA À BOCA NO LABORATÒRIO. É PROIBIDO COMER, 
BEBER, MAQUIAR-SE ETC. 
 
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Técnicas de Semeadura 
 
Nunca esqueça de trabalhar sempre perto da chama: 
 
 
Semeadura em Meios Sólidos: 
 Semeadura em Tubos de Ensaio (em meios inclinados) – Esgotamento de alça: 
 → 
 
 Em picada: 
Em tubo de ensaio com meio inclinado: Em tubo de ensaio com meio não inclinado: 
 
 
 Em placa de Petri (por esgotamento em superfície): 
 
 
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 Por espalhamento: 
 
 
 Em profundidade ou incorporação (técnica de “Pour-Plate”): 
 
 
 
Semeadura em Meios Líquidos: 
 Difusão: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Alça de Drigalski 
 
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Meios de cultura 
 
Para uma melhor compreensão das diversas finalidades e usos dos meios de 
cultura, apresentamos a seguir uma breve classificação dos mesmos: 
 Quanto à composição: 
o Naturais: são aqueles de origem vegetal (um pedaço de batata, pão, frutas) ou 
animal (gema de ovo). 
o Artificiais: são aqueles constituídos de substâncias químicas podendo ser 
definidos ou indefinidos (complexos). 
 Quanto ao estado físico: 
o Líquido: são os caldos, desprovidos de Agar. 
o Semi-sólido: são aqueles que apresentam em sua composição até 1% de Agar. 
o Sólido: são aqueles que apresentam em sua composição 1,5 a 2,5% de ágar. 
 Quanto à finalidade e características: 
o Simples: contém apenas componentes básicos para o crescimento de uma 
bactéria. 
o Enriquecido: meio que tem aumentada a sua capacidade nutricional para a 
bactéria pela adição de substâncias como gema de ovo, sangue, plasma, soro, 
leite. De uso frequente para bactérias de difícil crescimento (fastidiosas). 
o De enriquecimento: meio seletivo que visa inibir o crescimento de bactérias 
acompanhantes e permitir o crescimento da bactéria alvo que pretende-se 
posteriormente isolar aumentando assim a proporção desta em relação às 
demais. 
o Seletivo: contêm substâncias seletivas que inibem o crescimento de certas 
bactérias e permitem o crescimento de outras. São meios sólidos e têm como 
objetivo isolar culturas puras. 
o Indicadores: meios que permitem a diferenciação visual do crescimento 
bacteriano facilitando a sua identificação. Frequentemente, os meios seletivos 
são também indicadores e todos os meios utilizados na confirmação bioquímica 
dos isolamentos são indicadores. A indicação mais freqüente é a alteração de 
cor do meio por mudança no pH do mesmo, podendo ainda ser a produção de 
 
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gás,precipitação de componentes do meio por atividade proteolítica e lipolítica, 
etc. 
o Estoque: são meios normalmente semi-sólidos com a finalidade de preservar 
uma cultura bacteriana pura para posteriores utilizações no laboratório. 
 
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PRÁTICA 1: UBIQUIDADE MICROBIANA 
 
1- ASSUNTO 
Demonstração da ubiquidade dos microrganismos. 
2- INTRODUÇÃO 
 Não há parte da biosfera onde não se encontre microrganismos. Em termos de 
habitat, os microrganismos são encontrados em quase todos os ambientes, tanto na 
superfície, como no mar e subsolo. Desta forma, podemos isolar microrganismos de 
fontes termais, com temperaturas atingindo até 130°C de regiões polares, com 
temperaturas inferiores a -10°C; de ambientes extremamente ácidos (pH=1) ou básicos 
(pH=13). Alguns sobrevivem em ambientes extremamente pobres em nutrientes, 
assemelhando-se à água destilada. Há ainda aqueles encontrados no interior de 
rochas na Antártida. Na grande maioria dos casos, fazem parte do ecossistema, onde 
exercem profunda influência no equilíbrio biológico e, conseqüentemente, na 
preservação da natureza - nestes casos são chamados de autóctones, ou nativos. No 
solo (em qualquer parte do globo terrestre) nas águas, na superfície interna do 
organismo animal (boca, estômago, intestino), na superfície externa de vegetais e 
animais, e, em certos casos no interior de seus tecidos, estão os microrganismos 
presentes, permanentemente ou transitoriamente. 
 São encontrados também, na atmosfera, embora sem qualquer atividade, pois 
para que possam se manter em atividade é necessário que estejam em contato com o 
substrato de onde retiram os nutrientes de que necessitam. No entanto, a 
demonstração de existência de microrganismos na atmosfera é de grande importância 
e de aplicação em diferentes campos de atividades do microbiologista (na medicina, na 
indústria, na agricultura, nas técnicas microbiológicas laboratoriais, etc.) Quanto mais 
movimentado e populoso é o ambiente, mais rico em microrganismos que podem ser 
disseminados pela movimentação do ar e pelas correntes aéreas e também pelas 
populaçõesque circulam por tal ambiente. 
 Onde são encontrados os microrganismos? 
 
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 Quais fatores levam uma maior diversidade de microorganismos em um dado 
ambiente? Cite e explique. 
 Relacione alguns ambientes nos quais é detectada a presença de 
microrganismos. 
 Os microrganismos desempenham importante papel nestes ambientes? 
Explique. 
 Como seria possível demonstrar a existência de microrganismos nestes 
ambientes? Qual a importância desta demonstração? 
 Existe alguma relação entre a natureza e sua população microbiana? 
 
3- MATERIAL 
 Ágar simples em placa, dois por mesa; 
 Ágar Sabouraud em placa, dois por mesa; 
 Terra (em água), três por sala; 
 Água, três por sala; 
 Pipetadores automáticos 100 e 200 μL, quatro por sala; 
 Ponteiras esterilizadas. 
 
4- EXECUÇÃO 
O aluno deverá escolher o ambiente (ar, água ou terra), que irá usar para a 
pesquisa da presença dos microrganismos (fungos e bactérias). Identificar as placas 
em relação à mesa, data e ambiente escolhido (ar, água ou terra). 
 
4.1. PESQUISA DE FUNGOS E BACTÉRIAS DO AR: 
Marcar as placas de ágar simples (AS) e as placas de ágar Sabouraud (SB), que 
deverão ser expostas ao ar durante cinco minutos e 15 minutos. 
4.2. PESQUISA DE FUNGOS E BACTÉRIAS DA TERRA OU ÁGUA: 
 Inocular 0,1mL da suspensão de terra ou de água e nas placas 
correspondentes. 
 
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 Incubar a 37°C as placas de ágar simples e a temperatura ambiente as 
placas de Sabouraud. 
 
5- RESULTADOS E CONCLUSÃO 
Anotar os resultados obtidos na tabela abaixo: 
 NÚMERO DE COLÔNIAS 
PLACAS ASPECTO 
FILAMENTOSO 
ASPECTO 
CREMOSO 
TOTAL 
1- Ágar Simples 
2- Ágar Simples 
3-Ágar Sabouraud 
4- Ágar Sabouraud 
 
 Que grupos de microrganismos formam colônias de aspecto filamentoso? E 
cremoso? 
 O que ficou demonstrado através de exposição dos meios de cultura ao ar, 
água e terra? 
 Existe alguma relação entre tempo de exposição e a quantidade de material 
inoculado com os resultados observados? 
 Qual a importância destes resultados? 
 O que se pode concluir em relação às condições de cultivo usadas e a 
população microbiana em cada uma? Discuta, considerando a composição química dos 
meios de cultura utilizados. 
 Essa técnica permite a demonstração de todos os microrganismos presentes 
nos ambientes estudados? Explique. 
 Qual a sua conclusão sobre a prática? 
 
 
 
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6- FÓRMULAS 
ÁGAR SIMPLES ÁGAR SABOURAUD 
Peptona: 1,0 g Peptona: 1,0 g 
NaCl: 0,5 g Extrato de Levedura: 0,5 g 
Extrato de Carne: 0,3 g Glicose: 2,0 g 
Ágar: 1,5 g Ágar: 1,5 g 
Água destilada: 100mL Água destilada: 100mL 
pH: 7.2 - 7.4 pH: 6.5 
_____________________ _____________________ 
 
 
AGAR SIMPLES (AS) SABOURAUD (SB) 
pH  7.0 (neutro) pH  5.5 (ácido) 
Temp = 37o C Temp = ambiente 
____________________ ____________________ 
 
 
Favorece o crescimento Favorece o crescimento 
de BACTÉRIAS. de FUNGOS. 
colônias cremosas e  colônias cremosas  Leveduras 
pequenas.  colônias filamentosas  Fungos filamentosos. 
 
 
 
 
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PRÁTICA 2: MORFOLOGIA DE FUNGOS 
 
1- ASSUNTO 
Observação de aspectos macroscópicos e microscópicos dos fungos. 
2- INTRODUÇÃO 
Os fungos constituem um grupo de microrganismos que têm grande interesse 
prático e científico para os microbiologistas. De um modo geral, os fungos incluem os 
bolores e as leveduras. O talo de um fungo filamentoso é tipicamente composto por 
filamentos tubulares microscópicos chamados hifas. O conjunto de hifas recebe a 
denominação de micélio. Os fungos filamentosos reproduzem-se basicamente através 
da formação de esporos sexuados ou assexuados. Os esporos assexuados são mais 
numerosos e sua produção é mais frequente que dos esporos sexuados. 
As leveduras são, usual e predominantemente, fungos unicelulares. Sua reprodução 
vegetativa se faz, geralmente, por brotamento. Como células simples, seu crescimento 
é mais rápido do que dos fungos filamentosos. Alguns grupos de leveduras 
(Basidiomicetos e Ascomicetos) produzem esporos do tipo sexuado. 
Uma vez que a identificação dos fungos depende, em grande parte, de suas 
características morfológicas, tais como o tipo de arranjo de esporos, deve-se tomar 
muito cuidado na manipulação das preparações destinadas ao exame microscópico. 
Os exames microscópicos podem ser feitos removendo-se um fragmento do 
crescimento miceliano, com uma alça de platina, e colocando-o em uma lâmina com 
uma gota de lactofenol (o material é recoberto por uma lamínula). 
 Um outro método amplamente utilizado para a observação das estruturas 
fúngicas, como as hifas e as estruturas de reprodução, é o de cultura em lâmina, ou 
microcultivo (TÉCNICA DE RIDELL) (Figura 1). Esta técnica possibilita a preparação e a 
observação sem perturbar o crescimento do organismo, mantendo intactas as 
estruturas e a disposição das partes componentes do fungo. 
 
 
 
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Figura 1- Montagem do microcultivo (TÉCNICA DE RIDELL) 
 
3- MATERIAIS 
 Culturas de Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Curvularia. 
 Placas de Petri estéreis, montadas com suporte de vidro, lâmina, lamínula 
e algodão hidrófilo. 
 Alças de platina em gancho. 
 Tubos com água estéril. 
 Placas com ágar Sabouraud dividido em cubos. 
 Pinças. 
 
4- EXECUÇÃO 
 4.1 - MICROCULTIVO EM LÂMINA (TÉCNICA DE RIDELL) 
 Colocar sobre a lâmina um pequeno cubo de meio de cultura (Sabouraud), 
assepticamente com o auxílio de pinça. 
 Cada aluno semeará a amostra de fungo filamentoso nos quatro cantos do 
meio de cultura que está sobre a lâmina. 
 
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 Cobrir a preparação com lamínula e comprimir suavemente a mesma sobre 
a preparação, utilizando uma pinça. 
 Umedecer o algodão contido na placa, com água destilada esterilizada, 
criando assim uma câmara úmida, dessa forma o ambiente está preparado 
para o crescimento do microrganismo. 
 Identificar as placas de Petri na tampa com: mesa, lugar e data. 
 Incubar à temperatura ambiente por 5 dias. 
 
4.2 - EXAME MICROSCÓPICO 
Para o exame microscópico das culturas de Rhizopus, Aspergillus, Penicillium 
e Curvularia, proceder para cada fungo da seguinte maneira: Colocar sobre a lâmina 2 
gotas de lactofenol (contendo azul de metileno). Retirar com alça de platina (em 
gancho) um pequeno fragmento da colônia e colocar sobre a lâmina contendo 
lactofenol. Abrir as estruturas com auxílio do estilete. Cobrir com lamínula. Examinar 
com objetiva de 10 e 40X. 
 
 
 
 
 
 
Rhizopus Aspergillus Penicillium Curvularia 
 
 
 
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 4.3- ZIMOGRAMA: PROVA DE FERMENTAÇÃO DE CARBOIDRATOS 
4.3.1 - MATERIAIS 
 Culturas de Candida spp. 
 Série bioquímica: glicose, lactose, sacarose e maltose. 
 Alças de platina em anel. 
 
4.3.2 - EXECUÇÃO 
2.1 Descreva as colônias de Candida em relação ao aspecto e pigmentação 
(superfície e verso); 
2.2 Observar e anotar o aspecto e coloração dos meios de antes do inoculo; 
2.3 Identificar a série bioquímica: nome dos açúcares, mesa, lugar e data; 
2.4 Com a alça de platina em anel, tocar levemente na colônia de levedura. 
Semear a amostra separadamente nos quatro tubos contendo os açúcares, tomando-
se o cuidado de sempre flambar a alça quando mudar de açúcar; 
2.5 Incubar a 37C por 24 – 48 horas; 
2.6 A Leitura será feita na aula seguinte. 
 
4.3.3 - LEITURA E INTERPRETAÇÃO 
 - Compare os aspectos dos meios de cultura antes e após inoculação e 
incubação e, com base na composição química desses meios, tente explicar a reação 
observada. 
- Observar a presença de gás no interior do tubo de Duhran e explicar este 
fenômeno. 
 Qual serão sua finalidade e importância? 
 
4.4 - MORFOLOGIA E REPRODUÇÃO DOS FUNGOS 
4.4.1 – ASSUNTO 
 
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 Estudo da morfologia e reprodução de fungos 
 
 
4.4.2 - INTRODUÇÃO 
 
Macroscopicamenteos fungos se dividem em dois grandes grupos: bolores que 
apresentam colônias filamentosas, e leveduras, que apresentam colônias de aspecto 
cremoso. Na avaliação macroscópica é muito importante avaliar o tipo de colônia no 
verso e reverso da cultura, sua velocidade de crescimento e a formação de pigmentos. 
Microscopicamente é necessário que se faça uma avaliação das estruturas de 
sustentação e assimilação, as hifas, e as estruturas de frutificação que visam a 
reprodução do fungo (conídios, macro e microconídios, tipos de esporos e etc). 
Os fungos filamentos podem apresentar três tipos morfológicos de hifas: hifas 
asseptadas, hifas septadas mononucleadas e hifas septadas multinucleadas. 
A estrutura que produz os esporos é chamada se esporóforo e quando sua porção 
terminal forma um saco chamado esporângio, passa a ser designado como 
esporangióforo. Os esporos produzidos dentro do esporângio são conhecidos como 
esporangiósporos, que são postos em liberdade pela ruptura do esporângio. Quando 
os esporos emergem livres, o esporóforo é chamado de conidióforo e os esporos são 
chamados de conidiósporos ou conídios. (ver cartazes). 
 
4.4.3 - MATERIAIS 
 Lâminas e lamínulas: Lâminas preparadas com macroconídios, microconídios, 
gêmulas, artrósporos, esporangiósporos. Um por mesa; 
 Lactofenol; 
 Cartazes. 
 
 4.4.4 - EXECUÇÃO E LEITURA 
 
 Observar ao microscópio com pequeno (10X) e médio (40X) aumentos 
(lâminas já preparadas) as estruturas de reprodução de fungos. 
 
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Esquematize o observado. Dica: quão mais detalhada a descrição mais fiel 
fica a sua descrição e mais fácil a diferenciação de um grupo para outro. 
 Preparar uma lâmina da cultura do fungo filamentoso, da maneira descrita 
na prática anterior. Observar ao M.O. Anotar e desenhar. 
 
 
 Macroconídios e microconídios 
 
 
 
 
 Gêmulas Artrósporos 
 
 
 
 
 Esporangiósporos 
 
 
 
 
 
 
 
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5- CONCLUSÕES 
 
 Qual a finalidade e o significado prático do exame direto da cultura fúngica? 
Quais são as suas limitações considerando-se fungos filamentosos e leveduriformes? 
 Qual o objetivo da utilização do lactofenol? Discuta a função de seus 
constituintes. 
 Em relação ao Zimograma: compare aspectos dos meios de cultura antes e após 
o inoculo e a incubação. Com base na composição química dos meios tente explicar a 
reação observada. 
 Qual será sua finalidade e importância? 
 Tendo em vista que cada microrganismo tem suas características fisiológicas, 
explique porque uns crescem em determinados tipos de substrato e outros não. E se 
existe algum que cresça em todos, você o considera melhor adaptado evolutivamente? 
 Quais são as variações morfológicas observadas em relação aos esporos de 
reprodução assexuada? Discuta sua importância prática. 
 
6- FÓRMULAS 
 
LACTOFENOL 
 Fenol: 20,0 g 
 Ácido Lático: 20,0 g 
 Glicerina: 40,0 g 
 Azul de metileno (ou azul de algodão): 0,05 g 
 Água destilada: 20,0 mL 
 
 
 
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 ZIMOGRAMA 
 Peptona: 1,0 g 
 Indicador de Andrade: 0,5mL 
 Água destilada: 100 mL 
 Ph: 7,0 
 
Distribuir 3,6 mL por tubo, esterilizar a 120°C por 20 minutos e adicionar 
separadamente 4,0 mL das soluções de açúcares a 20%. 
Açúcares: glicose, lactose, maltose, sacarose. Os açúcares devem ser 
esterilizados por filtração. 
 
 
INDICADOR DE ANDRADE 
 Fucsina ácida: 0,5 g 
 NaCH 1 N: 16,0 mL 
 Água destilada: 100mL 
 
O indicador de Andrade é um indicador de pH que sofre uma viragem nítida para 
o vermelho em pH abaixo de 7.0, sendo assim um bom indicador de que houve 
atividade metabólica do microorganismo no meio. 
 
 
Leveduras produtoras de micocinas extracelulares (toxinas Killers) 
 
 
1 – Introdução 
 A produção de micocinas (toxinas “killer”) por leveduras é um fenômeno de 
antagonismo entre linhagens na competição pelos recursos disponíveis. Durante os processos 
 
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fermentativos, a contaminação com leveduras produtoras pode levar a interrupção da 
fermentação pela eliminação das linhagens sensíveis. As micocinas são proteínas ou 
glicoproteínas codificadas por determinantes genéticos, tais como RNA de fita dupla (dsRNA) 
viral, plasmídeos lineares de DNA, ou genes cromossômicos em algumas leveduras. As 
leveduras apresentam três fenótipos: “killer” para as linhagens produtoras, sensíveis (S) e 
neutras (N) para as linhagens que não nem produtoras nem sensíveis. Nos últimos anos, a 
utilização comercial de linhagens produtoras de micocinas para eliminar leveduras indesejáveis 
em fermentações industriais tem sido utilizada bom bastante êxito. 
 
2 – Material 
. Culturas de Candida glabrata Y-55 e Saccharomyces cerevisiae NCYC 1006 (linhagens 
sensíveis) crescidas em agar Sabouraud. 
. Culturas de linhagens de leveduras produtoras e não produtoras de micocinas 
(linhagens testes). 
. Placas com meio de cultura agar extrato de malte-extrato de levedura (YM) com azul de 
metileno: 
Extrato de leveduras 0.3% 
Extrato de Malte 0.3% 
Peptona 0.5% 
Glicose 1% 
Azul de metileno 0.003% 
Agar 2% 
pH 4.2 
 
. Swabs estéreis. 
. Água destilada estéril. 
 
3 Execução 
 
3.1 Fazer um suspensão de cada uma das duas linhagens sensíveis (C. glabrata e S. 
cerevisiae), em água destilada esterilizada. 
3.2 Com o auxilio do “swab”, inocular por espalhamento as linhagens sensíveis no meio de 
cultura, uma linhagem em cada placa. 
 
21 
 
3.3 Esperar cinco minutos 
3.4 Marcar, com caneta de retroprojetor, no fundo de cada placa, o local a ser inoculado com 
as linhagens a serem testadas quanto a produção de micocinas. 
3.5 Com o auxilio de uma alça de platina, fazer um inoculo pesado das linhagens a serem 
testadas, nos pontos previamente marcados. 
3.6 Incubar as placas a temperatura ambiente por 2 dias 
3.7 Observar a produção de halos de inibição ao redor da colônia da levedura teste. Caso seja 
obervado o halo, a levedura será considerada produtora de micocina (toxina killer). 
 
4 Leitura e Interpretação 
 
 Observar a formação de um halo de inibição ao redor das colônias produtoras de 
micocinas. São consideradas produtoras de toxinas killer as colônias que após 2 dias de 
incubação produzirem em torno de si um halo de inibição circundado por células azuis (após a 
morte, as células sensíveis ficam coradas de azul pelo azul de metileno presente no meio de 
cultura). 
 
 
 
 
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PRÁTICA 3: IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS 
 
1- ASSUNTO 
 Montagem e exame das culturas do microcultivo. 
 Identificação dos fungos estudados. 
 
2- INTRODUÇÃO 
 
Taxonomicamente os fungos são identificados em grande parte pela sua 
morfologia, dado que tal grupo de microrganismos apresenta uma enorme variação de 
formas tanto macroscópicas quanto microscópicas. 
3- MATERIAIS 
 Material do cultivo em lâmina; 
 Lâminas e lamínulas; 
 Cartazes; 
 Lactofenol; 
 Lâminas preparadas. 
 
4- EXECUÇÃO E RESULTADOS 
 Retirar a lamínula e colocá-la sobre a lâmina contendo uma gota de lactofenol. A 
lâmina está pronta para ser examinada ao microscópio. 
 Com o auxílio da alça de platina, retirar o cubo contendo o meio de cultura que 
está sobre a lâmina. 
 No centro da lâmina, colocar uma gota de lactofenol e cobrir com lamínula. 
 Examinar com objetivas de pequeno (10X) e médio (40X) aumento. Desenhar. 
 Com os dados obtidos durante as aulas e com o auxílio de manuais de 
identificação de fungos, identificar os fungos estudados. 
 
 
 
23 
 
 
 
 
 
 
 
 
Desenho das estruturas observadas 
 
5- CONCLUSÕES 
 Qual a finalidade e o significado prático do cultivo em lâmina? Discuta 
comparando os resultados obtidos quanto ao exame direto da cultura. 
 O habitat poderia exercer influência na morfologia dos fungos? E o meio de 
cultura? Qual é a relevância e as limitações do estudo da morfologia na caracterização e 
identificação dos fungos? Discuta, considerando os fungos filamentosos e 
leveduriformes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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PRÁTICA 4: MORFOLOGIA BACTERIANA E TÉCNICAS DE 
ISOLAMENTO 
 
1- ASSUNTO 
 
 Estudo da morfologia bacteriana com emprego da microscopia de campo claro 
– exame a fresco; 
 Coloração de Gram; 
 Técnicas de isolamento – obtenção de colônias isoladas. 
 
2- INTRODUÇÃO 
 
Bactérias são organismos unicelulares, procariotos e heterotróficos que tem uma 
gama de formas e tamanhos muito grande. Para se ter uma idéia, há bactérias 
denominadas nanobactérias ou ultramicrobactérias que possuem 0,2 a 0,05 
micrometros de diâmetro e há também bactérias como Epulopsisium que possui de 500 
a 800 micrometros de comprimento por 2 a 6 micrometros de diâmetro. 
Dado que bactérias são de uma variedade morfológica muito rica, a análise da 
morfologia bacteriana é uma das principais formas de se identificar e classificar 
taxonomicamente estes seres vivos que diferem bastante quanto ao tamanho, 
estruturas reprodutoras e formas, sendo assim a análise morfológica é uma excelente 
forma de analise de baterias de forma rápida e relativamente simples. 
As bactérias, além de uma variedade morfológica muito grande possuem uma 
enorme gama de adaptações fisiológicas, o que possibilita a identificação de 
determinados grupos por suas especificidades fisiológicas, uma série de provas 
bioquímicas podem ser realizadas para a verificação de características que muitas 
vezes são marcantes em determinados grupos bacterianos. Muitas características 
podem ser testadas quanto ao seu potencial patogênico e outras características quanto 
a utilidade para o homem, como por exemplo, potenciais fermentadores. 
 
 Qual é o tamanho das células bacterianas? 
 
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 Como é possível a visualização destas células? 
 Como se prepara o material para observação? 
 Porque um corante se fixa em um grupo de bactérias e em outro não? Onde 
este corante se fixa? E por quê? 
 Qual a importância da visualização dos microrganismos e de detalhes de sua 
estrutura no estudo dos mesmos? 
 Alem do estudo da morfologia de um determinado microrganismo, para 
aprofundar no conhecimento dos mesmos, é importante que se possa: 
 Cultivá-los em laboratório; 
 Separá-los de outros (isolamento); 
 Identificá-los. 
 Quais as condições essenciais para o cultivo da um microrganismo em 
laboratório? Como obter essas condições? 
 Qual a importância de se obter um determinado microrganismo em cultura 
pura? 
 O que é cultura pura? Quais os recursos utilizados para sua obtenção? 
 
3- MATERIAL 
 
 Meio de cultura inoculado com fezes de animal; lâminas e lamínulas; 
 Bateria de corantes para coloração de Gram; 
 Placa de Petri com ágar sangue, uma por mesa; 
 Placa com ágar hipertônico manita, uma por mesa; 
 Placa com meio de Teague, uma por mesa; 
 Pipetador automático de 100μL, um por mesa; 
 Ponteiras esterilizadas. 
 
4- EXECUÇÃO 
 
4.1 – EXAME A FRESCO: 
Retirar, com auxílio do pipetador automático, 0,1mL da cultura bacteriana. Colocá-
la sobre a lâmina e cobri-la com lamínula sem deixar formar bolhas de ar. Observar ao 
 
26 
 
M.O.(microscópio óptico) com pequeno e médio aumentos. Anotar e esquematizar o 
observado. Quanto mais detalhado o esquema e a descrição do observado, mais 
fácil à identificação e a elaboração de um relatório. 
 
4.2 – MÉTODOS DE COLORAÇÃO DE GRAM (com modificações de BURKE & KOPELOFF-
BEERMAN) 
A. Fazer o esfregaço e deixá-lo secar ao ar. 
B. Fixar o esfregaço passando a lâmina sobre a chama (3 vezes). 
C. Cobrir o esfregaço com solução de cristal violeta, acrescentar 3 gotas de 
solução de bicarbonato de sódio e deixar atuar por 2 e 3 minutos. 
D. Lavar o esfregaço com água cobrí-lo com lugol e deixar atuar por 2 
minutos. 
E. Lavar novamente e descorar com acetona-éter (tempo delicado). 
F. Lavar o esfregaço com água e cobrí-lo com solução de safranina por 30”. 
G. Lavar, secar ao ar e examinar com imersão. 
Desenhe as formas bacterianas observadas no esfregaço, os tipos de 
agrupamentos presentes e a cor que tomaram após a coloração. 
 
4.3 – TÉCNICAS DE ISOLAMENTO 
 
Anote o aspecto e características dos meios de cultura. Com alça de platina, 
semear a cultura de fezes, por esgotamento, nos meios de cultura: teague e meio de 
ágar sangue. Identificar as placas e incubar a 37ºC. 
 
4.3.1 – Isolamento de Staphylococcus spp. da narina 
 Com o auxilio de um “swab” estéril, passe a ponta com o algodão na porção 
distal da narina (primeiro terço), e depois inocule, por esgotamento placa contendo o 
ágar hipertônico manita. Incube a placa a 37ºC por 48 hs. Depois da incubação, as 
colônias que mudarem a cor do meio de cultura para amarelo, serão inoculadas em 
soro de coelho e em placas contendo agar DNAse. Culturas de Staphylococcus aureus 
são positivas para estes dois testes. 
 
 
 
27 
 
5. RESULTADOS E CONCLUSÃO 
 5.1 – MORFOLOGIA BACTERIANA 
 
Tente calcular a dimensão de uma bactéria usando para o cálculo o aumento útil 
do microscópio. 
 Quais foram as formas e os tipos de agrupamentos observados? 
 O que é um exame a fresco? O que ele nos permite observar e qual a sua 
importância? 
 O que é um esfregaço? Como é feito? 
 O que é fixação de um esfregaço e qual sua importância? 
 O que é coloração diferencial? Qual o princípio desse diferencial? 
 Qual é a importância da coloração Gram na prática bacteriológica? 
 
Com base nesses dados tente concluir: 
 Qual a estrutura celular corada? 
 Qual o papel da parece celular no processo de coloração? 
 Quais as diferenças de composição química da parede celular de bactérias 
Gram positivas e Gram negativas? 
 Além destas diferenças as bactérias Gram positivas diferem das Gram 
negativas em algum outro aspecto? Qual ou quais? 
 Ao corar um esfregaço pelo método de Gram, quais seriam os cuidados 
necessários para se evitar resultados falsos ou de difícil interpretação? 
 O que é Gram-labilidade? 
 Quais as funções de cada corante ou reagente usado na coloração de Gram? 
 Quais são as vantagens e desvantagens da coloração de Gram em relação ao 
exame a fresco? 
 
 5.2 – TÉCNICAS DE ISOLAMENTO 
 
 Observe separadamente cada um dos meios de cultura utilizados e considere: 
 Houve crescimento de colônias isoladas? 
 Todas as colônias têm o mesmo aspecto? 
 
28 
 
 Seriam colônias formadas por microrganismos diferentes? 
 Faça um esfregaço das colônias de diferentes aspectos e core pelo método de 
Gram. 
 Houve alguma modificação no aspecto do meio de cultura após o crescimento 
bacteriano? 
 Com base na composição química de cada um dos meios de cultura, tente 
explicar os resultados observados. 
 
6- FÓRMULAS DOS MEIOS DE CULTURA 
MEIO DE TEAGUE 
 
 Peptona: 10g 
 Lactose: 5g 
 Fosfato dipotássico: 2g 
 Ágar: 13,5g 
 Eosina: 0,4g 
 Azul de metileno: 0,065g 
 H2O destilada q. s. p.: 1L 
 pH final: 7,2 
 
 
Fundir o ágar, juntar os reagentes na ordem indicada. Ferver em banho Maria 
durante dez minutos. Distribuir em placas esterilizadas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
29 
 
 
 
 
 
 
MEIO DE ÁGAR SANGUE 
A 100mL de ágar simples, fundido e 
resfriado a 45ºC, adicionar 5mL de sangue 
desfribinado de cavalo, carneiro ou coelho. 
Misturar bem e distribuir assepticamente 
em placas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 MEIO HIPERTÔNICO MANITA 
 Extrato de carne: 1,0 g 
 Peptona: 10,0 g 
 Nacl: 75,0 g 
 Manitol: 10,0 g 
 Ágar: 15,0 g 
 Água destilada: 1.000mL 
 
Misturar os reagentes e aquecer até 
completa dissolução. Acertar o pH para 
7,4. Distribuir e esterilizar a 120ºC por 15 
minutos. Vermelho de fenol é um indicador 
de pH que em meio alcalino (pH 8,4) 
apresenta coloração vermelha e em meio 
ácido, amarela (pH 6,8).30 
 
PRÁTICA 5: IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA I 
 
1- ASSUNTO 
 
 Técnicas de isolamento – Leitura. 
 Técnicas de identificação – Meios de triagem e coagulação do plasma (prova 
de coagulase). 
 
2- INTRODUÇÃO 
 
 A partir da obtenção de um microrganismo, quais são as etapas e recursos 
técnicos utilizáveis para a sua identificação? 
 O que são meios de tiragem? Para que são utilizados? 
 
3- MATERIAL 
 
 Lâminas; 
 Bateria para coloração de Gram; 
 Meio de TSI, um por mesa; 
 Plasma de coelho 1:10, um por mesa. 
 Placa com agar DNAse 
 
4- EXECUÇÃO 
 
A partir do tubo de Agar hipertônico manita em que se verificou crescimento e 
fermentação do manitol, semear duas a três colônias para o tubo contendo plasma de 
coelho diluído a 1:10. Identificar o tubo. Incubar a 37ºC por duas a três horas. Fazer um 
Gram das colônias. Anotar aspecto do plasma antes do inóculo. 
A partir do meio de Teague, selecionar uma colônia isolada e semeá-la no meio 
TSI. Fazer também um Gram da colônia. Identificar o material. Incubá-lo a 37ºC. Anotar 
as características da colônia escolhida e do meio de cultura antes do inóculo. 
 
31 
 
5- RESULTADOS E CONCLUSÃO 
 
5.1- PROVA DE COAGULASE 
 
 O que ocorreu no tubo contendo plasma após inoculação da colônia e in 
incubação? Qual o objetivo da realização desta prova e em que princípio se baseia? 
 Por que o teste deve ser lido após o intervalo de duas a três horas de 
incubação? 
 Os procedimentos executados até agora com a amostra bacteriana em 
estudos são suficientes para permitir sua identificação? Justifique. 
 
5.2 - MEIO DE TRIAGEM – TSI 
 
Observe o aspecto do meio de cultura após o crescimento bacteriano e interprete 
o comportamento da bactéria, considerando a composição química do meio e a tabela 
que se segue: 
 
32 
 
ASPECTOS DO CRESCIMENTO BACTERIANO NO MEIO TSI 
LEITURA INTERPRETAÇÃO 
DIAGNÓSTICO 
PRESUNTIVO 
Reação ácida (amarelo) e gás 
na profundidade. Reação ácida 
na superfície (amarelo). 
 
Fermentação da glicose 
Fermentação da lactose ou 
sacarose ou ambas, com 
produção de gás. 
Escherichia 
Klebsiella 
Enterobacter 
Providencia 
Reação ácida e gás na 
profundidade (amarelo) 
Superfície alcalina (vermelha). 
Presença de H2S (negro). 
Fermentação da glicose sem 
ataque à lactose ou sacarose. 
Salmonella 
Arizona 
Citrobacter 
Edwardsiella 
Proteus 
Reação ácida sem gás na 
profundidade. Superfície 
alcalina. Ausência de H2S. 
 
Glicose fermentada apenas 
formando ácido. Nenhuma 
ação sobre a lactose ou 
sacarose. 
 
Shigella 
Providência 
Escherichia 
Salmonella typhi 
Proteus 
Serratia 
Meio inteiramente ácido 
(amarelo) com gás na 
profundidade. Presença de 
H2S. 
Fermentação da glicose com 
gás. Fermentação da lactose 
ou sacarose ou ambas, com 
gás. 
Arizona 
Citrobacter 
Proteusvulgaris 
Meio inteiramente ácido. Sem 
gás. Ausência de H2S. 
 
Fermentação da glicose 
apenas com formação de 
ácido. Fermentação da 
sacarose ou lactose, ou 
ambas. 
Serratia 
Yersinia 
 
33 
 
Superfície sem alteração ou 
alcalina. Ausência de H2S. 
 
Açúcares inalterados 
Pseudomonas 
Herella 
Hima 
Alcaligenes 
(atualmente no gênero 
Pseudomonas) 
* Não pertencem a família Enterobacteriaceae. 
 
MEIO TSI (TRIPLICE AÇÚCAR COM FERRO) 
 Extrato de carne: 3,0 g 
 Peptona: 5,0 g 
 NaCl: 5,0 g 
 Sacarose: 10,0 g 
 Lactose: 10,0 g 
 Glicose: 0,7 g. 
 Sulfato Ferroso: 0,2 g 
 Cistina: 0,15 g 
 Agar: 14,0 g 
 Vermelho de Fenol: 0,025 g 
 Água destilada q.s.p.: 1000 mL 
 pH: 7,4 
 
 
 A que resultado você pode chegar em relação a amostra estudada? Você 
considera que este resultado permite a identificação da amostra? Por quê? 
 Qual a importância deste teste? E suas limitações? 
 Que procedimentos e recursos técnicos podem ser utilizados na continuidade 
do trabalho, com base nos seus resultados? 
 
 
34 
 
PRÁTICA 6: IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA II 
 
1- ASSUNTO 
 
1. Técnicas de identificação: leitura do TSI e prova da coagulase. 
2. Provas bioquímicas. 
 
2- INTRODUÇÃO 
 
Os microrganismos em suas interações com o meio ambiente podem utilizar 
diversos substratos. Como é possível evidenciar a utilização destes substratos pelos 
microrganismos? Qual é a importância e aplicação desse conhecimento? 
 
3- MATERIAL 
 
Série bioquímica, uma por mesa – nitrito, fenilalanina, uréia, lactose, glicose, 
manitol, lisina, malonato, indol, H2S, mobilidade (meio SIM), citrato. 
 
4- EXECUÇÃO 
 
Anotar a coloração e o aspecto dos meios de cultura antes do inóculo e anotar na 
tabela de resultados. Repicar o microrganismo a partir do meio TSI, para os tubos da 
série bioquímica, tomando cuidado de flambar a alça de platina entre um tubo e outro. 
Identificar o material e incubar a 37ºC. 
 
5- RESULTADOS E CONCLUSÃO 
 
Observe a coloração e o aspecto dos meios de cultura após o inóculo e 
incubação. Anote na tabela abaixo. 
 
 
 
35 
 
TESTES ANTES DO INÓCULO E 
INCUBAÇÃO 
APÓS INÓCULO E 
INCUBAÇÃO 
NITRITO 
FENILALANINA 
URÉIA 
LACTOSE 
GLICOSE 
MANITOL 
LISINA TESTE 
LISINA CONTR. 
MALONATO 
INDOL 
H2S 
MOBILIDADE 
CITRATO 
 
Quando se deseja verificar a ação de microrganismos sobre um determinado tipo 
de substrato é importante observar os seguintes itens: 
 Qual a natureza química do substrato; 
 Como ele é assimilado; 
 Que tipo de nutriente ele pode fornecer às células; 
 Que via metabólica estaria envolvida em sua utilização; 
 Como se pode evidenciar a utilização desse substrato pelo microrganismo. 
 
36 
 
 Com auxílio das fórmulas dos meios de cultura reativos, tente responder os 
itens anteriores para cada um dos substratos testados. 
 
6- FÓRMULAS 
 
NITRITO 
 Caldo simples: 100 mL 
 Nitrato de Potássio: 0,1 g 
 pH: 7,6 
 
 
REATIVO DE GRIESS-ILOSVA 
1. Ácido Sulfanílico: 5 g 
Ácido acético 5N: 1000 mL 
2. Naftilamina: 5 g 
Ácido acético 5N: 1000 mL 
 Colocar algumas gotas de cada uma das soluções (1) e (2) no tubo contendo 
meio líquido. O aparecimento de uma coloração róseo-avermelhada indica reação 
positiva. 
 
FENILALANINA 
 Extrato de levedura: 3,0 g 
 DL-fenilalanina: 2,0 g 
 Na2HPO4: 1,0 g 
 NaCl: 5,0 g 
 Ágar: 12,0 g 
H2O destilada: 1000 mL 
 
37 
 
Após incubação, gotejar 4 a 5 gotas de uma solução a 10% (p/v) de CLORETO 
FÉRRICO sobre o crescimento. Se houver aparecimento de cor verde, a reação é 
positiva. 
 
URÉIA 
 Peptona: 1,0g 
 Cloreto de sódio: 5.0 g 
 Fosfato monopotássio (KH2PO4): 2g 
 Glicose: 1.0 g 
 Sol. vermelho de fenol 0,2%: 6mL 
 Uréia: 10,0 g 
 Água destilada: 1000mL 
 pH: 6,9 
Após incubação e crescimento, o aparecimento de coloração róseo-avermelhada 
,significa reação positiva 
 
LACTOSE, GLICOSE, MANITOL 
 Água peptonada: 100 mL 
 Indicador de Andrade: 1 mL 
 Açúcar (lactose ou glicose ou manitol): 1 g 
Após incubação o aparecimento de coloração rósea indica reação positiva. No tubo 
teste para glicose observar a formação de gás no tubo de Durhan. 
 
LISINA DESCARBOXILASE 
 Meio Básico: 
 Peptona: 5g 
 Extrato de levedura: 3 g 
 Glicose: 1 g 
 Vermelho de bromocresol: (1,6% em H2S): 1 ml 
 
38 
 
 Água destilada: 1000 ml 
 pH: 6,7 - 6,8 
Lisina controle: meio básico sem adição de lisina. 
Lisina tubo de reação: meio básico + 0,5% de lisina 
 
MALONATO 
 Extrato de levedura: 1g 
 Sulfato de amônio: 2g 
 K2HPO4: 0,6 g 
 KH2PO4: 0,4 g 
 NaCl: 2 g 
 Malonato de sódio: 3 g 
 Glicose: 0,25 g. 
 Azul de bromotimol: 0,025g 
 Água destilada: 1000 mL 
Resultados positivos são indicados pela mudança de cor do indicador de verde para 
azul (pH 7.6). 
 
MEIO SIM 
 Peptonada de caseína: 20 g 
 Peptona de carne: 6,1 g 
 Sulfato de ferro e amônia: 0,2 g 
 Tiossulfato de sódio: 0,2 g 
 Ágar: 3,5 
 Água destilada: 100 ml 
 pH: 7.3 
 
INDOL: Pesquisa de indol utilizando oreativo de Ehrlich-Bohme. 
 
39 
 
Sol. 1: p-dimetilaminobenzaldeido: 1 g 
 Álcool etílico (95%): 95 ml 
 HCI concentrado: 20 ml 
Sol. 2: Sol. aquosa de persulfato de potássio 
Após a adição de partes iguais das soluções 1 e 2 ao meio de cultura, o 
aparecimento de um anel róseo na superfície indica reação positiva. 
H2S: Pesquisa através do escurecimento do meio 
 
MOBILIDADE 
Os germes móveis apresentam crescimento difuso, ao passo que os imóveis 
ficam confinados à linha de picada ou á superfície em que foram semeados. 
 
CITRATO 
 Cloreto de sódio: 5 g 
 Sulfato de magnésio: 0,2 g 
 Fosfato de amônio: 1 g 
 Fosfato de potássio: 1 g 
 Citrato de sódio: 5 g 
 Azul de bromotimol: 0,08 g 
 Ágar: 20 g 
 Água destilada: 1000 mL 
 pH. 7.0 
 Reações Citrato positivas são observadas quando da viragem do indicador azul 
de bromotimol para cor azul (pH 7.6). 
 
 Após a interpretação das provas em separado, e do registro de resultados na 
tabela própria, compare o conjunto obtido com o quadro que apresenta a bioquímica 
 
40 
 
simplificada para Enterobacteriaceae. Você pode chegar a uma identificação da 
amostra em estudo? 
 
7- DISCUTA 
Faça um esquema geral das etapas seguidas segundo o procedimento adotado 
para o isolamento e identificação de bactérias dos espécimes escolhidos e semeados 
originalmente. 
 
49 
 
BIOQUÍMICA SIMPLIFICADA PARA ENTEROBACTERIACEAE 
 
 
 
 
Provas bioquímicas 
Microrganismos 
 
P
ro
te
u
s 
 
P
ro
vi
d
en
ci
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K
 le
b
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el
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A
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zo
n
a
 
 
C
it
ro
b
a
ct
er
 
Produção de H2S (TSI) +/- - - - - - + + + + 
Redução de nitrato + + + +* + + + + + + 
Fenilalanina desaminase + + - +* - - - - - - 
Urease + - + + - -** - - - - 
Ácido em lactose - - + +/- + -** - - +/- +/- 
Ácido e gás em glicose +/- - + + + - + + + + 
ácido em manitol - + + + + +/- - + + + 
Lisina descarboxilase - - + + +/- - - + + - 
Utilização de malonato - - - +/- - - - - + - 
Mobilidade (SIM) + + - +/- +/- - + + + + 
Utilização de citrato +/- + + + - - - + + + 
Produção de indol (SIM) +/- + - - + +/- - - - +/- 
 
+ = positiva; - = negativa; +/- = positiva ou negativa (depende da espécie); * = apenas uma espécie negativa; ** = apenas uma espécie positiva. 
 
50 
 
PRÁTICA 7: RESPIRAÇÃO DE MICRORGANISMOS 
 
1- ASSUNTO 
 
 Verificação da viabilidade de culturas bacterianas, utilizando-se azul de 
metileno e TCC (Cloreto de Trifeniltetrazólico). 
 Leitura da série bioquímica. 
 
2- INTRODUÇÃO 
 
 Qual o seu conceito de respiração? 
 Como você pode demonstrar que um ser vivo está respirando? 
 Você pode usar este método para demonstrar a respiração de um 
microrganismo? 
 Que tipo de aplicação poderia ter a demonstração da atividade respiratória 
em cultura microbiana? 
 
3- MATERIAL 
 
 Tubos de ensaio com cultura bacteriana: dois por mesa; 
 Solução de azul de metileno 1:10.000: 1 por sala; 
 Solução de TCC a 0,2%: um por sala; 
 Pipetas de 1mL: 2 por mesa; 
 Reativo de G. Ilosva: solução A e B; 
 Cloreto férrico:10%; 
 Reativo de Ehrlich. 
 
4- EXECUÇÃO 
 
Colocar 1mL da solução de azul de metileno em um dos tubos de cultura. 
Homogeneizar, deixar sobre a mesa e observar. 
 
51 
 
Colocar 1mL da solução de TTC no outro tubo de cultura, Homogeneizar, 
deixar sobre a mesa e observar. 
 
5- RESULTADOS 
 Como se comportam o azul de metileno e o TCC quando introduzidos na 
cultura bacteriana? Explique. Compare seu resultado com os de seus colegas. O 
tempo gasto para a reação ocorrer foi o mesmo? Tente explicar o observado. 
 O que você pode supor em relação à velocidade de reação e a população 
microbiana (quantitativamente)? 
 Agite os dois tubos e observe o que acontece. Qual a sua conclusão sobre 
o observado? Explique. 
 As alterações ocorridas com o azul de metileno e o TCC são resultantes de 
reações de oxirredução. Um microrganismo com metabolismo essencialmente 
fermentativo não reduz essas substancias. Com base nestas informações, em 
que etapa do metabolismo respiratório você supõe que a reação ocorra? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
52 
 
PRÁTICA 8: CONTROLE DE POPULAÇÕES MICROBIANAS 
 
1- ASSUNTO 
 
 Controle de população microbiana por métodos físicos (calor seco e 
úmido). 
 Controle de população microbiana por métodos químicos (ação de 
anticépticos sobre a microbiota das mãos). 
 
2- INTRODUÇÃO 
 
Em diversos casos do cotidiano laboratorial e de nossas vidas é necessário 
que façamos o controle do crescimento de microrganismos, pois, muitos deles 
podem degradar alimentos deteriorar diversas coisas que nos são úteis de 
alguma forma e na pior das hipóteses podem ser patogênicos. Neste contexto é 
de suma importância o controle destas populações microbianas, porém, o tipo de 
controle a ser aplicado depende do objetivo a ser alcançado, pode-se esterilizar 
material para uso cirúrgico, fazer assepsia de um local de ferimento ou até 
mesmo deixar livre de microrganismos um objeto que será utilizado para 
produção e beneficiamento de alimentos. 
Populações microbianas sejam elas de qualquer fonte ou de qualquer 
espécie são passíveis de serem controladas de diversas formas, mas em geral 
estes métodos se enquadram em dois grupos, os controles físicos e os controles 
químicos. Os controles físicos são: temperatura (oxida proteínas estruturais de 
membrana) e radiação(danifica o DNA). Dentre os controles químicos enquadram-
se: utilização de antissépticos, substâncias que interferem diretamente no 
metabolismo microbiano e ainda substâncias lesivas a estruturas vitais ao 
microrganismo como a parede celular em bactérias. 
 Como é possível controlar a população microbiana em um ambiente? 
 O calor é eficiente agente germicida? 
 Existem variações entre os microrganismos quanto à sensibilidade ao 
calor? 
 
53 
 
 Quais seriam o tempo e a temperatura adequados para se obter 
esterilização? 
 Como se pode demonstrar a existência de microrganismos na pele 
humana? 
 Seria possível reduzir o número ou eliminar estes microrganismos? 
 
3- MATERIAL 
 
 Soluções anticépticas: álcool iodado e anticéptico comercial; 
 Sabão em barra; 
 Placa de ágar simples; 
 Toalhas de papel esterilizadas; 
 Culturas de Escherichia coli e Bacillussp. 
 Tubos de ensaio com tiras de papel filtro esterilizadas, seis por mesa. 
 Caldo simples: 30 mL por mesa; 
 Pipetadores automáticos de 0,1mL, um por mesa; 
 Ponteiras esterilizadas. 
 
4- EXECUÇÃO 
 
4.1 – CONTROLE DA POPULAÇÃO MICROBIANA POR MÉTODOS FÍSICOS 
 
Marcar os tubos de ensaio da seguinte maneira: 
1. E. coli - autoclave 
2. Bacillus sp. – autoclave 
3. E. coli - forno de Pasteur 
4. Bacillus sp. - forno de Pasteur 
5. E. coli - controle 
6. Bacillus sp. - controle 
Identificar os tubos com número da mesa. 
Embebedar as tiras de papel de filtro inoculando 0,1mL da cultura de E. coli 
ou Bacillus sp. 
 
54 
 
Submeter os tubos 1 e 2 a tratamento em autoclave por 20 minutos a 120ºC, 
os tubos 3 e 4 em forno de Pasteur pelo mesmo tempo e a mesma temperatura. 
Os tubos 5 e 6 não serão submetidos a nenhum tratamento. 
Após o tratamento colocar em cada um dos tubos 5mL de caldo simples 
esterilizado, Utilizar uma pipeta para os tubos de E. coli e outra para os tubos de 
Bacillus sp, e obedecer a seguinte ordem: autoclave, forno de Pasteur, controle. 
Tomar cuidado para não encostar a ponta da pipeta na fita de papel. 
Incubar a 37ºC. 
4.2– CONTROLE DA POPULAÇÃO MICROBIANA POR AGENTES QUÍMICOS 
 
 Dividir com pincel atômico a parte externa do fundo da placa de ágar simples 
em três setores e marcar I, II e III. 
 Sem lavar as mãos abrir a placa e tocar o dedo indicador da mão direita no 
setor I. Fechar a placa. 
 Lavar as mãos demoradamente(3 a 5 minutos) com água e sabão neutro. 
Enxugar as mãos com toalha estéril e tocar com o mesmo dedo indicador no setor 
II. 
 Passar a solução anticéptica nas mãos (álcool iodado ou um anticéptico 
comercial), enxugar em toalha estéril e tocar com o dedo indicador no setor III; 
 Identificar o material e incubar a placa a 370C. 
 
5- RESULTADOS E CONCLUSÃO 
 
5.1 – MÉTODOS FÍSICOS 
 
Observar e anotar o resultado na tabela abaixo: 
CULTURA 
CRESCIMENTO EM 
CALDO SIMPLES APÓS 
AUTOCLAVE 
SUBMETIDS A 120ºC POR 
20’ EM FORNO DE 
PASTEUR 
E. coli 
Bacillus sp. 
 
55 
 
 
 As duas amostras usadas diferem quanto à sensibilidade ao calor? 
Como explicar esta diferença? 
 Houve diferença entre o material tratado em autoclave e em forno de 
Pasteur? Interprete. 
 
5.2 – MÉTODOS QUÍMICOS 
 
 Tipos de colônias 
Procedimento Setor 
N°. Colônias 
Aspecto 
morfológico 
Mãos antes da lavagem I 
Mãos após a lavagem 
(sabão) 
II 
Mãos após a anti-sepsia III 
 
 Como explicar as diferenças observadas no setor I, II e III? 
 Qual foi o efeito da lavagem de mãos na população microbiana 
observada? 
 Houve diferença entre o resultado obtido com anticéptico comercial e a 
solução de álcool iodado? 
 Neste experimento ficou demonstrada a ação de anticépticos sobre toda a 
microbiota das mãos? 
 Compare seus resultados com os de seus colegas. Houve diferença? 
Tente explicá-la. 
 
 
 
56 
 
PRÁTICA 9: CRESCIMENTO E TITULAÇÃO DE VÍRUS 
BACTERIANO EM MEIOS LÍQUIDO E SÓLIDO 
 
1- ASSUNTO 
 Multiplicação e titulação de bacteriófago (vírus parasita de bactérias) em 
meio líquido e sólido. 
 
2- INTRODUÇÃO 
Os vírus são extremamente microscópicos e de difícil visualização, e sendo 
assim como evidenciar sua presença no ambiente? 
Os vírus bacterianos conhecidos como bacteriófagos são parasitas 
obrigatórios como qualquer vírus conhecido. O que o torna especial, é a sua 
especificidade em infectar bactérias e as utilizar como “fábricas” de novos vírus e 
isso leva as bactérias a lise e consequentemente a morte. Esta capacidade de 
infectar e destruir bactérias nos serve de ferramenta para evidenciar sua presença 
no meio e nos responde o questionamento anteriormente levantado, pois quando 
o vírus se multiplica em um meio em que bactérias foram cultivadas, o mesmo as 
infecta e as mata criando halos de morte bacteriana. 
A propagação do vírus bacteriano é um fenômeno avaliado indiretamente 
pela lise do hospedeiro (célula bacteriana), como conseqüência do rompimento 
dos envoltórios celulares pela lisozima do vírus. Macroscopicamente a lise total ou 
parcial pode ser detectada em meios sólidos e líquidos pela destruição das 
culturas e a formação de halos de lise bacteriana. 
 Qual a importância e as aplicações do estudo dos bacteriófagos em 
Biologia? 
 No ambiente, em que material podem estar presentes os vírus? 
 Que recursos técnicos podem ser utilizados para detectar a presença de 
vírus em um determinado material? Quais são as principais etapas que devem ser 
seguidas? 
 Havendo evidências de presença de vírus em um material, seria possível 
saber a quantidade? Como isto pode ser feito? 
 
57 
 
 Tendo em vista o exposto acima, como pode ser aplicado tal efeito dos 
vírus sobre as bactérias? Há alguma aplicação prática? Qual? 
 
3- MATERIAL 
 Tubos contendo 0,9 mL de caldo simples: 6/mesa 
 Bacteriófago diluído a 10-2: 1/mesa 
 Cultura jovem de E. coli: 1/mesa 
 Pipetadores de 100 µl: 1/mesa 
 Ponteiras: 20/mesa 
 Cotonetes estéreis 
 Meio de lisado em placas de Petri: 5/mesa. 
 
4- EXECUÇÃO 
4.1. Marcar os tubos com caldo simples: 
Tubos: 1 (10-3); 2 (10-4); 3 (10-5); 4(10-6), 5(10-7) e C(controle). 
4.2. Marcar as placas de Petri, com meio de cultura, o no da diluição que 
será utilizada para a titulação (10-3 por ex.), n° da mesa e turma. 
4.3. Fazer a diluição do fago: Usando pipetador automático, adicionar ao 1° 
tubo da série (diluição 10-3) 0,1 mL do fago-estoque (previamente diluído a 10-2). 
 Desprezar a ponteira. 
 Usando outra ponteira, misturar (aspirando e soprando lentamente, 3 a 4 
vezes) 
 Transferindo 0,1 mL ( da diluição 10-3) para o tubo seguinte (diluição 10-4). 
 Desprezar a ponteira. 
4.4. Usando a mesma técnica, repetir a operação do item anterior para obter 
as diluições 10-5 a 10-7. 
 No final, desprezar 0,1 mL da diluição 10-7. 
4.5. O último tubo C (controle) não recebe fago e servirá para observar o 
crescimento bacteriano. 
4.6. Usando pipetador automático, acrescentar, a partir do tubo C (controle) 
até a diluição 10-3 0,1 mL da cultura jovem de E. coli B-4. 
 
58 
 
4.7. Imediatamente, usando pipetador automático, e iniciando pelo tubo n° 5 
(10-7), transferir 0,1 mL da mistura para uma placa de Petri com meio de lisado, 
previamente marcada. 
4.8. Repetir o mesmo com diluições 10-6, 10-5, 10-4 e 10-3. A seguir, com 
auxílio de uma alça de drigalski espalhar 0,1mL da mistura, a fim de cobrir 
homogeneamente toda a superfície do meio. Isto é extremamente importante. 
Recolher as placas e colocar na estufa a 37C. 
 
ESQUEMA DE EXECUÇÃO: 
 
 
 Fago 
 d= 10-2 
 
 0,1mL 0,1mL 
 
 0,1mL 0,1mL 0,1mL 0,1mL 
 
 
 0,9 mL de 
 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 caldo simples 
C 
 0,1mL de E. coli 
 
 
 
 
59 
 
5- RESULTADOS E CONCLUSÃO 
5.1 – MEIO SÓLIDO 
 Observe as placas inoculadas. Houve alteração do meio de cultura? Procure 
interpretá-la. Procure verificar a presença de áreas de lise bacteriana 
(ausência de crescimento bacteriano caracterizados por halos de aspecto 
mais claro). 
 As áreas circulares são resultantes de diversos ciclos de multiplicação 
viral, iniciados a partir de uma célula infectada. 
 Conte o número dessas áreas (denominadas UFP = unidades formadoras 
de placa) nas diluições em que elas se encontram suficientemente separadas. 
 Anotar os resultados no quadro abaixo: 
 
DILUIÇÃO DO VÍRUS 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 CONTROLE 
N° DE UFP 
 
 O que significam os números encontrados nas diferentes diluições? 
 Qual é o título do vírus presente na preparação utilizada? Como calculá-
lo? 
 Qual é a unidade usada para expressar este título? 
 Procure observar as placas onde houve lise confluente (grande número de 
UFP, tão próximos que se fundem). Qual é o significado da presença de colônias 
bacterianas nessas áreas? 
 A partir do conhecimento adquirido com bacteriófagos, como você faria 
para titular um vírus animal? 
Compare os dados obtidos das duas técnicas de titulação. A que você atribui 
as diferenças observadas? 
Fórmula do meio de lisado: ágar simples + indicador de Andrade. 
 Na placa abaixo, foi semeada uma suspensão que continha 0,1 mL de 
solução de bacteriófago na diluição de 10-5 e 0,3 mL de cultura de Escherichia 
coli. 
 
60 
 
 
 
a) Qual o nome e o significado das áreas claras na placa? 
b) Qual o título do bacteriófago? 
c) Qual o significado das colônias crescidas nas áreas claras? 
 
 Em relação à multiplicação de um vírus parasitando uma célula 
eucariota, responda: 
 
a) Como se visualiza a ocorrência de infecção viral em uma monocamada de 
células eucariotas? 
b) Se, antes da inoculação do vírus na cultura celular, este for incubado com 
um anti-soro específico, qual o resultado esperado? Explique. 
 
5.2 – MEIO LÍQUIDO 
Compare-os com o aspecto de crescimento no tubo controle. 
Caso tenha havido crescimento de vírus em algum tubo, o que se espera 
que tenha ocorrido com as bactérias? 
Qual seria então o aspecto nesse tubo? 
Anote na tabela abaixo, os resultados seguindo o seguinte critério: 
Negativo: Aspecto do meio: Presença de bactérias, logo, ausência de vírus. 
Positivo: Aspecto do meio: Ausência de bactérias, presença de vírus.