Espectrometria de massas

Prévia do material em texto

NP2 – Biotecnologia
ELETROFORESE 
Princípio:
DNA tem polo negativo, e, quando colocado em uma matriz de gel e submetido a uma corrente elétrica, irá migrar para o polo positivo (ânodo). 
Agarose: visualização de fragmentos que variam de 0,2 kB a 50 kB (1 kb = 1000 pares de bases). A sua preparação consiste em agarose + tampão (não sendo tóxica, como a poliacrilamida). O gel pode ser reciclado após o uso e esse método pode ser utilizado para purificar amostras com DNA. O corante utilizado, posteriormente, será o brometo de etídeo EtBr que é mutagênico.
X
Poliacrilamida: visualização de pequenos fragmentos até 1kB. Em solução, pode ser neurotóxica e necessita de cautela em sua manipulação.
Técnica
1.Preparação do gel:
1.1 - Parecido com a preparação de uma gelatina, na qual é colocada uma quantidade de pó de agarose extraído de algas marinhas vermelhas, e, no lugar da água, é colocado um tampão, que pode ser TAE (Tris-acetato-EDTA) ou TBE (Trisborato-EDTA).
1.2 - É colocado um pente, no qual, em cada espaço, será colocada uma amostra de DNA (ele será responsável por moldar os poços).
1.3 – A forma contendo o gel é colocada no interior da cuba de eletroforese horizontal, onde passará a corrente elétrica. O mesmo tampão utilizado para a preparação do gel é colocado sobre a forma e o pente é retirado
2. Aplicação das amostras:
2.1 – A amostra de DNA deverá ser adicionada a um tampão contendo corantes (acrescentam cor a amostra) e reagentes de alta densidade (asseguram que a amostra entre no poço pela gravidade).
2.1.1 - Corantes: azul de bromofenol e xileno cianol – apresentam velocidade conhecida (cada um tem a sua e é utilizado para tamanhos específicos de fragmentos)
2.1.2 - Reagentes de alta densidade: sacarose, glicerol ou ficol
2.2 – Adição do ladder – mistura de diversos fragmentos de DNA de tamanhos variados, que permite inferir, por comparação, o tamanho dos fragmentos encontrados na amostra.
3. Corrida de eletroforese:
3.1 – Deve ser utilizada uma voltagem adequada às amostras analisadas.
3.2 – Uma vez ligada a corrente, os fragmentos de DNA da amostra migrarão do pólo negativo ao pólo positivo. Os fragmentos menores migrarão mais rápido e os menores, mais lentamente.
3.3 - No caso da utilização do azul de bromofenol, quando este atingir ¾ do gel a corrente pode ser desligada.
Corantes para análise dos resultados:
Brometo de etídeo (EtBr):
- Com este método pode-se detectar uma quantidade igual ou maior que 10 ng de DNA e a intensidade de fluorescência emitida é proporcional à concentração de DNA presente na amostra. Ele é tóxico.
- Ele pode ser utilizado de 3 formas: aplicado diretamente no gel (uso mais frequente), no tampão da amostra a ser aplicada, ou após a corrida quando o gel é submergido em solução de EtBr.
Azul de metileno:
- Não apresenta potencial mutagênico e não requer luz U.V;
- Pouco sensível;
Sybr Safe®:
- Corante fluorescente que cora o DNA no gel de agarose e no gel de poliacrilamida exibindo a mesma sensibilidade que o brometo de etídeo;
- Visualizado no transiluminador de luz azul;
GelRed e o GelGreen:
- Pelo fato de serem termoestáveis podem ser adicionados antes da homogeneização do gel.
Fotodocumentação:
- Formação de bandas de DNA de acordo com os tamanhos encontrados.
- Fotodocumentação dos resultados, caso do EtBr utiliza-se luz UV pela polaroid e depois é utilizado um software.
Interferentes na migração do DNA:
Tamanho e conformação do DNA 
- Mobilidade das formas do DNA no gel não depende somente do tamanho da molécula, mas da densidade, torção do DNA
Concentração de agarose 
- O tamanho dos poros desta matriz é inversamente proporcional à concentração de agarose utilizada e diretamente proporcional ao tamanho dos fragmentos de DNA que se deseja separar.
Presença do brometo de etídeo no gel
Voltagem e tipo de tampão de eletroforese aplicada
ELETROFORESE DESNATURANTE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)
Princípio:
- Utiliza SDS (detergente anfipático de carga negativa), que será responsável por desnaturar as proteínas, para que elas fiquem na forma linear e retirar sua carga. 
- DTT ou 2-mercaptoetanol é utilizado para desfazer as pontes dissulfeto, ajudando a eliminar a estrutura tridimensional dos polipeptídios.
- Depois é realizada a eletroforese convencional.
ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
Princípio:
- Juntamente com a espectrometria de massas, são as duas principais técnicas utilizadas na proteômica.
Técnica:
1. Preparação da amostra
1.1 – Purificação de proteínas;
1.2 – Solubilização das proteínas (quebra das interações macromoleculares, como as pontes dissulfeto e as interações não covalentes): agentes caotrópicos, como a ureia e a tioureia;
1.3 – Desagregação das proteínas;
1.4 – Desnaturação das proteínas;
1.5 – Redução das proteínas: 2-mercaptoetanol, DTT e TBP (mais utilizado atualmente, porém mais volátil, mais tóxico e requer solvente orgânico para dissolver H2).
2. Primeira dimensão: focalização isoelétrica (IEF) - Permite a separação das proteínas de acordo com seu ponto isoelétrico (cada proteína tem um pH específico no qual suas cargas parciais serão anuladas), e isso impede que as proteínas fiquem sobrepostas, como na eletroforese convencional
2.1 – Reidratação das tiras de gel: tiras de IPG (immobilized pH gel). A amostra pode ser misturada a solução de rehidratação diretamente (melhor), ou pode ser aplicada sobre a tira pelos sample cups. Podem ser utilizados como solução de rehidratação – ureia, CHAPS, Buffer e Azul de bromofenol;
2.2 – Focalização isoelétrica: adição de um campo elétrico ao gel, fazendo com que as proteínas migrem até encontrar uma faixa de pH referente ao seu ponto isoelétrico;
3. Segunda dimensão (eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida) 
3.1 – A tira é mergulhada duas vezes em uma solução de equilíbrio da tira (strip) SDS PAGE (desnaturante) e depois é colocada em um gel de poliacrilamida;
3.1.1 – Solução de equilíbrio: 1- Tris-HCl, ureia, glicerol, SDS, Azul de bromofenol e DTT. 2 - Tris-HCl, ureia, glicerol, SDS, Azul de bromofenol e iodoacetamida a 2,5%;
3.1.2 – Preparação do gel SDS PAGE: Acrilamida, tampão Tris HCl, H20 miliQ, glicerol, SDS 10%, persulfato de amônio e TEMED;
3.2 – Migração dos polipeptídeos em função de suas massas moleculares: formação de spots;
3.2.1 – Colocação da tira de IPG no topo do gel;
3.2.2 – Selar com agarose + azul de bromofenol;
3.2.3 – A corrida dever ser interrompida quando o azul de bromofenol atinge o final do gel;
4. Detecção de proteínas
4.1 – Métodos colorimétricos: Azul brilhante de comassie, nitrato de prata, fluorescência/autoradiografia, coloração de glicoproteínas, imunoquímicos (dependem da faixa dinâmica de detecção, linearidade, reprodutibilidade e variabilidade interproteínas);
4.2 – Espectrometria de massas: digestão das proteínas pelos peptídeos trípticos ionização análise detector 
5. Digitalização e análise da imagem
5.1 – Softwares com scanner
WESTERN BLOTTING
Princípio:
- É um método da biologia molecular e da bioquímica que visa detectar, caracterizar e quantificar múltiplas proteínas em amostras de tecidos ou lisados celulares. É uma técnica de alta especificidade e alta sensibilidade (detecta proteínas mesmo elas estando em baixas quantidades), com grande emprego no diagnóstico de doenças animais, como, por exemplo: HIV, HBV e Herpes Vírus.
Vantagens:
- Membranas úmidas são maleáveis e de fácil manuseio; 
- As proteínas imobilizadas na membrana são rapidamente e uniformemente acessíveis a diferentes ligantes; 
- Somente uma pequena quantidade de reagentes são necessários para a análise de transferência; 
- É possível fazer múltiplas réplicas do gel;
- O armazenamento da amostra transferida pode ser prolongado, antes de ser usada e a mesma proteína transferida pode ser usada para múltiplas análises sucessivas;
- Em estudos relacionados à detecção de anticorpos e proteínas de agentes infecciosos, este método é considerado altamente sensível e específico, sendo o método de eleição para diagnóstico de inúmeras doenças dos animais
Técnica:
1. Preparaçãodas amostras e fracionamento proteico: um dos processos mais importantes de toda a técnica. Pode ser utilizado como fonte de proteína: tecidos, culturas celulares e fluídos corporais, como plasma ou líquido cefalorraquidiano (LCR), proteínas de bactérias, vírus e outros agentes infecciosos;
1.1 – Remoção de tecido e células: remoção rápida do tecido, a dissecção e o congelamento (em nitrogênio líquido ou a -80° C);
1.1.1 - Prevenção da degradação e desfosforilação protéica: adição de proteases e inibidores de fosfatases;
1. 1 2 – Homogeneização e centrifugação: fragmentação de proteínas em pequenas partículas, facilitando a sua solubilização. Os métodos de homogeneização usados podem ser divididos em cinco categorias: por homogeneização mecânica, ultrassônica, por pressão, por descongelamento e osmótica ou lise por detergentes; A solubilização de amostras implica no uso de caotrópicos (como uréia e/ou tiouréia), detergentes (CHAPS) ou Triton X-100, agentes redutores (como ditiotreitol/ditioeritritol (DTT/DTE) ou tributilfosfina (TBP) e inibidores de proteases.
1.2 – Remoção de contaminantes;
1.3 – Método de enriquecimento de proteínas;
2. Eletroforese em gel (SDS-PAGE)
3. Transferência das proteínas para membrana semipermeável
3.1 - Depois de realizada a eletroforese, é colocada a membrana semipermeável (carregada positivamente) sobre o gel (carregado negativamente). É aplicada uma corrente elétrica e as proteínas presentes no gel são passadas para a membrana na mesma disposição.
3.1.1 – Tipos de membranas utilizadas: base de nitrocelulose, polivinildina difluorada (PVDF), papel ativado ou nylon ativado. A mais utilizada hoje é a de nitrocelulose pois apresenta melhor eficiência na ligação de diferentes tipos de proteínas.
3.1.2 – A transferência de proteínas do SDS-PAGE para uma membrana de nitrocelulose ou de PVDF pode ser executada de diferentes maneiras tais como: difusão simples; transferência a vácuo; electroblotting, esta última é a que correntemente tem sido utilizada na atualidade. As principais vantagens do Electroblotting são a velocidade e a transferência completa quando comparada à difusão simples e à transferência a vácuo. O eletroblotting pode ser realizado por imersão completa de um sanduíche gel-membrana em uma solução tampão (transferência úmida) ou colocando o sanduíche gel-membrana entre papel filtro absorvente em um tampão de transferência (transferência semi-seca). O método mais consagrado é o de transferência horizontal semi-seca.
4. Bloqueio das ligações inespecíficas
4.1 – Várias proteínas podem se ligar fortemente a nitrocelulose, atrapalhando o experimento. Para isso, são adicionadas proteínas para bloquear essas ligações;
4.1.1 – Pode ser adicionado: leite seco desnatado, soro albumina bovina (BSA), Triton X-100, Nonidet P-40 e Tween 20 são eficazes na remoção de ligações proteicas.
5. Anticorpo
* Anticorpo monoclonal é o anticorpo específico para o antígeno e produzido por um hibridoma de céulas B. Anticorpo policlonal é o anticorpo que possui vários clones, ou seja, se originam de diferentes linfócitos B, assim, eles conseguem reagir com vários epítopos de um só antígeno.
* Anticorpo primário (pode ser monoclonal ou policlonal) e é aquele que se liga diretamente ao epítopo de um ag. Anticorpo secundário é aquele que possui afinidade pelo anticorpo primário e geralmente ele apresenta uma enzima reveladora acoplada a ele.
4.1 – É adicionado um Ac primário (monoclonal ou policlonal);
4.2 – É adicionado um Ac secundário (acoplado a uma enzima reveladora);
4.3 – É adicionado um substrato, que irá reagir com a enzima reveladora caso o Ac se ligue na membrana;
4.3.1 – Substratos: horseadish peroxidase ou fosfatase alcalina ligados à anticorpos são usados com inúmeros substratos solúveis que produzem produtos coloridos insolúveis.
6. Scanner
6.1 – Por meio da quimioluminescência, é possível observar a presença de cor ou não;
6.2 – Essa fluorescência é detectada por um filme fotográfico ou câmeras especiais que capturam uma imagem digitalizada do WB;
6.3 - A imagem é analisada por densitometria, a qual avalia a quantidade de proteína colorida e quantifica os resultados em termos de intensidade óptica;
Desvantagens 
- Dificuldade de obtenção de fotografias com qualidade, diferetemente do método radioativo, pois a coloração da reação apresenta baixo contraste;
Não produz resultados quantitativos.
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
Definição:
Espectrometria de massas é um conjunto de técnicas que visam a formação de íons (mais fáceis de trabalhar), com ou sem fragmentação, a partir de moléculas para a detecção de uma estrutura a ser estudada (geralmente compostos ainda não descritos na literatura). Isso é feito a partir da relação massa/ carga (m/z), quando é gerado um campo eletromagnético. A espectrometria de massas atua como uma balança atômica, sendo capaz de diferenciar moléculas diferentes em até um átomo.
Ela pode ser utilizada posteriormente a uma análise pela eletroforese (detecta um biomarcador, por exemplo), e a espectrometria analisa as propriedades desse biomarcador para distinguí-lo.
Importância:
- Determinação de massa molecular com elevada exatidão, inclusive biomoléculas e materiais poliméricos;
- Identificação de substâncias, mesmo em misturas complexas (como vários compostos proteicos, não é necessário grau de pureza);
- Informação estrutural (conectividade de átomos, informações termoquímicas);
- Análise e padrões isotópicos;
- Técnica qualitativa e quantitativa;
- Alta sensibilidade;
- Universal e específica;
- Técnica rápida
Aplicações:
- Biotecnologia, agropecuária, farmacêutica, clínica, ambiental, geologia, esportes e medicina forense.
- Informação da massa molecular (com precisão), identificação de proteínas, informação estrutural, sequenciamento de peptídeos, identificar modificações pós-traducionais (fosforilação, glicosação e pontes dissulfeto) e elucidar as propriedades químicas e estruturais das moléculas.
Funcionamento:
Fonte de ionização (transforma o estado da matéria em gasoso) bomba de vácuo Analisador de massas (separação por massa/carga (m/z) Detectores (transformam a corrente de íons em sinais elétricos para serem processados) Pesquisa em banco de dados
Tripsina:
- Digestão da proteína em fragmentos menores
Ionização:
Transforma a matéria em estado gasoso e permite a formação de íons devido ao PE gerado).
Electrospray (ESI) – (método agressivo, muitos fragmentos podem não ser detectados):
- Função: transformar o estado da matéria em gasoso e ionizado;
- Utilização: moléculas termolábeis, como proteínas. 
- Funcionamento: uma agulha com solução ácida + estrato proteico e recebe um alto potencial elétrico, sendo ionizados ao chegarem ao analisador.
MALDI:
- Funcionamento: Fonte a laser (com comprimento de onda específico) incide em uma placa embebida com solução acida (matriz) e ocorre a evaporação, gerando carga para a molécula.
- Desvantagens:
Procedimento caro.
- Vantagens: 
1) Ionização suave – análise de biomoléculas intactas;
2) Extensa faixa de massa (> 400 kDa);
3) Análise de misturas - sem purificação;
4) Alta sensibilidade;
5) Fácil interpretação dos dados;
6) Rápida;
7) Fácil uso e manutenção (depende);
8) Componentes orgânicos termo-instáveis, não voláteis de alto peso molecular;
Analisadores de massa:
- Função: Após a formação dos íons, eles são acelerados até um analisador de massas por uma corrente elétrica, que necessita ocorrer no vácuo para não ter interferências externas. Ele irá separar os íons de acordo com sua massa/carga (m/z), ou seja, irá medir o tempo que íons de diferentes massas levam para mover-se da fonte de íons até o detector.
OBS: íons menores chegarão primeiro ao detector.
Eles podem ser contínuos (transmitem um único íon de razão m/z ao detector) ou pulsados (coletam um espectro de massas inteiro a partir de um pulso simples de íons).
TOF (analisador pulsado): 
- Princípio: mede o tempo de vôo da fonte do íon até o detector.
- Utilizado: após Electrospray ou MALDI 
- Pode ser:
TOF linear: 1 detectorm/z (muito ruído)
TOF refletor: 2 detectores m/z (pouco ruído – mais específico)
MS:
- Princípio: após a ionização, esses íons passam por um campo elétrico perpendicular, gerando uma deflexão (menor a massa, mais fácil o desvio do campo magnético, maior sua deflexão)
* Íon molecular instável: poderá ser quebrado em fragmentos menores
* Íon molecular: Mais integro, livre de contaminantes e ruídos (primeiro a ser analisado, diz a relação massa carga da molécula)
Detectores:
Placa de Micro canais (MCP): 
Características: Um arranjo de capilares de vidro, paredes internas, material condutor de energia elétrica, alta voltagem;
- Funcionamento: íon que colidir na parede interna dos capilares criará uma avalanche de elétrons secundários espectro de massa leitura