Ruptura induzida por CRISPR

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Ruptura induzida por CRISPR/Cas9 dos genes da proteína 1 e 2 da haste paraflagelar em Trypanosoma cruzi revela seu papel na fixação flagelar.
ABSTRATO
O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, e os métodos atuais para sua manipulação genética têm sido altamente ineficientes. Relatamos aqui o uso do sistema CRISPR (clustered regularmente interspaced short palindromic repeats)/Cas9 (CRISPR-associated gene 9) para interromper genes no parasita por três estratégias diferentes. A utilidade do método foi estabelecida pelo silenciamento de genes que codificam a proteína GP72, que é necessária para a fixação flagelar, e proteínas de haste paraflagelar 1 e 2 (PFR1, PFR2), componentes-chave do flagelo do parasita. Usamos vetores contendo RNA guia único (sgRNA) e Cas9, separadamente ou em conjunto, ou um vetor contendo sgRNA e Cas9 mais DNA doador para recombinação homóloga para gerar rapidamente linhas celulares mutantes nas quais os genes PFR1, PFR2 e GP72 foram interrompidos . Demonstramos que a edição do genoma desses genes endógenos em T. cruzi é bem-sucedida sem toxicidade detectável de Cas9. Nossos resultados indicam que PFR1, PFR2 e GP72 contribuem para a fixação flagelar ao corpo celular e motilidade dos parasitas. Portanto, o CRISPR/Cas9 permite a ruptura gênica eficiente em um parasita quase geneticamente intratável e sugere que este método irá melhorar as análises funcionais de seu genoma.
IMPORTÂNCIA
O Trypanosoma cruzi é o agente da doença de Chagas, que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. As vacinas para prevenir esta doença não estão disponíveis e os tratamentos medicamentosos não são completamente eficazes. O estudo da biologia desse parasita por meio de abordagens genéticas possibilitará o desenvolvimento de novas opções preventivas ou de tratamento. Tentativas anteriores de usar o CRISPR/Cas9 em T. cruzi encontraram uma frequência detectável, mas baixa, de recombinação homóloga facilitada por Cas9 e troca de marcadores fluorescentes entre genes exógenos, enquanto Cas9 era tóxico para as células. Neste relatório, descrevemos novas abordagens que geram ruptura completa de um gene endógeno sem toxicidade para os parasitas e estabelecemos a relevância de várias proteínas para fixação e motilidade flagelar
Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas em humanos. Milhões de pessoas são afetadas por esta tripanossomíase na América do Norte, Central e do Sul, onde a doença é endêmica, bem como em países onde a doença não é endêmica, onde ocorre principalmente em trabalhadores migrantes ou receptores de transfusão de sangue e transplante de órgãos. Não há vacinas disponíveis para prevenir esta doença e os tratamentos medicamentosos têm efeitos colaterais graves ou não são completamente eficazes (1). O estudo da biologia desse organismo eucariótico possibilitará o desenvolvimento de inibidores específicos como possível meio de controle dos parasitas sem causar danos aos hospedeiros.
Poucas ferramentas celulares e genéticas estão disponíveis para trabalhar com T. cruzi (2, 3). O parasita é predominantemente diplóide e, portanto, a inativação da maioria dos genes requer duas rodadas de substituição gênica. No entanto, tentativas de gerar mutantes nulos por recombinação homóloga às vezes produzem parasitas com as duas substituições planejadas, mas também com cópias extras dos genes por meio de aneuploidia ou amplificação de genes (4, 5). A técnica de interferência de RNA (RNAi) para knockdowns de genes foi bem desenvolvida em Trypanosoma brucei, que pertence ao grupo de agentes causadores da tripanossomíase africana, mas a maquinaria de RNAi está ausente do T. cruzi(2, 6). Algumas ferramentas genéticas recentes para trabalhar com T. cruzi incluem o desenvolvimento de vetores de expressão estáveis ​​regulados por tetraciclina (7), que nem sempre são bem-sucedidos com proteínas de membrana, e novos sistemas de clonagem para genética reversa baseados na tecnologia gateway (8, 9), mas o campo está consideravelmente atrás do que é possível fazer em comparação com T. brucei (2). Atualmente, a ferramenta genética mais eficiente disponível em T. cruzi é a superexpressão de genes com o vetor pTREX (10), um sistema que permite a expressão gênica constitutiva impulsionada pelo promotor de genes ribossômicos, bem como a integração de sequências no locus do DNA ribossômico. Essa estratégia tem sido usada para aumentar a expressão gênica em T. cruzi (11-13), mas a regulação negativa de genes neste organismo ainda permanece ineficiente. Ao contrário de outros tripanossomas, as epimastigotas de T. cruzi têm um longo tempo de geração e as amastigotas requerem uma célula hospedeira para crescer. Apenas alguns tripomastigotas são suficientes para infectar humanos e acidentes de laboratório também são uma preocupação (14, 15). A consequência de todos esses problemas é que esses organismos não são muito passíveis de análises genéticas ou celulares, embora possuam uma série de características que não podem ser estudadas em outros modelos.
Uma das peculiaridades da cinetoplastida, compartilhada com Euglenida, é a presença do bastonete paraflagelar (PFR), uma estrutura complexa, trilaminar, em forma de treliça, ligada aos microtúbulos axonemais do flagelo (16). Dois componentes centrais do PFR são a proteína PFR 1 (PFR1) e PFR2, que em T. cruzi correspondem ao que era conhecido como PAR3 e PAR2 (17), respectivamente. Os genes que codificam PFR1 e PFR2 são distintos, mas relacionados e estão presentes em conjuntos separados em tandem em T. brucei. A ruptura desses genes tem sido usada para testar diferentes abordagens de RNAi em T. brucei e Leishmania braziliensis. Enquanto a ruptura desses genes resulta em formas procíclicas viáveis (PCF) de T. brucei ou Leishmania sp. promastigotas, a ruptura nas formas da corrente sanguínea (BSF) de T. brucei é letal. Mutantes de RNAi PCF de T. brucei (21) e mutantes nulos de Leishmania mexicana (22) para PFR2 mostram uma diminuição dramática na motilidade flagelar e mudanças na morfologia, enquanto alguns autores não conseguiram obter tripanossomas PCF double-knockout. Um “blob” de componentes de PFR acumulados também é detectado na ponta do flagelo de mutantes de RNAi de PCF, mas o flagelo permanece ligado ao corpo celular. Outra proteína peculiar dos tripanossomas é uma glicoproteína imunodominante localizada na junção entre o flagelo e o corpo celular que é denominada GP72 em T. cruzi (25-28) ou FLA1 em T. brucei e é essencial para a fixação flagelar em ambos T. cruzi e T. brucei.
O advento do sistema procariótico CRISPR (clustered regularmente interspaced short palindromic repeats)/Cas9 (CRISPR-associated gene 9) foi transformador na biologia e tem sido usado para edição de genoma em diversos organismos, desde leveduras a mamíferos e incluindo protozoários patogênicos. Enquanto nosso trabalho estava em preparação, foi relatada uma tentativa de uso em T. cruzi. Os autores usaram RNA guia único transcrito in vitro (sgRNA) para transfectar células e direcionar um gene exógeno previamente transfectado (aquele para proteína fluorescente verde [GFP]) ou genes endógenos de cópia única e múltipla e encontraram uma frequência detectável, mas baixa de Recombinação homóloga facilitada por Cas9 e troca de marcador fluorescente entre genes exógenos (GFP e tdTomato) (taxas de 0,11 e 0,069% de troca de marcador fluorescente). A expressão de Cas9 foi, além disso, tóxica para essas células.
Neste relatório, demonstramos por três estratégias diferentes (usando vetores pTREX contendo sgRNA e Cas9, separadamente ou em conjunto, ou um vetor pTREX contendo sgRNA e Cas9 mais um DNA doador para recombinação homóloga) que a edição genômica de genes endógenos em T. cruzi é bem sucedido sem toxicidade detectável de Cas9. Nossos resultados também indicam que PFR1, PFR2 e GP72 são todos necessários para a ligação flagelar ao corpo celular dos estágios epimastigotas de T. cruzi, demonstrando a utilidade do sistema CRISPR/Cas9 na elucidação do papel de genes específicosneste organismo.
RESULTADOS
Para investigar se o sistema CRISPR/Cas9 poderia ser usado para silenciar genes de T. cruzi, usamos uma versão geneticamente modificada do sistema CRISPR tipo II de Streptococcus pyogenes, consistindo da endonuclease Cas9 e uma quimera de RNA ou sgRNA modificada que conforma um complexo ribonucleoproteico capaz de reconhecer a sequência alvo e produzir quebras de fita dupla.
As quebras de fita dupla geradas por Cas9 podem ser reparadas por recombinação homóloga com DNA doador ou por junção de extremidade não homóloga (NHEJ) propensa a erros. Os tripanossomatídeos são deficientes em NHEJ canônico, mas têm um mecanismo de reparo caracterizado mais recentemente, denominado junção final mediada por microhomologia (MMEJ) (36-38). MMEJ repara quebras de DNA através do uso de microhomologia substancial e sempre resulta em deleções.
Os construtos usados ​​neste estudo são mostrados na Fig. 1.
Nós primeiro investigamos se era possível direcionar Cas9 para o núcleo de T. cruzi usando um sinal de localização nuclear exógeno. Transfectamos epimastigotas com vetor Cas9/pTREX-n ou Cas9/pTREX-b (Fig. 1A) contendo a sequência Cas9 de S. pyogenes com uma sequência repetida duas vezes do sinal de localização nuclear do vírus símio 40 (SV40) (2NLS) e GFP ou com o vetor vazio (pTREX-b ou pTREX-n). A expressão de GFP foi monitorada para determinar a eficiência de transfecção, revelando que ~20% das células apresentaram co-localização de GFP com núcleos de coloração de 4=,6-diamidino2-fenilindol (DAPI). A Figura S1A no material suplementar mostra os resultados obtidos com o vetor Cas9/pTREX-b após aumentar a porcentagem de células fluorescentes por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). Essas células apresentam núcleos verdes fluorescentes, conforme observado pela co-localização com DAPI, confirmando a localização nuclear da fusão endonuclease Cas9-GFP. Resultados semelhantes foram obtidos com o vetor Cas9/pTREX-n. As células transfectadas com os vetores vazios apresentaram morfologia normal e coloração flagelar com anticorpos contra a proteína de ligação ao cálcio flagelar de T. cruzi (TcFCaBP) (ver Fig. S1B no material suplementar). Os plasmídeos recombinantes Cas9/pTREX-n e Cas9/pTREX-b foram então usados ​​para desenvolver duas abordagens diferentes para o silenciamento de genes envolvendo a transfecção de epimastigotas com um (CRISPR-1V, Fig. 1B) ou dois (CRISPR-2V, Fig. 1C ) vetores, respectivamente.
Inicialmente, escolhemos TcPFR1 e TcPFR2 para silenciamento gênico porque seus ortólogos já foram usados ​​como alvos knockdown em T. brucei e L. braziliensis para avaliar a eficiência do sistema de RNAi nesses organismos, produzindo um fenótipo não letal, mas morfologicamente fácil de caracterizar. Também escolhemos o TcGP72 porque o nocaute desse gene resulta em descolamento flagelar sem perda de viabilidade. As sequências de sgRNA usadas para direcionar esses genes continham uma região de 20 (TcGP72) ou 25 (TcPFR1 e TcPFR2) nucleotídeo (nt) que visava uma sequência complementar (o protoespaçador) imediatamente a montante de um motivo adjacente ao protoespaçador (PAM, um NGG sequência necessária para o reconhecimento de S. pyogenes Cas9). Para garantir a especificidade do alvo, comparamos os protoespaçadores com o genoma do T. cruzi para identificar sequências homólogas que continham os protoespaçadores e um PAM, e não conseguimos identificar nenhuma sequência com menos de seis incompatibilidades com o script ProtoMatch v1.0. Também transfectamos células com um vetor contendo um sgRNA codificado (pTREX-s) onde o protoespaçador foi substituído por uma sequência de 20 nucleotídeos codificados que não têm como alvo nenhum gene no genoma do T. cruzi.
Para a estratégia CRISPR-1V (um único vetor para expressão de sgRNA e Cas9), aproveitamos o fato de a transcrição em tripanossomatídeos ser policistrônica. Portanto, organizamos as sequências de um sgRNA específico (ou sgRNA codificado) e Cas9
upstream e downstream do sinal trans-splicing HX1 no
vetor pTREX, respectivamente (Fig. 1B). Desta forma, obtivemos um construto para gerar o complexo ribonucleoproteico CRISPR/Cas9 em T. cruzi usando um protocolo de transfecção de uma etapa. O construto (sgRNA/Cas9/pTREX) permitiu a transcrição de ambas as sequências (o sgRNA e o gene Cas9) e a tradução e importação nuclear de Cas9 sozinho (Cas9-HA-2NLS-GFP). Os sgRNAs TcPFR1 e TcPFR2 foram clonados no vetor Cas9/pTREX-b para gerar os construtos TcPFR1sgRNA/Cas9/pTREX-b e TcPFR2sgRNA/Cas9/pTREX-b (resistente à blasticidina), enquanto o sgRNA TcGP72 foi clonado no Cas9/pTREX -n para gerar o plasmídeo TcGP72sgRNA/Cas9/pTREX-n (resistente à neomicina). Esses plasmídeos foram então usados ​​para transfectar epimastigotas e gerar linhas de células mutantes verdes fluorescentes. Após a seleção na presença de blasticidina ou neomicina, respectivamente, foi feita a triagem celular para enriquecer as populações de parasitas que expressam GFP (estratégia CRISPR-1V). As curvas de crescimento de controle de parasitas transfectados com o sgRNA codificado e Cas9 foram normais após um curto período de atraso, sugerindo a falta de efeitos tóxicos de Cas9 ou o sgRNA codificado (ver Fig. S1C no material suplementar).
A Figura 2A mostra a presença de parasitas com diferentes graus de desprendimento flagelar nas células com PFR2 rompido (Fig. 2A, setas brancas). A Figura 2B mostra o descolamento completo do flagelo do corpo celular em uma epimastigota interrompida por PFR2. Alternativamente, os genes TcPFR1 e TcPFR2 foram interrompidos por CRISPR usando uma estratégia de dois vetores (CRISPR-2V) para gerar linhas celulares fluorescentes vermelhas/verdes duplamente resistentes (neomicina/blasticidina). As alterações fenotípicas foram semelhantes às obtidas pela abordagem CRISPR-1V, confirmando assim que a ruptura de TcPFR1 e TcPFR2 resulta em descolamento flagelar ao corpo celular epimastigota. A Figura 2C mostra diferentes graus de desprendimento flagelar em uma população de epimastigotas interrompidas por PFR1 pela estratégia CRISPR-2V (Fig. 2C, setas brancas). Observe a presença de um núcleo verde e citoplasma vermelho nestas células (Fig. 2C e D). Nem todos os epimastigotas mostraram descolamento flagelar em um determinado momento, e números crescentes de flagelos isolados foram observados no meio de cultura (ver Fig. S2A a C no material suplementar). Células semelhantes a epimastigotas desprovidas de flagelos (ver Fig. S2D a F no material suplementar) também foram observadas nessas populações. O desenvolvimento gradual das alterações fenotípicas também foi revelado pela presença de bolhas na ponta ou perto da ponta do flagelo, após coloração com anticorpos anti-FCaBP (ver Fig. S3 no material suplementar). O exame de epimastigotas interrompidas por TcPFR1 e TcPFR2 CRISPR demonstrou a falta da haste paraflagelar nesses mutantes, conforme visualizado por microscopia eletrônica (EM) em cortes longitudinais e transversais (Fig. 3A). A análise de Western blot confirmou a marcação diminuída de PFR1 (7 a 39% da expressão em células de tipo selvagem) e PFR2 (0 a 56% da expressão em células de tipo selvagem) quando qualquer um dos genes foi interrompido por qualquer um a estratégia CRISPR-1V ou CRISPR-2V (Fig. 3B), sugerindo que a falta de qualquer proteína impede a montagem completa da haste paraflagelar. O exame detalhado por varredura EM também revelou descolamento flagelar do corpo celular (ver Fig. S4B e C no material suplementar).
Conforme relatado anteriormente em um mutante nocaute, a ruptura de TcGP72 por CRISPR/Cas9 também resultou em descolamento flagelar (compare Fig. 4A e B). Enquanto o epítopo de glicano reconhecido pelo anticorpo monoclonal (MAb) WIC29.26 foi distribuído uniformemente por toda a superfície do epimastigota, incluindo o flagelo (Fig. 4A), muito pouca coloração permaneceu no flagelo destacado de epimastigotas mutantes (Fig. 4B) . A fixação flagelar anormal afetou a motilidade desses epimastigotas, que tendiam a afundar mais rapidamentedo que os epimastigotas do tipo selvagem. A análise de Western blot de mutantes de TcGP72 com MAb WIC29.26 mostrou uma diminuição significativa na marcação da banda de 72 kDa em comparação com epimastigotas de tipo selvagem (Fig. 4C). Conforme relatado anteriormente, este anticorpo reconhece o epítopo de glicano em proteínas adicionais de baixo e alto peso molecular (Fig. 4C). O exame de transmissão EM (TEM) do tipo selvagem (Fig. 4D) e o mutante TcGP72 CRISPR (Fig. 4E) revelou o descolamento flagelar com preservação da haste paraflagelar e nenhuma outra alteração morfológica, conforme relatado para os mutantes nocaute GP72. O descolamento flagelar também foi evidente no exame por varredura EM (ver Fig. S4D no material suplementar).
Após a obtenção de populações mistas enriquecidas com mutantes por FACS, populações clonais de epimastigotas com TcPFR2 interrompido foram obtidas por diluições em série em placas de 96 poços, conforme descrito em Materiais e Métodos. Para investigar as mutações causadas por CRISPR/Cas9, amplificamos uma porção do locus genômico TcPFR2 com primers que flanqueiam a sequência direcionada a Cas9. Os loci amplificados foram clonados e os clones individuais foram sequenciados.
Inicialmente, usamos primers para amplificar fragmentos de 200 e 500 bp, mas após várias tentativas de encontrar mutações, projetamos primers para amplificar regiões mais longas (1 e 1,5 kb) onde o protoespaçador de TcPFR2 estava aproximadamente no meio da sequência. No entanto, após analisar mais de 100 clones, não conseguimos encontrar deleções. As análises de Northern blot mostraram uma diminuição acentuada na expressão de mRNA em vários dos clones analisados ​​(Fig. 5A e B). Para descartar a regulação simultânea de genes localizados no mesmo policístron, também realizamos análises de Northern blot de genes situados a montante (subunidade 3 do complexo de partículas de proteína de tráfego, TcPPCS3) e a jusante (subunidade catalítica de DNA polimerase, TcDPaCS) do gene TcPFR2, mas não houve downregulation da expressão desses genes (Fig. 5C). No entanto, a análise de Southern blot de alguns desses clones revelou mudanças dramáticas sugerindo grandes deleções de TcPFR2 (Fig. 5D). O uso da digestão EcoRI do DNA genômico (gDNA) foi baseado na sequência genômica do tipo Esmeraldo de T. cruzi que geraria uma banda única de 4.658 pb em parasitas do tipo selvagem. No entanto, o padrão obtido foi diferente do esperado. Como a sequência do genoma da cepa Y ainda não está disponível, não podemos prever o padrão de marcação gerado com qualquer enzima/sonda de restrição usada. No entanto, este resultado é uma forte evidência de edição do genoma em mutantes PFR2 CRISPR.
Como esses experimentos falharam em demonstrar mutações no
genes endógenos direcionados, investigamos se o CRISPR/
O sistema Cas9 pode ser usado para facilitar o nocaute do gene pela integração de um marcador selecionável (estratégia CRISPR/HR). Nós cotransfectamos o plasmídeo TcPFR2sgRNA/Cas9/pTREX-n com um fragmento de DNA doador que consiste em um cassete linear com o gene de resistência à blasticidina (Bsd) flanqueado por braços de homologia correspondentes a regiões de 100 pb a montante do códon de início e a jusante do alvo Cas9 local no gene TcPFR2. Após a cotransfecção, as epimastigotas foram selecionadas com neomicina e blasticidina e as células resistentes duplamente estáveis ​​foram submetidas a análises de PCR e Western blot. A ruptura do gene TcPFR2 foi verificada por PCR com iniciadores emparelhados fora das regiões de homologia no cassete de blasticidina (iniciadores 13 e 14; consulte a Tabela S1 no material suplementar), para amplificar um fragmento de nt 142 a nt 234 do TcPFR2 locus (Fig. 6A). Um fragmento de 696 pb foi amplificado a partir de gDNA isolado de um mutante nocaute de TcPFR2 (TcPFR2-KO) obtido por CRISPR/Cas9 pela estratégia de DNA doador (Fig. 6B, pista 5), ​​indicando ruptura do gene PFR2, que gera um fragmento de 376 pb no locus original (Fig. 6B, pistas 1 a 4). A análise de Western blot com MAb L13D16, que reconhece as proteínas TcPFR1 e TcPFR2 (73 e 69 kDa, respectivamente), mostrou a ausência de proteína codificada por TcPFR2 nesta linha celular mutante (Fig. 6C). Este resultado confirmou nossa observação anterior de uma diminuição significativa no nível de proteína TcPFR1 acompanhando o desaparecimento de TcPFR2, que atribuímos ao papel de TcPFR2 na montagem da estrutura da haste paraflagelar. Finalmente, o descolamento flagelar foi observado em 86% das células por microscopia de luz (Fig. 6D) sem alterações significativas no crescimento celular (Fig. 6E). As células que não exibiram descolamento flagelar mostraram flagelos anormalmente finos, enquanto uma perda de motilidade celular foi observada em toda a população. Este defeito de motilidade foi compatível com o fenótipo de afundamento celular observado para este mutante em frascos de cultura. Em conjunto, nossos resultados indicam que o sistema CRISPR/Cas9 permitiu a edição eficiente do genoma em T. cruzi, e a cotransfecção de epimastigotas com um cassete linear para recombinação de homologia melhorou a eficiência de edição ao gerar uma linhagem celular mutante onde toda a população apresenta disrupção gênica e ablação da proteína TcPFR2 envolvida na montagem da haste paraflagelar, fixação flagelar e motilidade celular.
DISCUSSÃO
O T. cruzi tem sido especialmente refratário à manipulação genética, e a implementação da tecnologia CRISPR/Cas9 neste organismo facilitará muito a análise funcional de seu genoma. Aqui relatamos o uso de plasmídeos separados ou únicos contendo sgRNA e Cas9 para promover a edição rápida e eficiente de loci genômicos de T. cruzi. Além disso, o CRISPR/Cas9 forneceu um sistema muito eficiente para inserção específica do local de um marcador selecionável por meio de recombinação homóloga e resultou em 100% de ruptura de um gene endógeno. Em trabalhos anteriores (34), a recombinação homóloga facilitada por Cas9 em T. cruzi só foi testada pela troca de um gene exógeno (o de GFP) por outro (o de tdTomato). No entanto, este método rendeu apenas 0,11 e 0,069% de taxas de troca de marcadores fluorescentes. A recombinação homóloga mediada por CRISPR/Cas9 também foi usada recentemente em Leishmania major para substituir os genes PFR2 por um cassete de resistência à puromicina (23). No entanto, nesse trabalho, foram obtidas populações de células mistas, sugerindo que a edição do genoma não foi 100% eficiente. Em contraste, nosso método de recombinação homóloga resultou em uma ruptura específica do local limpa de TcPFR2, conforme detectado por PCR e análises de Western blot. Além disso, esta linhagem celular mutante foi obtida a partir de um único evento de transfecção sem a necessidade de selecionar populações clonais, o que geralmente é demorado. Embora o trabalho anterior com cinetoplastídeos exigisse a cotransfecção de células com sgRNA transcrito in vitro e dois plasmídeos ou cotransfecção com três plasmídeos (23) para induzir a recombinação homóloga facilitada por CRISPR/Cas9, alcançamos uma edição de genoma altamente eficiente usando um único plasmídeo (sgRNA/ Cas9/pTREX-n), cotransfectando-o com um cassete de blasticidina amplificado por PCR para recombinação homóloga. Conseguimos gerar essa linhagem de células mutantes após exatamente 5 semanas de seleção, objetivo que não foi alcançado anteriormente com T. cruzi. A alta eficiência observada com este sistema é possivelmente uma consequência da expressão constitutiva de Cas9 e do sgRNA clonados juntos no vetor pTREX-n, que produz permanentemente uma quebra de DNA de fita dupla dirigida ao sítio que é posteriormente reparada por recombinação homóloga com o modelo de homologia de blasticidina. Quando o marcador selecionável é inserido em pelo menos um alelo do gene, este alelo funciona como molde para reparar qualquer outra quebra induzida por Cas9 que ocorra no segundo alelo, ou em outras cópias do gene possivelmente presentes, por um mecanismo similar ao mutagênico. reação em cadeiarecentemente descrita (45). Uma representação esquemática das estratégias desenvolvidas para edição de genoma mediada por CRISPR/Cas9 em T. cruzi é mostrada na Fig. S5 no material suplementar.
A expressão de sgRNA e Cas9 sozinho (estratégia de um ou dois vetores) resultou na edição do genoma e alterações fenotípicas visíveis em populações não clonais, mas não foi possível detectar deleções gênicas nos locais alvo do sgRNA. Mutações genéticas nos sítios alvo de sgRNA também não foram detectadas em linhagens de células clonais obtidas pela diluição limitante desses mutantes de TcPFR2, mas a análise de Southern blot desses clones revelou mudanças dramáticas sugerindo grandes deleções de TcPFR2. Deleções atribuídas à função de um sistema de reparo de quebra de fita dupla de junção de extremidade mediado por microhomologia foram previamente detectadas apenas em um gene transfectado exógeno (aquele para GFP). Não está claro por que ainda existe uma sequência do tipo selvagem com o sítio alvo intacto enquanto o locus cromossômico TcPFR2 é claramente rearranjado após a expressão do sgRNA que tem como alvo esse locus e Cas9 sozinho. Uma explicação possível é que os parasitas podem manter essa sequência do tipo selvagem em um local ou estrutura que Cas9 não pode acessar. Esta cópia do gene também não foi transcrita, conforme observado pela diminuição dos níveis de mRNA mostrado pela análise de Northern blot.
Os resultados obtidos por transfecção de sgRNA e Cas9 sozinho
são comparáveis à regulação negativa da expressão gênica que pode ser observada em T. brucei sobre RNAi. No nosso caso, a deleção dos genes TcPFR1, TcPFR2 e TcGP72 também permitiu a detecção da perda progressiva das proteínas e o aparecimento gradual dos fenótipos finais, provavelmente refletindo o lento turnover das proteínas. Conforme demonstrado pelo silenciamento de genes PFR2 em L. major, que estão presentes em tandem arrays separados, este método permite o silenciamento de famílias de genes contendo sequências homólogas, um feito que permitirá a descoberta da função de grandes famílias gênicas, como como as de trans-sialidases (1.400 genes) e mucinas (800 genes). Uma vantagem importante desta técnica é que após a seleção antibiótica inicial de epimastigotas, nem todas as células se tornaram deficientes no gene rompido. Se o gene alvo em questão for necessário para a sobrevivência da célula, esta seleção parcial resulta em apenas alguns pimastigotas mostrando uma alteração fenotípica, ou seja, descolamento flagelar no caso de TcPFR1, TcPFR2 e TcGP72, mas eles também podem exibir um defeito de crescimento no nível populacional, sugerindo um papel essencial do gene.
As rupturas dos genes PRF1 e PFR2 foram feitas antes usando formas procíclicas de T. brucei (18, 20, 21) e promastigotas de L. braziliensis (18, 22) para testar diferentes abordagens de RNAi e investigar seus papéis potenciais. Em ambos os casos, os mutantes de ruptura foram viáveis ​​e foi observada perda do bastonete paraflagelar, sugerindo que a montagem dessa estrutura depende da presença de PFR1 e PFR2. No caso dos tripanossomas da forma procíclica, uma bolha de componentes de PFR acumulados estava presente na ponta do flagelo de mutantes de RNAi, mas o flagelo permaneceu ligado ao corpo celular (21). Mutantes double-knockout de formas procíclicas não puderam ser obtidos (24), enquanto mutantes obtidos por transfecção de PFR2 antisense não foram viáveis ​​no caso das formas de corrente sanguínea (21). Relatamos aqui que a ruptura parcial de PFR1 ou PFR2 em epimastigotas de T. cruzi com o sistema CRISPR/Cas9 resulta em acúmulo de componentes de PFR na ponta dos flagelos e subsequente perda da estrutura da haste paraflagelar com desprendimento flagelar do corpo celular. As células parecem perder o flagelo no meio, e células semelhantes a epimastigotas aflageladas apareceram. As células mutantes que apresentam desprendimento flagelar apresentam motilidade celular reduzida e afundam no fundo dos frascos de cultura. Foi relatado anteriormente que nocaute de TcGP72 (e ablação de RNAi do ortólogo FLA1 em formas procíclicas de T. brucei) também resulta em descolamento flagelar do corpo celular, e confirmamos esses resultados com o sistema CRISPR/Cas9. Tanto em T. cruzi quanto em T. brucei, o descolamento flagelar afeta a motilidade dos parasitas, mas não afeta a viabilidade das células, e isso foi confirmado aqui após a ruptura de TcPFR2 por um marcador de resistência a antibióticos. Além disso, epimastigotas mutantes de T. cruzi GP72 são capazes de se diferenciar em estágios metacíclicos e infectar células de cultura de tecidos, mas não produzem tripomastigotas derivadas de cultura de tecidos, mas apenas formas redondas com flagelos curtos (microamastigotas) ou formas alongadas com flagelos emergindo do meio do célula (mesoamastigotas) que são deficientes em infectar camundongos e tiveram menor viabilidade no inseto vetor (27, 47). Também é interessante que a ruptura da montagem de PFR em T. brucei por ablação de RNAi de calmodulina localizada em PFR (48) resulta em perda da estrutura de PFR e desprendimento flagelar. Nossos resultados suportam a hipótese de que a montagem do PFR é essencial para manter a ligação flagelar ao corpo celular dos tripanossomas.
Em resumo, a ruptura gênica altamente eficiente alcançada pela recombinação homóloga induzida por CRISPR/Cas9 melhorará muito nossa capacidade de realizar a edição do genoma em T. cruzi e, como consequência, facilitará o estudo da função gênica nesse parasita.