EXAMES IMUNOLÓGICOS REALIZADOS NOS BANCOS DE SANGUE

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EXAMES IMUNOLÓGICOS REALIZADOS NOS BANCOS DE SANGUE
INTRODUÇÃO
Existem vários tipos de doação de sangue e um doador pode ajudar até três pacientes. Uma única unidade de sangue pode ser separada em diferentes componentes, como glóbulos vermelhos, plasma e plaquetas. O Sangue Total é a doação de sangue mais comum e flexível. Geralmente é coletado em um litro e usado para ajudar vários pacientes, por ser separado em componentes diferentes. O plasma é coletado por aférese, que é o processo que separa o plasma de outros componentes do sangue. Possui fatores de coagulação do sangue necessários para ajudar pacientes com traumas e aqueles que lutam contra certas doenças como o câncer.
As plaquetas também são coletadas por meio do processo de aférese. Depois que as plaquetas são selecionadas do sangue do doador, os glóbulos vermelhos e outros fluidos são devolvidos ao doador. Os pacientes com câncer são os principais destinatários das plaquetas, pois desempenham um papel vital no tratamento do câncer. A doação dupla de hemácias é a coleta apenas de hemácias por meio do processo de aférese. Ele permite que os doadores dêem o dobro de uma doação de sangue total. Pode ser usado em qualquer pessoa que sofra de perda de sangue.
Hoje, a maioria dos cuidados médicos depende de um suprimento constante de sangue de doadores, já que uma em cada sete pessoas que entram no hospital precisa de sangue. Uma quantidade adequada de sangue é necessária em todas as unidades de saúde para atender à necessidade urgente de pacientes que enfrentam traumas e outros procedimentos que salvam vidas, como transfusões de sangue - que salvam milhões de vidas a cada ano. 
Um dos primeiros métodos de doação de sangue era feito direto do braço do doador para o paciente receptor. Com o avanço da medicina foi possível o processamento do sangue, possibilitando que o paciente receba somente o hemocomponente de que necessita. Além disso, com o uso de bolsas plásticas e anticoagulantes é possível a estocagem, por prazo determinado, desses hemocomponentes. A seguir estão listados os exames imunológicos mais importantes em bancos de dados.
TIPAGEM SANGUÍNEA
A Tipagem Sanguínea é o processo de coleta e análise do sangue do paciente para identificar a qual grupo sanguíneo ele pertence. Além de facilitar na hora do atendimento, também é importantíssimo saber o tipo sanguíneo para doações de sangue, transfusões, gestação e outros atendimentos médicos. O procedimento de descoberta é rápido e indolor.
Com a amostra de sangue do paciente, o laboratório faz testes de compatibilidade em lâminas de sangue com reagentes. Assim, podemos descobrir se o paciente é tipo A, AB, B ou O. Anticorpos anti-A e anti-B são utilizados e determinam a presença ou ausência de antígenos A e B em nosso sangue.
Para este teste é necessário que os requisitos básicos:
· Boas condições de saúde;
· Ter entre 16 e 69 anos (menores de idade precisam de autorização dos pais responsáveis);
· Ter dormido pelo menos 6 horas nas últimas 24 horas;
· Estar alimentado (evitar gorduras pelo menos 4 horas anteriores);
· Não estar gestante ou amamentando;
· Não ingerir bebida alcoólica nas 12 horas anteriores;
· Não ter feito tatuagem ou piercing nos últimos 12 meses.
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
Imunofluorescência é definida como uma técnica que possibilita a visualização de antígenos nos tecidos ou em suspensões celulares, por meio da utilização de anticorpos específicos, marcados com fluorocromo, capazes de absorverem a luz ultra-violeta (UV), emitindo-a num determinado comprimento de onda, permitindo sua observação ao microscópio de fluorescência (com luz UV).
Na Imunofluorescência indireta utiliza-se este tipo de imunofluorescência, também conhecida como técnica de dupla camada, na detecção de anticorpos no soro do paciente por meio de antígenos fixados em uma lâmina, na qual se aplica primeiramente um anticorpo específico não fluorescente. Por fim, coloca-se um anticorpo fluorescente com especificidade marcada contra determinados antígenos do primeiro anticorpo usado para reagir com o antígeno.
Esta técnica tem como vantagem possibilitar uma fluorescência mais evidente, uma vez que os anticorpos fluorescentes se associam somente aos anticorpos primários, além de permite trabalhar com diversos anticorpos primários específicos para distintos tipos de antígenos, sendo capaz de identificar qual a classe à qual o anticorpo pertence.
Habitualmente, a imunofluorescência indireta é utilizada na detecção de auto-anticorpos, e também, na detecção de anticorpos anti-nucleares encontrados no soro de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico. As doenças que podem ser detectadas por este exame, são:
· Bolhosas: pênfigo, dermatite herpetiforme (IgA), doença por IgA linear (IgA), penfigóide bolhoso (IgG ou C3), herpes -gestacional (IgG e C3) e epidermólise bolhosa;
· Lupus eritematoso: estudo da banda lúpica (IgG, IgM e C3 usualmente);
· Epidermólise bolhosa: estudo do nível de clivagem com Colágeno IV, laminina e bp 180/230
· Vasculites.
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA)
O ELISA é um método no qual a reação antígeno-anticorpo é monitorada por medida da atividade enzimática. Desempenha um papel muito importante no laboratório clínico, pois, além da elevada sensibilidade comparável à do radioimunoensaio, apresenta as vantagens de utilizar reagentes estáveis, estar livre das exigências de trabalhar com radioisótopos e poder ser adaptado tanto a testes simples como a automação sofisticada. O ensaio pode ser empregado com uma variedade de sistemas de detecção, que vão de leituras visuais a fotométricas, com substratos coloridos, fluorescentes ou luminescentes, fato que tem contribuído para a multiplicação de seus métodos e aplicações nos últimos anos. 
Para ser utilizada em imunoensaio, a enzima deve preencher alguns requisitos como ser estável, facilmente obtida em forma purificada e ser facilmente conjugada a vários antígenos e anticorpos sem perda de sua atividade. Entre as enzimas, a mais empregada é a peroxidase, que além desses requisitos, pode ser conjugada por vários processos e ser revelada por várias substâncias cromogênicas.
O princípio básico da reação de ELISA é a imobilização de um dos reagentes em uma fase sólida, enquanto outro reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservação tanto da atividade enzimática como da imunológica do anticorpo. O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou anticorpos, podendo ter elevada precisão se os reagentes e os parâmetros do ensaio forem bem padronizados.
HEMAGLUTINAÇÃO
O teste de hemaglutinação baseia-se na ligação dos anticorpos treponêmicos presentes no soro com hemácias que contêm, na sua superfície, antígenos de Treponema pallidum (cepa Nichols). Os anticorpos presentes no soro ligam-se aos antígenos que estão na superfície das hemácias, resultando na hemaglutinação. 
Na reação de aglutinação indireta, os antígenos de Treponema pallidum são adsorvidos à superfície de partículas de gelatina. Os anticorpos presentes no soro ligam-se aos antígenos de várias partículas de gelatina, resultando na aglutinação. É importante que, antes de iniciar a reação, você leia atentamente as recomendações do fabricante do kit quanto à necessidade de inativar o soro, diluir a amostra com solução adsorvente ou sorbent, utilizar 2–mercaptoetanol para adsorver fator reumatoide ou outros interferentes da reação e utilizar controles com hemácias ou partículas de gelatina sem antígenos na sua superfície. 
Para evitar resultados falso-positivos, retire a eletricidade estática da placa de reação, passando uma gaze úmida embaixo da placa antes de iniciar a incubação. Além disso, incube a reação em local onde não haja vibração, para evitar que a ligação dos anticorpos às hemácias ou às partículas de gelatina seja desfeita, o que causa resultados falsonegativos.
TESTE ÁCIDO NUCLÉICO
Métodos baseados em ácido nucleico detectam sequências de DNA ou RNA específicas extraídas do microrganismo. As sequências podem ou não ser amplificadas in vitro.Métodos baseados em ácidos nucleicos são geralmente específicos e altamente sensíveis, podendo ser usados para todas as categorias de microrganismos. Os resultados podem ser obtidos rapidamente. Os médicos devem conhecer as possibilidades diagnósticas e solicitar os testes adequados, pois cada teste é específico para um organismo único. Por exemplo, se um paciente tiver sintomas sugestivos de influenza, mas a estação da influenza já tiver passado, fazer um teste diagnóstico viral geral (p. ex., cultura viral) em vez de um teste específico de gripe é melhor porque outros vírus (p. ex., parainfluenza, adenovírus) podem ser os agentes etiológicos.
Avanços recentes levaram ao desenvolvimento de ensaios multiplex, em que um único teste baseado em ácido nucleico pode detectar e diferenciar entre ≥ 2 microrganismos causadores. Ensaios multiplexados geralmente são menos sensíveis do que os ensaios qualitativos de alvo único. Também podem ser menos específicos; os resultados positivos imprevistos, sem relação com o quadro clínico do paciente, devem ser considerados com cautela. Ensaios multiplexados estão atualmente disponíveis para detecção de agentes de guerra biológica.
Os testes baseados em ácidos nucleicos são qualitativos, mas os métodos quantitativos existem para um limitado número de infecções (p. ex., HIV, citomegalovírus, vírus T-linfotrópico humano), podendo ser úteis no diagnóstico e no monitoramento da resposta ao tratamento.
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica rotineira de laboratório usada para fazer muitas cópias (milhões ou bilhões) de uma região específica do DNA. Essa região do DNA pode ser qualquer objeto de interesse do pesquisador. Por exemplo, pode haver um gene cuja função o pesquisador queira compreender ou um marcador genético usado pelos cientistas forenses para correlacionar o DNA da cena do crime com os suspeitos.
Tipicamente, o objetivo da PCR é fabricar quantidade suficiente da região de interesse do DNA, de modo que essa possa ser analisada e utilizada de alguma outra maneira. Por exemplo, DNA amplificado por PCR pode ser enviado para sequenciamento, visualizado por eletroforese em gel, ou clonado em plasmídeo para futuros experimentos.
A PCR é usada em muitas áreas da biologia e medicina, incluindo pesquisa em biologia molecular, diagnósticos médicos e mesmo alguns ramos da ecologia. Os principais fatores dessa técnica são:
· A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma técnica para fazer muitas cópias de uma região específica do DNA, in vitro (em um tubo de ensaio, ao invés de um organismo).
· A PCR depende de uma DNA polimerase termoestável, a Taq polimerase, e requer primers de DNA projetados especificamente para a região de interesse do DNA.
· Na PCR, a reação é repetida ciclicamente através de uma série de alterações de temperatura, o que possibilita a produção de muitas cópias da região de interesse.
· A PCR tem muitas aplicações práticas e em pesquisa. Ela é rotineiramente usada em clonagens de DNA, diagnósticos médicos e análises forenses de DNA.
WESTERN BLOT
O western blot (por vezes chamado imunoblot de proteínas ou transferência western) é um método em biologia molecular e bioquímica para detectar proteínas numa amostra de homogenato (células bem trituradas) de tecidos biológicos ou estratos. Essa técnica usa eletroforese em gel para separar as proteínas nativas pela sua estrutura tridimensional ou proteínas desnaturalizadas pelo comprimento da sua cadeia polipeptídica. As proteínas são então transferidas do gel para uma membrana (tipicamente de nitrocelulose ou PVDF), sendo uma técnica de blotting ou transferência. Uma vez na membrana são usados como sonda anticorpos específicos para a proteína alvo. A passagem de eletroforese em gel é incluída nas análises de western blot para resolver o problema da reatividade cruzada dos anticorpos. Como resultado, os pesquisadores podem examinar a quantidade de proteína em uma dada amostra e comparar os níveis entre diversos grupos.
O nome Western blot é um trocadilho do nome Southern blot, uma técnica para detecção de DNA desenvolvida anteriormente por Edwin Southern. Também há uma técnica chamada Northern blot que serve para a detecção de RNA.
RADIOIMUNOENSAIO 
O radioimunoensaio é um dos métodos mais sensíveis para análise quantitativa das reações antígeno-anticorpo. Tem como princípio: a quantidade de reagente marcado (Ag ou Ac) quantifica o Ag ou Ac não marcado na amostra. Pode ser competitivo ou por excesso de reagente.
Radioimunoensaio de fase sólida: Um dos reagentes é imobilizado nas cavidades de placas plásticas de micro titulação; as placas são sensibilizadas com antígeno ou anticorpo.
Radioimunoensaio direto de competição com antígeno marcado: uma quantidade fixa e limitada de anticorpo é ligada a um suporte sólido; adiciona-se uma quantidade fixa e pequena de antígeno marcado, misturada com a amostra em teste ou com as soluções padrão que contém concentrações conhecidas de um antígeno não marcado. Após um período de incubação remove-se o antígeno não ligado e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida.
Radioimunoensaio de competição com anticorpo marcado: Uma quantidade fica do antígeno é imobilizada em um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa de anticorpo marcado específico, misturada com a amostra em teste ou uma série de soluções padrão com concentrações variadas do antígeno solúvel. Após um período de incubação o anticorpo marcado que não se ligou a fase sólida e o antígeno solúvel é removido por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida.
DISTRIBUIÇÃO DAS METODOLOGIAS MAIS UTILIZADAS NOS TESTES PARA TRIAGEM LABORATORIAL DE DOENÇAS INFECCIOSAS EM DOADORES DE SANGUE
	Patologia 
	Exame
	Detecção
	Observação
	Doença de chagas
	EIA
	Anticorpo anti-T. cruzi
	EIA mais utilizado que HAI
	
	HAI
	Anticorpo anti-T. cruzi
	
	Sífilis
	EIA
	Anticorpo anti-T. pallidum
	Teste treponêmico, mais sensível que VDRL. Detecta infecção curada.
	
	VDRL
	Anticorpo anti-cardiolipina
	Teste não-treponêmico
	Infecção pelo HBV
	EIA – HBsAg
	Antígeno HBs
	
	
	EIA – anti-HBc
	Anticorpo anti-HBc
	
	Infecção pelo HCV
	EIA
	Anticorpo anti-HCV
	
	Infecção pelo
HTLV-I/II
	EIA
	Anticorpo anti-HTLV-I/II
	
	Infecção pelo HIV1/2
	EIA a
	Anticorpo anti-HIV-1/2
	
	
	EIA b
	Anticorpo anti-HIV-1/2
	Recomenda-se que EIA a e EIA b utilizem metodologias ou composição antigênica diferentes