Relatorio Final Aguas

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RELATÓRIO DE ANÁLISE DE ÁGUA
Microbiologia II
Alunos: Aline Caldeira, Gabriela Macello e Milene França
Professor: Edmir 
Nilópolis, 11 de Junho de 2018
1. Introdução 
1.1 Água 
A água é um recurso natural finito que apesar de todos os esforços para armazenar e diminuir o seu consumo, está se tornando, cada vez mais, um bem escasso cuja qualidade vem piorando devido ao aumento da população e à ausência de políticas públicas voltadas para a sua preservação. Estima-se que aproximadamente doze milhões de pessoas morrem anualmente por problemas relacionados com a qualidade da água (MERTEN e MINELLA, 2002). 
Quando se fala sobre qualidade da água, é necessário compreender que esse fator não se refere apenas a pureza da água, mas sim às características físicas, químicas e biológicas. A partir desses parâmetros, são estipulados diferentes finalidades para a água. 
De acordo com a política normativa nacional de uso da água, como consta na resolução número 20 do CONAMA (Conselho Nacional do Meio Ambiente), os corpos de água foram classificados em nove categorias, sendo cinco classes de água doce (salinidade <0,5%), duas classes salinas (salinidade superior a 30%) e duas salobras (salinidade entre 0,5 e 30%). A classe "especial" é apta para uso doméstico sem tratamento prévio, enquanto o uso doméstico da classe IV é restrito, mesmo após tratamento, devido à presença de substâncias que oferecem risco à saúde humana. A classificação padronizada dos corpos de água possibilita que se fixe metas para atingir níveis de indicadores consistentes com a classificação desejada (MERTEN e MINELLA, 2002). 
A garantia de consumo humano de água segundo padrões de potabilidade adequados é questão relevante para a saúde pública. No Brasil, a Norma de Qualidade da Água para Consumo Humano, aprovada na portaria n​o​ 1.469 de 29 de dezembro de 2000, do Ministério da Saúde, define os valores máximos permissíveis (VMP) para as características bacteriológicas, organolépticas, físicas e químicas da água potável (Brasil, 2000). De acordo com o art. 4​° dessa portaria, água potável é a água para consumo humano cujos parâmetros microbiológicos, físicos, químicos e radioativos atendam ao padrão de potabilidade e que não ofereça risco à saúde (SILVA, 2003). 
A água para consumo humano pode ser obtida de diferentes fontes. Uma dessas fontes, o manancial subterrâneo, é um recurso utilizado por ampla parcela da população brasileira. A água subterrânea pode ser captada no aquífero confinado ou artesiano, que se encontra entre duas camadas relativamente impermeáveis, o que dificulta a sua contaminação, ou ser captada no aquífero não confinado ou livre, que fica próximo à superfície, e está, portanto, mais suscetível à contaminação. Em função do baixo custo e facilidade de perfuração, a captação de água do aquífero livre, embora mais vulnerável à contaminação, é mais frequentemente utilizada no Brasil (SILVA, 2003 apud Foster, 1993). 
A água subterrânea além de ser um bem econômico, é considerada mundialmente uma fonte imprescindível de abastecimento para consumo humano, para as populações que não têm acesso à rede pública de abastecimento ou para aqueles que, tendo acesso a uma rede de abastecimento, têm o fornecimento com frequência irregular. No Brasil, o aquífero subterrâneo abastece 6.549.363 domicílios (19% do total), e, destes, 68,78% estão localizados na área rural, abrangendo 11,94% de toda a população nacional (IBGE, 1994). 
Conforme a portaria 2.914 de 2011 do Ministério da saúde (MS), art. 3° e 4°, capítulo I, toda água destinada ao consumo humano, distribuída coletivamente ou proveniente de solução alternativa individual, deve ser objeto de controle no primeiro caso e em ambos os casos sujeita à vigilância da qualidade da água. Desta forma, a água de poço artesiano ou poço aberto, utilizada para consumo humano, se enquadra no padrão de água potável da portaria 2.914 e deve atender os requisitos da portaria de acordo com o os padrões indicados na tabela 1. 
As fontes de contaminação antropogênica em águas subterrâneas são em geral diretamente associadas a despejos domésticos, industriais e ao chorume oriundo de aterros de lixo que contaminam os lençóis freáticos com microorganismos patogênicos (FREITAS E ALMEIDA, 1998). 
1.2 Legislação 
A poluição das águas traz algumas questões, entre elas as da balneabilidade, que indica a qualidade das águas destinadas à recreação de contato primário, onde a possibilidade de ingerir quantidades apreciáveis de água é elevada, e da potabilidade. De acordo com a portaria nº 518/2004 do Ministério da Saúde, denomina-se água potável aquela destinada ao consumo humano cujos parâmetros microbiológicos, físicos, químicos e radioativos atendam ao padrão e não ofereçam riscos à saúde. A portaria 2.914 de 2011 estabelece os parâmetros microbiológicos de potabilidade, como pode ser observado na tabela 1: 
Tabela 1: Padrão microbiológico para água potável.
	Tipo de água
	Parâmetro
	VMP
	
	
	(Valor máximo permitido)
	Água para consumo humano
	Escherichia coli
	Ausência em 100 mL
	
	
	
	Água na saída do tratamento
	Coliformes totais
	Ausência em 100 mL
	
	
	
	Água tratada no sistema de 
	Escherichia coli
	Ausência em 100 mL
	Distribuição
	
	
	(reservatórios e rede)
	Coliformes totais
	Sistemas ou soluções alternativas coletivas que
	
	
	abastecem menos de 20 mil habitantes. Apenas uma amostra
	
	
	entre as amostras examinadas no mês, poderá apresentar
	
	
	resultado.
	
	
	Sistemas ou soluções alternativas coletivas que
	
	
	abastecem menos de 20 mil habitantes. Ausência em 100 mL,
	
	
	em 95% das amostras examinadas em um mês.
Fonte: BRASIL, 2011.
A resolução n° 274 de 2000, do CONAMA estabelece que águas são consideradas impróprias em termos de balneabilidade quando​em mais de 20% de um conjunto de amostras coletadas nas 5 semanas anteriores, no mesmo local, os resultados das análises forem superiores a 1000 Coliformes Termotolerantes ou 800 ​Escherichia coli​ por 100 mililitros, ou quando o valor obtido na última amostragem for superior a 2500 Coliformes Termotolerantes ou 2000 ​Escherichia coli​ por 100 mililitros. 
1.3 Bactérias analisadas 
A análise bacteriológica surge como uma importante ferramenta ao reconhecimento da qualidade da água de consumo. Técnicas bacteriológicas são sensíveis e específicas ao agente patogênico investigado em qualquer instância, seja no alimento, no solo ou na água (MATTOS, 2002). 
Na análise ou monitoramento de qualidade de água são empregados indicadores biológicos específicos. Os coliformes, bastonetes gram-negativos da família Enterobacteraceae, são os indicadores biológicos mais comumente empregados ao estudo de qualidade de água (MATTOS, 2002) 
A análise do grupo coliforme é usada como indicador do grau de contaminação e qualidade sanitária da água. Ela avalia a poluição da água por fezes. A presença de coliformes na água não implica necessariamente a presença de patógenos, já que para estarem presentes na água devem ser oriundos de fezes de indivíduos ou de animais contaminados, enquanto que a presença de coliformes totais e termotolerantes dependem apenas da existência de despejo orgânico. Porém, quanto maior o número de coliformes encontrados na água, maior a probabilidade de se encontrar microrganismos patogênicos. 
As bactérias do grupo coliforme totais são bacilos gram-negativos, em forma de bastonetes, aeróbios ou anaeróbios facultativos que fermentam a lactose a 35-37 °C, produzindo ácido, gás e aldeído em um prazo de 24-48 horas. São, também, oxidase-negativos e não formam esporos. A razão da escolha desse grupo de bactérias como indicador de contaminação da água deve-se aos seguintes fatores: 
● Estão presentes nas fezes de animais de sanguequente, inclusive os seres humanos; 
● Sua presença na água possui uma relação direta com o grau de contaminação fecal; 
● São facilmente detectáveis e quantificáveis por técnicas simples e economicamente viáveis, em qualquer tipo de água; 
● Possuem maior tempo de vida na água que as bactérias patogênicas intestinais, por serem menos exigentes em termos nutricionais e incapazes de se multiplicarem no ambiente aquático; 
● São mãos resistentes à ação dos agentes desinfetantes do que os germes patogênicos (CONTIN, et al. 2012). 
A maioria das bactérias do grupo coliforme pertence aos gêneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella e Enterobacter, embora vários outros gêneros e espécies pertençam ao grupo. 
Os Coliformes termotolerantes são um subgrupo das bactérias do grupo coliforme que fermentam a lactose a 44,5 ± 0,2°C em 24 horas; tendo como principal representante a Escherichia Coli, de origem exclusivamente fecal. 
A E. Coli é uma bactéria do grupo coliforme que fermenta a lactose e manitol, com produção de ácido e gás a 44,5 ± 0,2°C em 24 horas, produz indol a partir do triptofano, oxidase negativa, não hidroliza a ureia e apresenta atividade das enzimas ß galactosidase e ß glucoronidase, sendo considerado o mais específico indicador de contaminação fecal recente e de eventual presença de organismos patogênicos. 
É comum a análise de detecção de outros microrganismos mais resistentes como por exemplo a análise de clostrídios sulfito redutores, que são bactérias de morfologia bacilar, Gram positivas, anaeróbias estritas, capazes de formar esporos e com atividade sulfito redutora. Esses microrganismos são encontrados no solo e no intestino humano e de outros animais. Sua presença em água indica contaminação fecal remota, falha no tratamento de água, podendo indicar também contaminação por solo do reservatório ou fonte contaminada por águas superficiais, além de falhas nas boas práticas de fabricação (CONTIN, et al. 2012).
1.4 Analises da Água de Poço 
Para a água de poço, foram realizadas as seguintes análises: técnica de tubos múltiplos, visando verificar a presença e quantificar, caso presentes, os coliformes totais e fecais; Técnica de contagem de heterotróficos​ pelo método de Spread-Plate​; Métodos de resultados rápidos como Caldo PA e Readycult; Método da membrana filtrante; Foram feitas provas bioquímicas, a partir do teste de tubos múltiplos; E Por fim, também avaliou-se a presença de clostrídios sulfito redutores.
1.5 Controle Positivo para Coliformes Totais 
O controle positivo ​é uma técnica que tem como objetivo validar as metodologias empregadas. Assim como na maior parte de análises realizadas em laboratórios, é importante haver o controle positivo para garantir que os reagentes e materiais que foram utilizados estão em boas condições. 
No controle positivo, ​foi inoculada a cepa padrão de ​ Klebsiella e realizado as seguintes analises: Técnica de tubos múltiplos; Métodos de resultados rápidos como Caldo PA e Readycult; Método da membrana filtrante; E provas bioquímicas, a partir do teste de tubos múltiplos. 
2. Objetivo 
 Analisar amostras de água e verificar se elas estão próprias ou impróprias para consumo humano. Caso os testes deem positivos, identificar e quantificar os microrganismos ali presentes. 
3. Amostra
Foi coletada aproximadamente 500 mL de água de poço oriunda da residência de um dos integrantes do grupo, situada em Belford Roxo. A coleta da água de poço se deu no dia 14 de maio de 2018, às 8:30h. O frasco de coleta foi previamente esterilizado, aberto apenas no momento da coleta e após coleta, colocado no gelo para transporte ate o local de analise (IFRJ). A temperatura e o pH foram verificados e o registro foi de 28° C e 6, respectivamente. 
4. Análises 
4.1 Membrana Filtrante
A análise por membrana filtrante permite a avaliação de uma alíquota de 100 mL (ou mais dependendo da norma e do microrganismo específico que se pretende identificar), fazendo com que todos os microrganismos menores que a porosidade da membrana filtrante (47 nm), sejam retidos.
O crescimento das colônias se dá a partir dos microrganismos originários que ficaram retidos na membrana. A contagem é expressa em unidades formadoras de colônia (UFC) por 100mL de amostra (ou mais, quando for o caso) e é realmente quantitativa, pois informa quantos microrganismos realmente havia na alíquota amostrada.
Essas colônias podem depois serem replicadas e analisadas em meios adequados para identificação e confirmação da presença de microrganismos específicos, como E. coli e Pseudomonas aeruginosas.
Procedimento
a) com a pinça, colocou-se cuidadosamente na placa de Petri um cartão absorvente;
b) com pipeta esterilizada colocou-se 1,8 mL do meio de cultura no cartão absorvente e tampou-se a placa; 
c) colocou-se a membrana filtrante no porta-filtro, com a pinça previamente flambada e fria; 
d) agitou-se o frasco contendo a amostra, pelo menos 25 vezes; 
e) destampou-se e flambou-se a boca do frasco; 
f) verteu-se, cuidadosamente, 100 mL de amostra no porta- -filtro, evitando que a água respingassem sobre as bordas superiores; 
g) ligou-se a bomba de vácuo (seringa) e fez-se a sucção;
 h) depois de filtrada a amostra, lavou-se 3 vezes as paredes do funil com água de diluição estéril com porções de 20 mL aplicando vácuo; 
i) após a lavagem e filtração, aliviou-se o vácuo e removeu-se o funil do suporte; 
j) com a pinça flambada e fria, removeu-se o filtro do suporte e colocou-se na placa de Petri, antes preparada, com o lado quadriculado para cima;
k) tampou-se a placa de Petri e a mesma foi incubada invertida a 36°C durante 24 horas; 
l) após o período de incubação, examinou-se o filtro fazendo a contagem das colônias. 
Leitura dos resultados 
As colônias indicativas de coliformes totais típicas têm uma cor rosa a vermelho escuro, com brilho metálico. O brilho pode aparecer no centro ou na periferia da colônia. As não coliformes aparecem com coloração vermelho-clara ou escura sem o brilho metálico característico. As colônias indicativas da E. coli aparecem na cor azul-violeta.
Resultados e Discussão 
a) Água de poço 
Para analise da água de poço foram utilizados placas contendo o meio cetrimide, o meio chromocult e o meio manitol. 
Os seguintes resultados foram observados: 
· Meio Cetrimide: Houve um crescimento tardio de uma colônia isolada não característica de Pseudomonas aeruginosas. Foi entao repicado para um meio AN para avaliar a colônia. Assim, o teste para Pseudomonas deu negativo. 
· Meio Chromocult: Houve um crescimento tardio de algum microorganismo. Assim, o teste deu negativo para coliformes fecais. Foi repicado para um meio EMB e AN, pois havia possibilidade de o microorganismo que cresceu ser um coliforme total. 
· Meio Manitol: Houve um crescimento tardio de algum microorganismo. Foi entao repicado para um meio AN para avaliar o microorganismo. Assim, o teste deu negativo. 
Era esperado que todas as placas obtivessem um resultado negativo por ser água de poço, porém, após repicado observou-se que as colônias que cresceram apresentaram lactose positivo no EMB e que eram muito parecidas com as bactérias crescidas da placa de EMB do controle positivo, confirmando a possibilidade da bactéria presente na água de poço ser a Klebsiella. 
Figura 1: a letra A representa o meio EMB do controle positivo usado de comparativo com o meio EMB da água de poço, letra b.
b) Controle Positivo 
Para o controle positivo foi utilizado apenas a placa contendo o meio chromocult. O seguinte resultado foi observado: com 24 horas não houve crescimento na placa. Porem, com 48 horas houve o crescimento de bactérias de cor avermelhada o que é característica de bactérias de coliformes totais. Assim, o teste deu positivo. 
Era esperado que houvesse crescimento de colônias vermelhas na placa, levando em conta que era uma analise de controle positivo, onde há umaconcentração grande da bactéria.
Figura 2: Meio Chromocult positivo do controle positivo para coliformes totais.
4.2 Tubos Multiplos 
A técnica para coliformes fecais e totais dos tubos múltiplos analisa a capacidade do microrganismo em fermentar a lactose, produzindo colônias típicas, gás ou ácido e gás. O método necessita de testes confirmativos e não isola as espécies, detectando apenas a presença e enumerando os coliformes totais e termotolerantes ou coliformes fecais. Alguns exemplos de microrganismos são: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus, Clostridium perfringens e Staphylococcus aureus.
A técnica dos tubos múltiplos é um método quantitativo que antecede o método do Número Mais Provável de microrganismos pela distribuição de alíquotas em séries de tubos contendo o meio de cultura diferenciado para o microrganismo alvo. A precisão do método está relacionada com a quantidade de tubos utilizados por série, que podem ser 3 ou 5.
Para a contagem presuntiva de coliformes por esta técnica o meio de cultivo é o caldo Lauril Sulfato Triptose (LS), que permite um enriquecimento seletivo de coliformes, recuperando as células injuriadas. O crescimento com produção de gás nos tubos de Durhan indica positividade.
Para a confirmação dos coliformes totais o meio de cultivo utilizado é o caldo Verde Bile Brilhante, que apresenta em sua formulação sais biliares, que inibem o crescimento de microrganismos Gram positivos, e a lactose, que é utilizada como substrato para a produção de gás pelos coliformes. A positividade neste teste é indicada pelo crescimento com produção de gás no tubos de Durhan.
Para a confirmação de coliformes termotolerantes o meio de cultivo é o caldo EC (Escherechia coli), que é seletivo para os microrganismos Gram negativos devido à presença de sais biliares. A incubação à temperatura de 45 °C em banho maria por 24 horas permite evidenciar a presença de coliformes termotolerantes uma vez que eles apresentam a capacidade de fermentar lactose com produção de gás à temperaturas mais elevadas. 
São considerados coliformes microrganismos que, por esta técnica, sejam capazes de fermentar lactose nos testes presuntivos e confirmativos, com produção de gás a 35 °C e a 45 °C.
Número mais provável
O método do NMP permite calcular o número de um microrganismo específico numa amostra de água, utilizando tabelas de probabilidade.
Diluições decimais da amostra são inoculadas em séries de tubos contendo meio líquido seletivo. Os tubos são positivos quando têm crescimento e/ou produção de gás de fermentação. A densidade bacteriana é determinada pela combinação de resultados positivos e negativos numa tabela designada por tabela do NMP, conforme a tabela 2.
Cálculo do valor do NMP
· O cálculo da densidade de bactérias do grupo testado é baseado no número de tubos positivos de cada diluição, no Teste Confirmativo.
· O resultado é dado com limite de 95% de confiança, onde:
· São necessárias 3 diluições para formular o código que permite a leitura na tabela do NMP. 
· O número de código tem 3 dígitos, sendo cada um, o número total de tubos positivos em cada diluição e por ordem decrescente de volume de inóculo.
· Quando as séries de diluições decimais são diferentes de 10, 1 e 0.1ml de amostra (diluições para as quais a tabela está elaborada), o valor do NMP é calculado pela fórmula:
NMP= NMP da tabela x (10/ maior quantidade testada)
Tabela 2: Tabela dos padrões microbiológicos de probabilidade vigente para diluições de 10, 1 e 0,1 mL.
Procedimento
I. Teste presuntivo 
a) tomou-se uma bateria contendo 9 tubos de ensaio distribuídos de 3 em 3;
 b) nos primeiros 3 tubos, (os que contêm caldo lactosado de concentração dupla) inoculou-se, com pipeta esterilizada, 10 mL da amostra de água a ser examinada, em cada tubo. (Diluição 1:1); 
c) nos 6 tubos restantes (os que contêm caldo lactosado de concentração simples), inoculou-se nos 3 primeiros 1 mL da amostra (Diluição 1:10) e nos 3 últimos tubos, inoculou-se 0,1 mL da amostra, em cada tubo. (Diluição 1:100). 
 d) misturou-se;
 e) foram incubados a 36 °C durante 48 horas; 
f) se no final de 48 horas, houver a formação de gás dentro do tubo de Durhan, significa que o teste presuntivo foi positivo. Neste caso, fazer o teste confirmativo. 
II. Teste confirmativo 
a) tomou-se o número de tubos do teste presuntivo que deram Positivos (formação de gás) nas 3 diluições 1:1; 1:10 e 1:100; 
b) tomou-se igual número de tubos contendo o meio de cultura verde brilhante Bile a 2%; 
c) com a alça de platina, previamente flambada e fria, foi retirado de cada tubo positivo uma porção de amostra e inoculou-se no tubo correspondente contendo o meio verde brilhante. Esse procedimento chama-se repicagem;
 d) identificou-se os tubos; 
e) foram incubados durante 24 horas a 36 °C; 
f) se no final do período de 24 horas houver a formação de gás dentro do tubo de Durhan o teste é considerado positivo. 
III. Verificação de Coliforme Fecal
a) tomou-se o número de tubos do teste presuntivo que deram Positivos (formação de gás) nas 3 diluições 1:1; 1:10 e 1:100; 
b) tomou-se igual número de tubos contendo o meio de cultura EC.
c) com a alça de platina, previamente flambada e fria, foi retirado de cada tubo positivo uma porção de amostra e inoculou-se no tubo correspondente contendo o meio verde brilhante. Esse procedimento chama-se repicagem;
 d) identificou-se os tubos; 
e) foram incubados durante 24 horas a 44,5 °C; 
f) se no final do período houver a formação de gás dentro do tubo de Durhan o teste é considerado positivo. 
Após todos os testes, passa-se do meio liquido para o meio solido. Desta frma, escolhe-se um tubo positivo de cada concentração e por meio do método de esgotamento transfere-se para um meio seletivo EMB e um meio NA. 
Resultados e Discussão 
a) Água de poço 
Como pode ser observado, na primeira etapa de inoculação do teste presuntivo utilizando o caldo LS, após 48 horas de incubação à 36 °C, apenas um tubo da diluição 1:100 o meio ficou turvo apresentando a formação de gás dentro do tubo de Durhan, indicando resultado positivo. Para todos os outros tubos inoculados o teste deu negativo.
Desta maneira, apenas esse tubo seguiu para a etapa seguinte, sendo repicado para o meio de cultura verde brilhante bile a 2%.
No teste confirmativo para coliformes totais utilizando o caldo verde brilhante bile a 2%, o tubo repicado apresentou resultado positivo após 24 horas de incubação a 36 °C. O tubo se tornou turvo e apresentou formação de gás dentro do tubo de Durhan, indicando desta forma a presença de coliformes totais na amostra analisada.
Na verificação de coliformes fecais, após 24 horas de incubação em banho-maria a 44,5 °C, apresentou resultado negativo, o que pode ser explicado pela ausência ou baixa concentração deste tipo de bactéria, sendo confirmado, a ausência ou não, pelas provas bioquímicas.
Após passar para o meio EMB e AN, foi incubado por 24 horas a 36 °C. Após esse tempo, houve o crescimento de colônias pretas-azuladas. Com a interpretação do resultado, além dos testes presuntivos e confirmativos, pode se concluir que na amostra de água poço analisada há presença de coliforme total, uma vez que as mesmas formam colônias com estas características.
b) Controle Positivo 
Como pode ser observado, na primeira etapa de inoculação do teste presuntivo utilizando o caldo LS, após 24 horas de incubação à 36 °C, apenas 4 tubos deram positivo. Após 48 horas de incubação, os outros 5 tubos apresentaram resultado positivo. Assim, houve resultado positivo para todos os tubos inoculados com as respectivas concentrações 1:1, 1:10 e 1:100. O indicativo de resultado positivo foi a turbidez do tudo e a formação de gás dentro do tubo de Durhan. 
Desta maneira, seguiu-se para a etapa seguinte, onde todos os tubos foram repicados para o meio de cultura verde brilhante bile a 2%.
No teste confirmativo para coliformes totais utilizando o caldo verde brilhante bile a 2%, foi positivo em todas as concentrações inoculadas (0,1, 1,0 e 10 mLde amostra), pois após 24 horas de incubação a 36 °C, os tubos se tornaram turvos e apresentaram a formação de gás dentro do tubo de Durhan, indicando desta forma a presença de coliformes totais na amostra analisada. 
Na verificação de coliformes fecais, após 24 horas de incubação em banho-maria a 44,5 °C, todos os tubos repicados, ou seja todas as concentrações, apresentaram resultado negativo, como era esperado, uma vez que no controle positivo de coliforme total só apresentava a bactéria klebisiella, a qual não sobrevive nesta temperatura. 
Após passar para o meio EMB e AN, foi incubado por 24 horas a 36 °C. Após esse tempo, houve o crescimento de colônias pretas-azuladas. Com a interpretação do resultado, pode-se comparar com o resultado obtido na água de poço.
4.3 Contagem de Heterotróficos pelo método Spread-Plate
A contagem de bactérias heterotróficas é amplamente utilizada como indicador da qualidade da água potável, sendo que os microrganismos são detectados por propagação em meios não-seletivos. A contagem de bactérias heterotróficas, genericamente definidas como microrganismos que requerem carbono orgânico como fonte de nutrientes, fornece informações sobre a qualidade bacteriológica da água de uma forma ampla. O teste inclui a detecção de bactérias ou esporos de bactérias, sejam de origem fecal, componentes da flora natural da água ou resultantes da formação de biofilmes no sistema de distribuição, servindo, portanto, de indicador auxiliar da qualidade da água
As duas metodologias mais utilizadas para contagem de bactérias em placas são: o método de esgotamento em placa e o método “Spread Plate”. A metodologia de Spread Plate consiste em espalhar o material (suspensão de células) com auxílio de uma alça de Drigalski (para obtenção de colônias após diluição), fazendo a semeadura por toda a superfície da placa de petri. Deve-se ter o cuidado de garantir que toda a superfície da placa seja semeada, evitando regiões sem semeadura
Procedimento
a) Fazer a diluição (10-1 a 10-8) em tubos contendo solução salina a 0,9%
b) Semear 1 mL das amostras nas diluições 10-6, 10-7 e 10-8, em triplicata, na placa contendo meio PCA	
c) Incubar por 24/48 horas a 36 °C
d) fazer a contagem das colônias com o auxílio de um contador de colônias.
Resultados e Discussão 
a) Água de poço
O ideal é que cada placa escolhida para contagem contenha um número considerado significativo no método em questão, o que para bactérias em geral seria de 30 a 300 colônias. 
Após 48 horas de incubação, foi feita a contagem de colônias em cada placa. Nas placas da diluição 10-6 foram encontradas: 02 colônias na primeira placa, 20 colônias na segunda placa e 01 colônia na terceira placa. Nas placas da diluição 10-7 foram encontradas: 25 colônias na primeira placa, 02 colônias na segunda placa e nenhuma colônia na terceira placa. Nas placas da diluição 10-8 foram encontradas: nenhuma colônia na primeira placa, 01 colônia na segunda placa e 02 colônias na terceira placa. 
Como nosso resultado foi muito baixo, não sendo representativo, não foi necessário calcular o UFC por mL de cada diluição. A portaria determina que na contagem não se deva ter quantidade maior que 500 unidades formadoras de colônias por ml de amostra. Acima disso a água está fora dos padrões de potabilidade.
4.4 Caldo PA
Trata-se de um teste de Presença ou Ausência para Coliformes Totais. Os coliformes totais e fecais são os microrganismos mais abundantes como contaminantes ambientais e possuem várias técnicas de identificação e meios de cultura seletivos e diferenciais. 
As colônias indicativas de Coliformes Totais típicas têm uma cor rosa a vermelho escuro, com brilho metálico. O brilho pode aparecer no centro ou na periferia da colônia. As não coliformes aparecem com coloração vermelho-clara ou escura sem o brilho metálico característico.
Através disso, é possível verificar a presença de coliformes fecais e totais em amostras de água pelo teste P/A. Esse método se baseia na produção de gás que é percebido no balão volumétrico e pela mudança de cor, de púrpura para amarelo.
Procedimento
a) Coletar a amostra em um frasco estéril ou saco de coleta;
b) Adicione 150 mL da amostra de água e agitar levemente;
c) Incubar a 35,0° C, ± 0,5º C, durante 18-48 horas.
Resultados e Discussão
a) Água de poço
Não houve alteração de cor e não foi possível visualizar a formação de gases. Porém, o meio ficou turvo o que pode-se considerar positivo. A não alteração de cor pode-se explicar devido ao meio estar fora de validade. 
b) Controle Positivo 
Não houve alteração de cor e não foi possível visualizar a formação de gases. Porém, o meio ficou turvo o que pode-se considerar positivo. A não alteração de cor pode-se explicar devido ao meio estar fora de validade.
4.5 Teste específico para Clostridium Sulfito Redutor
O teste tem como objetivo analisar a presença da espécie Clostridium perfringens em amostra de água de poço.
O Clostridium perfringens é uma bactéria anaeróbia, Gram-positiva, com forma de bastonete, esporogênica, sulfito redutora e pertencente à família Bacillaceae. Apresentam uma taxa específica de crescimento máxima em ambientes com valores de pH entre 6,0 e 7,0. É comum no trato intestinal do homem e de outros animais de sangue quente, e encontra-se largamente distribuído na natureza, principalmente no solo e em águas contaminadas com fezes.
O C. perfringens possui um potencial patogênico, em razão de produzir toxinas que causam diarreia e dores abdominais, sendo estes sintomas mais severos em crianças, em idosos e em indivíduos imunodeprimidos. De acordo com o tipo de toxina que produzem, são classificados 5 tipos de C. perfringens: A, B, C, D e E. Sendo o do tipo A o maior causador de contaminações e em menor escala o do tipo C. 
O Ágar Triptose Sulfito Cicloserina (TSC) possui em sua formulação os ingredientes peptona de carne, peptona de soja e extrato de levedura que fornecem nutrientes essenciais e vitaminas para o desenvolvimento da C. perfringens. Além destes compostos, há também dissulfito de sódio e o citrato férrico de amônio, onde, caso na amostra haja bactérias da espécie C. perfringens H2S-positivas ou redutoras de sulfito, as mesmas reduzem o sulfito presente e formam um precipitado preto com o citrato férrico de amônio, permitindo a visualização de sulfureto de hidrogênio, que produz colônias pretas no meio. 
Procedimento
a) O ágar TSC já preparado e esterilizado foi aquecido e fundido em banho maria a 50 °C.
b) Simultaneamente a amostra de água foi aquecida a 75 °C por 15 minutos com a finalidade de eliminar qualquer outro microrganismo e restar apenas possíveis esporos de C. perfringens.
c) Após o aquecimento foram colocados em um tubo Falcon de 50 mL, 20 mL de amostra e por cima da amostra 20 mL do meio TSC fundido.
d) Decorrido todo o processo, o meio inoculado foi incubado em estufa bacteriológica a 35 °C por 5 dias.
e) Posteriormente o resultado foi observado.
Resultados e Discussão
A ausência de precipitado preto indica que não há bactérias redutoras de sulfito, portanto, o resultado do teste foi negativo, como pode ser visto na figura abaixo.
Figura 3 - Teste para clostrídio sulfito redutor: negativo
4.6 Meio rápido enzimático Readycult
 Os métodos enzimáticos de substrato definido para análise de coliformes por ensaio cromofluorogênico surgiram como alternativa para testes de coliformes em água, e pouco a pouco estão se tornando a metodologia mais utilizada quando se pretende avaliar apenas presença/ausência de coliformes. Oferecem resultados simultâneos, e sob a mesma temperatura, para coliformes totais e termotolerantes em apenas 24 horas (até 2 dias a menos que o método tradicional completo), com a mínima manipulação e procedimentos no laboratório. São fornecidos como “ampolas quebráveis” prontas (já estéreis) para dissolução na amostra, a qual posteriormente é incubada em temperatura de 35-37ºC. Permitem a análise concomitante da presença de E. coli devido a reação enzimática entre o substrato MUG (4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide)e a enzima β-glucuronidase, indicadora para presença de E. coli, que confere fluorescência à amostra sob luz ultravioleta no comprimento de onda de 360 nm.
 O ReadyCult da Merck tem na composição o X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) que reage com a enzima gerando bromo-cloro-indigo, com uma coloração verde-azulada marcante. Este último ainda permite a reação com 2,5mL de reagente de Kovac’s (prova positiva de indol), que produz um halo rosa-avermelhado para confirmação da presença de E. coli. 
Procedimento
Em 100 mL da água do poço presente em frasco, foi vertido o blister contendo o Readycult da Merck. A coloração da solução se tornou amarela conforme a figura 13. O meio foi incubado a 36°C e após 24h o resultado foi observado.
Resultados e Discussão
a) Água de poço
O resultado observado após 24h foi a mudança de coloração do meio de amarelo a verde-azulado, indicando a presença de coliforme totais na amostra. Para a verificação de coliforme fecal, foi levado a uma câmara com luz UV e observado sua fluorescência, o qual não teve alteração, comprovando assim a ausência de coliformes fecais (E. coli).
b) Controle Positivo 
Houve mudança de coloração do meio para verde-azulado, o que demonstra a presenca de coliforme total, mas quando levado a fluorescência não apresentou alteração, indicando a ausência de coliforme fecal. 
4.7 Provas Bioquímicas
I. Fermentação de carboidratos
A fermentação de carboidratos é amplamente utilizada para a diferenciação de gêneros e identificação de espécies bacterianas. Este teste tem com princípio determinar a habilidade de um organismo em fermentar (degradar) um carboidrato específico incorporado em um meio básico produzindo ácido ou ácido com gás.
Os carboidratos são classificados como: (1) monossacarídeos, poli-hidroxialdeídos ou cetonas; (2) polissacarídeos ou oligossacarídeos; (3) álcoois poliídricos. O monossacarídeo ou açúcar simples é usualmente composto de 1 a 6 carbonos: ribose, xilose, glicose. Os dissacarídeos são polissacarídeos compostos de duas unidades de monossacarídeos: sacarose e a lactose.
A fermentação é um processo metabólico de oxirredução anaeróbico onde um substrato orgânico serve como um aceptor final de hidrogênio (aceptor de elétron), no lugar do oxigênio. As bactérias fermentadoras normalmente são anaeróbicas facultativas. Através do processo de fermentação, um carboidrato é degradado em duas moléculas de três átomos de carbono, que serão metabolizadas em compostos menores. O produto final é um ácido que varia de acordo com a espécie bacteriana. No teste de utilização dos carboidratos, ao meio básico é incorporado um indicador de pH (vermelho de fenol) que irá sofrer alteração de cor com a presença de ácidos. A partir da glicose podemos observar também a produção ou não de gás (CO2, H2) no interior do tubo de Durhan. 
A prova positiva é indicada pela viragem da cor do meio de incolor com Indicador de Andrade ou púrpura com púrpura de bromocresol, para vermelho ou amarelo, respectivamente, devido a produção de ácidos, com abaixamento do pH do meio. Além disso, se a bactéria possuir o sistema enzimático hidrogênio-fórmico-liase, o ácido fórmico é transformado em C0² e Hidrogênio, os quais são coletados pelo tubo de Durham, expulsando o meio e ficando a extremidade superior desse tubo transparente, cheia dos gases citados. A prova negativa é revelada pela ausência de mudança de cor ou até mesmo pela acentuação da cor púrpura quando o reativo é a púrpura de bromocresol, indicando utilização dos aminoácidos, com alcalinização do meio. Enterobactérias produzem ácido e gás da glicose (exceto Shigella, que só produz ácido). As pseudomonas não fermentam carboidratos. Algumas vezes é necessário verificar se a bactéria produz vários ácidos (fermentação ácido mista), comum para E. coli, através do teste chamado de vermelho de metila (VM) ou se apresenta fermentação butileno-glicólica revelada pela detecção de acetoína através do teste conhecido como VP ou Voges-Proskauer, comum em Enterobacter, mas não em E.coli, permitindo diferenciar essas bactérias muito parecidas biológica e bioquímicamente.
Procedimento
Em manobra asséptica, com a alça de inoculação, retirar em torno de 4 colônias de bactérias e inocular diretamente nos tubos com os meios (não havendo necessidade de esterilizar a alça e coletar colônias para cada tubo), seguindo essa ordem: sacarose, glicose, lactose, frutose, xilose e manitol. Os meios são incubados a 35 ± 2°C por 24-48 horas e, posteriormente, analisado quanto a mudança de cor do meio e produção de gás. 
Interpretação dos resultados
· Cor original do meio: púrpura (para indicador púrpura de bromocresol, que é púrpura) ou amarelo (para indicador de Andrade, que é incolor)
· Positivo: Crescimento bacteriano (turvação do meio) com viragem do indicador para amarelo ou vermelho;
· Negativo: Ausência de crescimento. O meio permanece com a cor original, púrpura ou amarelo e sem turvação.
Resultados e Discussão
a) Água de poço
i. Sacarose
Houve alteração de cor no meio indicando que o resultado deu positivo.
Figura 4 - Comparação entre o meio não inoculado (esquerda) e o meio inoculado dando resultado positivo (direita) – sacarose (amostra: água de poço)
ii. Glicose
Como pode ser observado abaixo, o teste deu resultado positivo, pois ocorreu a produção de gás, alem da mudança na coloração. Conclui-se então que existem microrganismos entéricos fermentadores de carboidrato, podendo ser Escherichia coli, Enterobacter aerogenes e Klebisiella pneumoniae.
Figura 5 - Comparação entre o meio não inoculado (esquerda) e o meio inoculado dando resultado positivo (direita) – glicose (amostra: água de poço)
iii. Lactose
Notou-se a presença de bolhas dentro do tubo de Durhan e a mudança de coloração do meio. Através destes resultados, conclui-se que a bactéria inoculada é fermentadora de lactose com produção de gás, o que aponta mais uma vez para a possível presença de coliformes, sendo esta uma característica comum deste grupo de bactérias.
Figura 6 - Comparação entre o meio não inoculado (esquerda) e o meio inoculado dando resultado positivo (direita) – lactose (amostra: água de poço)
iv. Frutose
Houve alteração na cor do meio, indicando que o teste deu positivo, ou seja, a bactéria é fermentadora de frutose.
Figura 7 - comparação entre o meio não inoculado (esquerda) e o meio inoculado dando resultado positivo (direira) - Frutose (amostra: água de poço)
v. Xilose
Houve mudança na coloração do meio, também indicando resultado positivo do teste.
Figura 8 - comparação entre o meio não inoculado (esquerda) e o meio inoculado dando resultado positivo (direira) - Xilose (amostra: água de poço)
vi. Manitol
A viragem de cor indica que o teste é positivo, ou seja, a bactéria fermenta o manitol, o que significa que apresenta as enzimas quinase, desidrogenase e mutase.
Figura 9 - comparação entre o meio não inoculado (esquerda) e o meio inoculado positivo (direita) – Manitol (amostra: água de poço)
b) Controle Positivo
i. Sacarose
Houve alteração de cor no meio indicando que o resultado deu positivo.
Figura 10 - Comparação entre o meio não inoculado (esquerda) e o meio inoculado dando resultado positivo (direita) – sacarose (amostra: controle positivo)
ii. Glicose
Como pode ser observado abaixo, o teste deu resultado positivo, pois ocorreu a produção de gás, alem da mudança na coloração. Conclui-se então que existem a Klebisiella pneumoniae.
Figura 11 - Comparação entre o meio não inoculado (esquerda) e o meio inoculado dando resultado positivo (direita) – glicose (amostra: controle positivo)
iii. Lactose
Notou-se a presença de bolhas dentro do tubo de Durhan e a mudança de coloração do meio. Através destes resultados, conclui-se que a bactéria inoculada é fermentadora de lactose com produção de gás, o que aponta mais uma vez para a possível presença de coliformes, sendo esta uma característica comum deste grupo de bactéria.
Figura 12 - Comparação entre o meio não inoculado (esquerda) e o meio inoculado dando resultadopositivo (direita) – lactose (amostra: controle positivo)
iv. Frutose
Houve alteração na cor do meio, indicando que o teste deu positivo, ou seja, a bactéria é fermentadora de frutose.
Figura 13 - comparação entre o meio não inoculado (esquerda) e o meio inoculado dando resultado positivo (direita) - Frutose (amostra: controle positivo)
v. Xilose
Houve mudança na coloração do meio, também indicando resultado positivo do teste.
Figura 14 - comparação entre o meio não inoculado (esquerda) e o meio inoculado dando resultado positivo (direira) - Xilose (amostra: controle positivo)
vi. Manitol
A viragem de cor indica que o teste é positivo, ou seja, a bactéria fermenta o manitol, o que significa que apresenta as enzimas quinase, desidrogenase e mutase.
Figura 15 - comparação entre o meio não inoculado (esquerda) e o meio inoculado positivo (direita) – Manitol (amostra: controle positivo)
II. Citrato
Em algumas bactérias a energia pode ser gerada pela utilização do citrato como única fonte de carbono. Através do ciclo dos ácidos tricarboxílicos, observa-se que o citrato é uma molécula orgânica produzida pela combinação do acetil-CoA e o oxaloacetato, fazendo com que, desta forma, a molécula de acetil-CoA possa entrar no ciclo. Sendo assim, o citrato pode e serve como uma molécula doadora de energia, que pode ser utilizada pelas bactérias produtoras da enzima citrase, como, por exemplo, Enterobacteraerogenes e Salmonella typhimurium. A utilização do citrato ocorre se nenhum carboidrato fermentável estiver presente. O processo catabólico do citrado pode ser observado na Figura 16
Figura 16 - metabolismo do citrato em organismos citrato-positivos.
Para realização deste teste, o meio mais comumente utilizado é o ágar citrato de Simmon, no qual o citrato de sódio é a única fonte de carbono e o íon amônio, a única fonte de hidrogênio. O azul de bromotimol é incluído como indicador de pH. O meio é preparado a um pH igual a 6,9, no qual a coloração do meio é verde. Em pH maiores que 7,6 o azul de bromotimol modifica a coloração do meio para um azul bem intenso.
Do momento que a utilização do citrato é um meio aeróbico, o meio utilizado deve ser inclinado em tubo, no intuito de aumentar a superfície de contato do meio com o ar.
Procedimento
O material foi inoculado através de pequenas estrias na superfície do ágar no tubo, utilizando-se uma alça de platina estéril. O meio foi então encubado por 36°C por 24/48h antes da leitura dos resultados. 
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Resultados e Discussão
a) Água de poço
A utilização do citrato como fonte de energia gera nos passos finais da reação uma grande quantidade de CO2. Este gás em excesso pode reagir com Na+ e H2O do meio, produzindo compostos alcalinos com Na2CO3. Isto faz com que o pH do meio se torne alcalino, ocasionando a viragem do indicador para azul, o que é considerado um resultado positivo para a prova do citrato. Pode-se observar a mudança de cor do meio, obtendo-se um resultado positivo.
Figura 17 - comparação entre o meio citrato não inoculado e o meio inoculado com resultado positivo (amostra: água de poço)
b) Controle Positivo
Pode-se observar a mudança de cor do meio, obtendo-se um resultado positivo.
Figura 18 - comparação entre o meio citrato não inoculado e o meio inoculado com resultado positivo (amostra: controle positivo)
III. Redução do nitrato
Teste utilizado para detectar a habilidade de um microrganismo para reduzir nitrato a nitrito ou outro composto nitrogenado, como o nitrogênio molecular (N₂), utilizando-se a enzima nitrogênio redutase.
 Os materiais utilizados são: Meio contendo extrato de carne, peptona e nitrato de potássio; Reagente revelador I (Solução acética de ácido sulfanílico), Reagente revelador II (Solução acética de α-naftilamina); Alça de metal.
 O teste se baseia na capacidade de reduzir nitrato a diferentes compostos através de dois processos metabólicos: respiração anaeróbica e desnitrificação. Na respiração anaeróbica, o organismo usa o nitrato como aceptor final de elétrons na cadeia respiratória, produzindo nitrito, amônia, nitrogênio molecular, óxido nítrico ou outro composto nitrogenado reduzido.
O Procedimento é simples. A amostra é isolada no meio previamente preparado e incubado para posterior análise.
 Se o microrganismo possuir a enzima nitrato redutase, o mesmo irá reduzir o nitrato a nitrito, onde também há a formação de ácido nitroso. Com a formação de ácido nitroso, ele reage com os reagentes reveladores I e II produzindo o p-sulfobenzeno-azo-α-naftilamina, que possui coloração vermelho intensa. Se não houver a enzima, o meio permanecerá com a cor inicial.
Procedimento
Em manobra asséptica, inoculou-se o tubo contendo o meio próprio para o teste de redução de nitrato a partir de uma colônia isolada. O tubo foi incubado por 36°C por 24/48h.
Resultados e Discussão
a) Água de poço
Houve mudança na coloração do meio para um vermelho intenso quando os reagentes reveladores foram adicionados, indicando assim, que a bactéria possui a enzima nitrato redutase, capaz de reduzir o nitrato.
b) Controle positivo
Houve mudança na coloração do meio para um vermelho intenso quando os reagentes reveladores foram adicionados, indicando assim, que a bactéria possui a enzima nitrato redutase, capaz de reduzir o nitrato.
IV. Indol
O teste do indol é utilizado para caracterizar e/ou identificar bactérias entéricas, que são capazes de produzir indol a partir do aminoácido triptofano através da ação da enzima triptofanase.
O triptofano pode ser convertido, pelas bactérias possuidoras da enzima triptofanase, a indol, amônia (por desaminação) e ácido pirúvico como produtos finais da reação, como mostra a figura. O ácido pirúvico pode então gerar energia através do ciclo de Krebs ou, então, entrar na via glicolítica e ser usado para sintetizar outros componentes importantes e necessários para a célula. A amônia gerada pode ser utilizada na síntese de aminoácidos, e o outro metabólito final gerado, o indol, pode ser identificado por esse teste. Desta forma, a triptofanase diferencia as bactérias entéricas que são indol-positivas, como Escherichia coli e Proteusvulgaris, das bactérias entéricas indol-negativas, como Serratiamarcescens e Enterobacteraerogenes.
Ficgura 19 - Catabolismo do triptofano em organismos indol-positivos.
Procedimento
Uma colônia isolada foi inoculada em um tubo contendo o meio SIM com uma agulha de inoculação estéril. O tubo foi incubado por 36°C por 24/48h. Após incubação, foi adicionado 3-5 gotas do reagente de Kovacs na superfície do ágar para a revelação do teste.
Resultados e Discussão
c) Água de poço
O reagente de Kovacs contendo HCl e o dimetilaminobenzaldeído dissolvido no amil álcool reagem com o indol produzido pelos microorganismos indol-positivos, produzindo uma coloração róseo avermelhada, ao contrário, o resultado é dado como negativo.
Não houve alteração de cor do meio ao pingar o reagente, o que significa que o teste deu negativo. 
O meio SIM, alem de ser utilizado no teste o indol, e utilizado na Prova da produção de gás sulfídrico, o qual deu resultado negativo e motilidade, o qual permaneceu imóvel. 
Figura 20 - comparação entre o meio SIM não inoculado (esquerda) e o meio inoculado, porém, apresentando resultado negativo (direita) (amostra: água de poço)
d) Controle Positivo
O reagente de Kovacs contendo HCl e o dimetilaminobenzaldeído dissolvido no amil álcool reagem com o indol produzido pelos microorganismos indol-positivos, produzindo uma coloração róseo avermelhada, ao contrário, o resultado é dado como negativo.
Não houve alteração de cor do meio ao pingar o reagente, o que significa que o teste deu negativo. 
O meio SIM, alem de ser utilizado no teste o indol, e utilizado na Prova da produção de gás sulfídrico, o qual deu resultado negativo e motilidade, o qual permaneceu imóvel. 
Figura 21 - comparação entre o meio SIM não inoculado (esquerda) e o meio inoculado, porém, apresentando resultado negativo (direita) (amostra: controle positivo)
V. Testede Oxidação/Fermentação (O/F) com e sem óleo
O teste de oxidação/fermentação (O/F) é utilizado para diferenciar microorganismos de acordo com a sua habilidade em oxidar ou fermentar açúcares específicos e, portanto, determinar se uma bactéria é aeróbica (oxidam os carboidratos) ou anaeróbica facultativa (podem crescer, realizar seu metabolismo e se reproduzir em condições aeróbicas ou anaeróbicas). Este teste é capaz de distinguir bastonetes Gram-negativos que são aeróbicos, como Pseudomonas aeruginosa, daqueles que são anaeróbicos facultativos, como a Escherichia coli. O teste também distingue cocos Gram-positivos que são aeróbicos, como as espécies de Micrococcus, dos que são anaeróbicos facultativos, como as espécies de Staphylococcus.
As bactérias utilizam carboidratos metabolicamente por processo fermentativo ou oxidativo, evidenciados pela produção de ácidos. 
O meio usado para este teste é um meio semi-sólido (em virtude da baixa concentração de ágar) denominado meio de oxidação/fermentação, o qual contém uma baixa concentração de peptona, suficiente para produzir o crescimento. Esta baixa concentração de peptona é essencial para limitar a formação de produtos alcalinos que poderiam neutralizar o efeito da produção de ácidos. Um carboidrato, como a glicose, a lactose, a maltose, a sacarose, o manitol, ou mesmo a xilose, é adicionado em altas concentrações o que promove a utilização do carboidrato resultando na formação de produtos ácidos. Neste meio, utiliza-se o indicador de pH azul de bromotimol, que possui uma coloração inicial verde a pH 7,1 e se torna amarelo em pH 6,0 e azul em pH 7,6.
Procedimento
Para realização do teste, dois tubos contendo o meio com o açúcar específico são inoculados com o microrganismo a ser testado, com auxílio de uma agulha estéril. Após à inoculação, um dos tubos é então selado com 2,0-3,0 mL de óleo mineral (exemplo: vaselina líquida), criando assim um ambiente anaeróbico, visto que o óleo mineral retarda a difusão do oxigênio dentro do meio. O outro tubo é deixado em contato com o ar, permitindo assim um crescimento anaeróbico. Os dois tubos são incubados a 35°C por 48 horas, para posterior análise da mudança de cor.
Resultados e Discussão
a) Água de poço
Devido a greve dos caminhoneiros, o teste ficou em incubação por mais de uma semana, o que deu alteração no resultado, não podendo ser analisado. 
b) Controle Positivo
Devido a greve dos caminhoneiros, o teste ficou em incubação por mais de uma semana, o que deu alteração no resultado, não podendo ser analisado. 
VI. Uréia
A urease é uma enzima microbiana muito importante relacionada com a decomposição dos componentes orgânicos. Esta enzima é considerada constitutiva porque é sintetizada por certas bactérias, independentemente da presença ou ausência do seu substrato (ureia).
Este teste verifica a habilidade de um microrganismo em utilizar a uréia, formando duas moléculas de amônia pela ação da enzima urease (uréia 2 NH3 + CO2 + H2O). Esta amônia produzida alcaliniza o meio e reage com o indicador de pH (vermelho de fenol) dando uma cor rosa ao meio. A tabela 3 ilustra o comportamento em caso positivo e negativo.
Tabela 3 - resposta do meio em caso de resultado positivo e negativo.
	Resultado
	Cor do meio
	Positivo (+)
	Vermelho/rosa
	Negativo (-)
	Amarelo/sem alteração
O meio para o teste da uréase (que pode ser sólido ou líquido) contém ureia, fatores essenciais para crescimento e o indicador de pH vermelho fenol. O indicador possui uma coloração amarela ou amarelo/laranja em pH abaixo de 8,4 e vermelho em pH acima de 8,4. O meio para o teste foi desenvolvido para determinar a habilidade microbiana em converter ureia em amônia, que é utilizada pela bactéria como fonte de carbono para produção de aminoácidos e nucleotídeos, que aumenta o pH do meio com consequente mudança de cor do indicador.
Resultados e Discussão
a) Água de poço
Houve a alteração de cor para rosa bem forte, o que significa que o teste deu positivo. 
Figura 22 - Comparação entre o meio ureia não inoculado (esquerda) e o meio inoculado e positivo (direita) (amostra: água de poço)
b) Controle Positivo
Apesar da alteração de cor, essa alteração foi insignificante, assim, foi considerado negativo. 
Figura 23 - comparação entre o meio ureia não inoculado (esquerda) e o meio inoculado, porém, apresentando resultado negativo (direita) (amostra: controle positivo)
Para efeito comparativo, foi tirada uma foto com os tubos, positivo e negativo.
Figura 24 - resultado negativo e resultado positivo do teste ureia, respectivamente
VII. Ágar XLD
É um meio para diferenciação moderadamente seletivo utilizado para o isolamento e diferenciação de elementos patogénicos entéricos gram-negativos (Salmonella e Shigella) provenientes de amostras clínicas. É especialmente adequado para o isolamento de espécies de Shigella.
O Extrato de Levedura presente no meio fornece nitrogênio, carbono e vitaminas necessárias para o crescimento do organismo. A Xilose, Lactose e Sacarose são os carboidratos fermentáveis. A Xilose é fermentada pela maioria dos organismos entéricos, exceto pela Shigella spp. e Providencia spp. A Lisina é adicionada para a diferenciação da Salmonella. Com o esgotamento da Xilose, Salmonella spp. descarboxila a lisina causando uma reversão às condições alcalinas. A reversão à condição alcalina por outros organismos lisina-positivos é impedida pela produção excessiva de ácido proveniente da fermentação da lactose e sacarose. Tiossulfato de Sódio e Citrato Férrico Amoniacal agem como agentes seletivos, permitindo a visualização da produção de sulfeto de hidrogênio sob condições alcalinas. O Desoxicolato de Sódio também é um agente seletivo. O Vermelho de Fenol é um indicador. O Cloreto de Sódio mantém o equilíbrio osmótico do meio. O ágar é o agente solidificante.
Os resultados podem envolver a degradação da xilose, lactose e sacarose que produz produtos ácidos, causando uma mudança na coloração das colônias e no meio de vermelho para amarelo. A produção de sulfeto de hidrogênio sob condições alcalinas resulta em colônias com centros pretos. Esta reação é inibida por condições ácidas provenientes da fermentação de carboidrato. A descarboxilação da lisina, na ausência da fermentação de lactose e sacarose, resulta em uma reversão à condição alcalina. Esta condição alcalina causa a mudança de cor do meio para vermelho. 
Procedimento
Utilizar uma alçada com colônias isoladas e estriar em formato de “jogo da velha”. A placa antes de ser inoculada pode ser observada na figura 25. Incubação em 35 - 37°C de 18 a 24 horas.
Figura 25 - ágar XLD antes da inoculação.
Resultados e Discussão
a) Água de poço
As placas foram inoculadas tardiamente devido à greve e, por esse motivo, na verificação dos resultados ficou prejudicada. Não houve crescimento de bactérias. Isso se deve ao longo tempo que as mesmas ficaram incubadas em estufa.
b) Controle Positivo
As placas foram inoculadas tardiamente devido à greve e, por esse motivo, na verificação dos resultados ficou prejudicada. Não houve crescimento de bactérias. Isso se deve ao longo tempo que as mesmas ficaram incubadas em estufa.
VIII. DNAse
Em 1956, Weckman e Catlin demonstraram haver uma correlação entre uma atividade aumentada de DNAse dos Staphylococcus aureus e uma atividade de coagulase positiva. Sugeriram que a atividade de DNAse podia ser utilizada para identificar estafilococos potencialmente patogênicos. DiSalvo confirmou estes resultados obtendo uma correlação excelente entre a atividade de coagulase e de DNAse dos estafilococos isolados provenientes de amostras clínicas. Jeffries, Holtman e Guse incorporaram ADN num meio de ágar para estudarem a produção de DNase pelas bactérias e fungos. No Ágar DNAse, a triptona fornece os nutrientes para o crescimento. O cloreto de sódio mantém o equilíbrio osmótico. O ácido desoxirribonucléico molecular permite a detecção da desoxirribonuclease (DNase) que despolimeriza o ADN. Após a incubação do meio com a estirpe do teste, a placa é inundadacom ácido clorídrico que, por sua vez, provoca a precipitação do ADN polimerizado, tornando o meio opaco. Os organismos que degradam o procedimento do ADN produzem uma zona transparente em volta da área de crescimento. Este meio é predominantemente utilizado na identificação dos estafilococos mas também pode ser utilizado na detecção da actividade de DNase noutros microrganismos.
Procedimento
Inocular o meio com uma alça em forma de jogo da velha. Recomenda-se a inclusão de um controlo negativo, por exemplo, o Staphylococcus epidermidis, e de um controlo positivo, por exemplo, o S. aureus. Incubar as placas entre 18 e 24 h em condições aeróbias entre 35 e 37°C. Após a incubação, inundar as placas com ácido clorídrico PA suficiente. Deixar o ácido penetrar em todo a superfície do meio durante 2 min.
Resultados e Discussão
a) Água de poço
As placas foram inoculadas tardiamente devido à greve e, por esse motivo, na verificação dos resultados ficou prejudicada. Não houve crescimento de bactérias. Isso se deve ao longo tempo que as mesmas ficaram incubadas em estufa.
b) Controle Positivo
As placas foram inoculadas tardiamente devido à greve e, por esse motivo, na verificação dos resultados ficou prejudicada. Não houve crescimento de bactérias. Isso se deve ao longo tempo que as mesmas ficaram incubadas em estufa.
IX. Metabolismo de aminoácidos
A descarboxilação é a remoção de um grupo carboxilo de uma molécula orgânica. As bactérias que crescem num meio líquido descarboxilam aminoácidos mais activamente quando as condições são anaeróbias e ligeiramente ácidas. A descarboxilação de aminoácidos, como a glicina, resulta na produção de uma amina e de dióxido de carbono.
As bactérias que produzem a enzima descarboxilase da glicina podem descarboxilar a glicina e usar as aminas como percursoras para a síntese de outras moléculas. Adicionalmente, quando certas bactérias fazem fermentação são produzidos produtos ácidos que tornam o meio ácido e portanto hostil. Assim, muitas descarboxilases são activadas por um pH baixo, pois ao remover os grupos ácidos dos aminoácidos produzem aminas que aumentam o pH do meio que fica mais adequado.
A descarboxilação desses aminoacidos podem ser detectadas semeando a bactéria num meio de cultura contendo esse aminoácido, glicose e um indicador de pH (púrpura de bromocresol). Os ácidos produzidos pelas bactérias a partir da fermentação da glicose vão inicialmente baixar o pH do meio e causar a mudança de cor do indicador de pH de púrpura para amarelo. O pH ácido activa então a enzima que causa descarboxilação.
Procedimento
Em manobra asséptica, com a alça de inoculação, retirar em torno de 4 colônias de bactérias e inocular diretamente nos tubos com o meio.
Resultados e Discussão
a) Água de poço
i. Arginina
Não houve mudança na coloração do meio contendo Arginina, portando a bactéria não tem a capacidade de descarboxilar o aminoácido contido no meio.
Figura 26 - meio arginina não inoculado (esquerda) comparado ao meio inoculado, porém, com resultado negativo (direita) (amostra: água de poço)
ii. Lisina
Não houve mudança na coloração do meio contendo Lisina, portando a bactéria não tem a capacidade de descarboxilar o aminoácido contido no meio.
Figura 27 - meio lisina não inoculado (esquerda) comparado ao meio inoculado, porém, com resultado negativo (direita) (amostra: água de poço)
iii. Glicina
Houve mudança na coloração do meio contendo Glicina, portando a bactéria tem a capacidade de descarboxilar o aminoácido contido neste meio.
Figura 28 - meio glicina não inoculado (esquerda) comparado ao meio inoculado e positivo (direita) (amostra: água de poço)
b) Controle Positivo
i. Arginina
Não houve mudança na coloração do meio contendo Arginina, portando a bactéria não tem a capacidade de descarboxilar o aminoácido contido no meio.
Figura 29 - meio arginina não inoculado (esquerda) comparado ao meio inoculado, porém, com resultado negativo (direita) (amostra: controle positivo)
ii. Lisina
Não houve mudança na coloração do meio contendo Lisina, portando a bactéria não tem a capacidade de descarboxilar o aminoácido contido no meio.
Figura 30 - meio lisina não inoculado (esquerda) comparado ao meio inoculado, porém, com resultado negativo (direita) (amostra: controle positivo)
iii. Glicina
Houve mudança na coloração do meio contendo Glicina, portando a bactéria tem a capacidade de descarboxilar o aminoácido contido neste meio.
Figura 31 - meio glicina não inoculado (esquerda) comparado ao meio inoculado e positivo (direita) (amostra: controle positivo)
X. MIO
O meio MIO é utilizado para a diferenciação de microorganismos com base na motilidade, atividade de ornitina descarboxilase e produção de indol em um único tubo de cultura.
O nitrogênio, carbono e aminoácidos são fornecidos pela digestão enzimática de gelatina e digestão enzimática de caseína. O extrato de levedura fornece vitaminas e cofatores necessários para o crescimento assim como fornece nitrogênio e carbono. A Dextrose é uma fonte de energia. A pequena concentração de ágar é adicionada para demonstrar a motilidade. Toda a família Enterobacteriaceae fermenta dextrose. A fermentação abaixa o pH, causando uma mudança na coloração do meio MIO de roxo para amarelo. Quando o organismo possui a ornitina descarboxilase, L-Ornitina é descarboxilada para putrescina, causando um aumento do pH e mudança de cor de amarelo para roxo. O indicador de pH Púrpura de Bromocresol facilita a detecção da atividade da descarboxilase.
Procedimento
A prova é efetuada inoculando-se em linha reta, através da técnica da punctura (com agulha), 2/3 de um meio semi-sólido, em manobra asséptica. A prova indica motilidade quando os microrganismos crescem deslocando-se da linha de inoculação, turvando o meio. Deve-se após a inoculação das cepas de microrganismos no meio de cultivo incubar de 24-48 h a 35 ± 2°C. Examine os tubos em 24 horas para crescimento, mudança da coloração e motilidade. Reexamine os tubos em 48 horas. 
A motilidade é indicada pela turvação do meio ou o crescimento que se estende a partir da linha de inoculação. A reação positiva para ornitina é indicada pela coloração roxa em todo o meio (a intensidade da cor pode variar). Se o organismo for negativo para ornitina o meio é amarelo. 
Tabela 4: Respostas dos microrganismos ao meio MIO
	Microrganismo
	Reação
	
	Motilidade
	Indol
	Ornitina
	Enterobacterba aerogenes
	+
	-
	+
	Escherichia coli
	+ ou -
	+
	+ ou -
	Klebsiella pneumoniae
	-
	-
	-
	Salmonella arizonae
	+
	-
	+
	Salmonella typhi
	+
	-
	-
	Shigella sonei
	-
	-
	+
Resultados e Discussão
a) Água de poço
Com relação a motilidade, o meio ficou turvo e teve seu crescimento pela linha de inoculação, sendo assim, imóvel. 
Como não houve alteração de coloração do meio, pode-se concluir que o teste para ornitina deu negativo.
Devido aos resultados negativos em relação ao teste MIO pode-se concluir que um microrganismo possível é o Klebsiella pneumoniae.
Figura 32 - comparação entre o meio MIO não inoculado (esquerda) e o meio inoculado, com resultado negativo (direita) (amostra: água de poço)
b) Controle Positivo
Com relação a motilidade, o meio ficou turvo e teve seu crescimento pela linha de inoculação, sendo assim, imóvel. 
Como não houve alteração de coloração do meio, pode-se concluir que o teste para ornitina deu negativo.
De acordo com a tabela apresentada, confirma-se a presença de Klebsiella pneumoniae.
Figura 33 - comparação entre o meio MIO não inoculado (esquerda) e o meio inoculado, com resultado negativo (direita) (amostra: controle positivo)
XI. Teste do Vermelho de Metila (VM) e Voges-Proskauer (VP)
O teste do VM visa a identificar se a bactéria é capaz de produzir ácidos estáveis como produtos finais da fermentação mista da glicose, enquanto o teste de VP identifica organismos capazes de produzir acetoína a partir da degradação da glicose através da butilenoglicólica.
O procedimento do Vermelho de Metila visa testar a habilidade de um organismo produzir e manter estáveis produtosácido finais, a partir da fermentação de glicose, e superar a capacidade de tamponamento do meio. Isto ajuda na diferenciação de alguns gêneros e espécies, pois algumas bactérias produzem mais ácidos que outras, logo o pH do meio será diferente. Como exemplo podemos citar a ajuda na diferenciação entre Escherichia coli (+) e Enterobacter aerogenes (-).
O teste de VM é baseado no uso de um indicador de pH, o vermelho de metila, para determinar a concentração de íons de hidrogênio presentes quando um microrganismo fermenta glicose. Os microrganismos VM positivos produzem ácidos estáveis utilizando a via de fermentação ácida-mista para metabolizar o ácido pirúvico, mantendo alta concentração de íons de hidrogênio. Já os microrganismos VM negativos também produzem ácidos (ex.: ácido acético, ácido láctico), mas o meio possui uma baixa concentração de hidrogênio revertendo à neutralidade devido a uma posterior degradação dos ácidos orgânicos em carbonatos, em dióxido de carbono e, possivelmente, a formação de amônia a partir da proteína presente no meio. Os resultados possíveis estão de acordo com a tabela 5.
Tabela 5 - Resultados possíveis para o teste VM.
	Resultado
	Cor do meio
	Positivo (+)
	Vermelho
	Negativo (-)
	Amarelo
Já o teste de Voges-Proskauer tem como princípio determinar a habilidade de alguns microrganismos em produzir o acetilmetilcarbinol (acetoína), a partir da fermentação da glicose. Esta é inicialmente metabolizada em ácido pirúvico durante a glicólise. A partir do ácido pirúvico a bactéria segue a via butilenoglicólica para produzir produtos neutros ao final da metabolização do piruvato (e a acetoína é um dos possíveis produtos finais da degradação da glicose). O teste de VP pode ser útil por exemplo na diferrenciação entre Klebsiella pneumoniae (+) e Enterobacter (normalmente +) de E. coli (-). Os resultados estão de acordo com a tabela 6.
Tabela 6 - Resultados possíveis para o teste VP.
	Resultado
	Cor do meio
	Positivo (+)
	Anel vermelho na superfície
	Negativo (-)
	Sem alteração/acobreado
Procedimento
Inoculou-se o material isolado em dois tubos contendo os meios. Os tubos foram incubados a 37ºC por 48 horas. 
Após o período de incubação, para o teste do VM, adicionou-se 2 a 5 gotas do indicador vermelho de metila a um dos tubos, o qual deve ficar vermelho em pH menores que 4,4, ou seja, positivo para o teste. Em valores de pH superiores a 6,0 a coloração deve ser amarela, indicando um teste negativo. 
Para o teste de VP, adicionou-se 2 a 5 gotas do reagente de Barritt “A” (solução com α-naftol) e 2 a 5 gotas do reagente de Barritt “B” (contendo KOH). O tubo foi agitado e deixado em repouso. 
Resultados e Discussão
a) Água de poço
Para o tubo de VM, obteve-se um anel avermelhado na superfície, o que é considerado um resultado positivo.
Figura 34 - Meio VM não inoculado (esquerda) comparado ao resultado positivo (direita) (amostra: água de poço)
Para o tubo de VP, obteve-se uma coloração amarronzada, o que é considerado um resultado negativo. 
Figura 35 - Meio VP não inoculado (esquerda) comparado ao resultado negativo (direita) (amostra: água de poço)
b) Controle Positivo
Para o tubo de VP, obteve-se uma coloração amarronzada, o que é considerado um resultado negativo. 
Figura 36 - Meio VP não inoculado (esquerda) comparado ao resultado negativo (direita) (amostra: controle positivo)
Para o tubo de VM, obteve-se uma coloração vermelha, o que é considerado um resultado positivo.
Figura 37 - Meio VM não inoculado (esquerda) comparado ao resultado positivo (direita) (amostra: controle positivo)
XII. Meio TSI
O Ágar TSI por exemplo, possui a finalidade de diferenciar os bastonetes Gram negativos, utilizando para isso a fermentação de carboidratos e produção de sulfeto de hidrogênio. Sendo, basicamente uma triagem que permite a diferenciação inicial dos isolamentos e um direcionamento da confirmação bioquímica posterior.
Possui em sua composição glicose, lactose e sacarose, os quais sofrendo fermentação são visualizados através da viragem (de vermelho para amarelo) do indicador de pH: o vermelho de fenol. Já o sulfato ferroso de amônio é usado na detecção da produção de sulfeto de hidrogênio, formando composto na cor preta.
A) Fermentação de glicose com ou sem produção de gás
Glicose ácidos ou ácidos + gás
B) Fermentação de sacarose e/ou lactose
Sacarose/lactose ácidos
Bactérias que utilizam apenas glicose provocam acidificação (cor amarela) apenas na base do tubo, permanecendo o ápice alcalino (cor vermelha). Bactérias fermentadoras de lactose e/ou sacarose acidificam todo o meio
Reações em TSI
· Pico alcalino/ fundo alcalino: Ausência de fermentação de carboidratos. Característica de bactérias não fermentadoras. Ex: Pseudomonas aeruginosa.
· Pico alcalino/ fundo ácido: Fermentação de glicose; ausência de fermentação de lactose e/ou sacarose. Característica de bactérias não fermentadoras de lactose e/ou sacarose. Ex.: espécies de Shigella.
· Pico alcalino/fundo ácido: Fermentação de glicose; ausência de fermentação de lactose e/ou sacarose; produção de sulfeto de hidrogênio. Característica de bactérias não fermentadoras de lactose e/ou sacarose e produtoras de sulfeto de hidrogênio. Ex.: espécies de Proteus, Citrobacter e Salmonella.
· Pico ácido/ fundo ácido:Fermentação de glicose e lactose e/ou sacarose. Característica de coliformes fermentadores de lactose e/ou sacarose. Ex.: Escherichia coli.
Interpretação:
· Tubo totalmente vermelho sem crescimento aparente: bactéria exigente.
· Tubo totalmente vermelho com crescimento somente no bisel: possível BGN não fermentador.
· Tubo com bisel vermelho e base amarela: fermentação de glicose apenas. 
· Tubo com bisel amarelo e base amarela: fermentação de glicose, lactose / ou sacarose. 
· A produção de H2S é detectada pela presença de precipitado preto na base do meio, sendo a base sempre considerada ácida (amarela).
· A produção de gás é visualizada pela formação de bolhas ou rachaduras no meio
Prova da produção de gás sulfídrico ou sulfeto de hidrogênio
Existem duas vias fermentativas principais através das quais alguns microrganismos podem produzir sulfeto de hidrogênio. Pela primeira via, o gás sulfídrico é produzido por redução do enxofre orgânico presente no aminoácido cisteína (reação de hidrogenação), o qual é um componente das peptonas contidas no meio. Essas peptonas são degradadas pelas enzimas microbianas a aminoácidos. Através da ação da enzima desulfurase da cisteína o aminoácido cisteína perde o átomo de enxofre, que por sua vez é reduzido pela adição de hidrogênio da água para formar o gás sulfeto de hidrogênio. Uma tira de papel de filtro impregnada com solução saturada de acetato de chumbo é colocada suspensa sobre o meio contendo o aminoácido sulfurado. Esteriliza-se o meio, inocula-se com a cultura teste e incuba-se apropriadamente. Na prova positiva, o H2S produzido é volátil e incolor, mas ao reagir com o acetato de chumbo forma-se sulfeto de chumbo, que enegrece a extremidade do papel de filtro. Na prova negativa a fita permanece branca.
Pela segunda via, o gás sulfídrico também pode ser produzido pela redução de compostos inorgânicos de enxofre tais como o tiossulfato, sulfato ou sulfito. Os microrganismos capazes de produzir a enzima redutase do tiossulfato convertem o tiossulfato em sulfito com liberação de sulfeto de hidrogênio. Os átomos de enxofre atuam como aceptores de hidrogênio durante a oxidação do composto inorgânico conforme abaixo. Para esse teste pode ser empregado o meio de TSI (tríplice sugar andiron) ou o de meio de SIM (sulfito, indol e motilidade). Utilizando o meio de SIM, que tem o tiossulfato como fonte de enxofre e o sulfato ferroso como indicador da produção de sulfeto de hidrogênio. O meio é semi-sólido para permitir a respiração anaeróbia. Nesse caso, inocula-se o meio por punctura e incuba-se em aerobiose por 24h a 35oC. 
Nas duas vias, o sulfeto de hidrogênio produzido reage com o metal pesado formando sulfetos que apresentam coloração negra.
Procedimento
Apóso crescimento do microrganismo que se deseja analisar em meio de cultura específico Agar Nutriente, em manobra asséptica, uma colônia do microrganismo foi escolhida e inoculada em um tubo contendo o meio Agar TSI com o auxílio de uma agulha estéril por picada no cilindro e por estria na rampa. O tubo foi incubado em estufa bacteriológica a 35 °C e incubado por 24 horas. 
Resultados e Discussão
a) Água de poço
Pode ser notado a mudança da coloração do meio de vermelho para amarelo no ápice e na base do tubo, sem precipitado preto no fundo, indicando que possivelmente no tubo as bactérias inoculadas são fermentadoras de sacarose, glicose ou lactose e não produtoras de sulfeto de hidrogênio. 
Figura 38 - meio TSI não inoculado (esquerda) comparado ao meio inoculado (direita) (amostra: água de poço)
b) Controle Positivo
Pode ser notado a mudança da coloração do meio de vermelho para amarelo no bisel e na base do tubo, sem precipitado preto no fundo, indicando que possivelmente no tubo as bactérias inoculadas são fermentadoras de sacarose, glicose ou lactose e não produtoras de sulfeto de hidrogênio. 
Figura 39 - meio TSI não inoculado (esquerda) comparado ao meio inoculado (direita) (amostra: controle positivo)
4.8 Identificação das bactérias pelas provas bioquímicas
As tabelas mostram um resumo com os resultados obtidos nas análises da água de poço e do controle positivo para coliformes totais. 
Tabela 7 - Resumo dos resultados obtidos nas provas bioquímicas da água de poço.
	Provas bioquímicas
	Resultados
	Citrato
	+
	Nitrato
	+
	VP
	-
	MIO
	-
	OF sem óleo
	NÃO PODE SER ANALISADO
	OF com óleo
	NÃO PODE SER ANALISADO
	DNAse
	 NÃO PODE SER ANALISADO
	XLD
	 NÃO PODE SER ANALISADO 
	Glicose
	+
	Frutose
	+
	Xilose
	-
	TSI
	+
	Lactose
	+
	Ureia
	+
	Glicina
	+
	Arginina
	-
	Lisina
	-
	Manitol
	+
	Sacarose
	+
	VM
	+
	SIM
	-
Tabela 8 - Resumo dos resultados obtidos nas provas bioquímicas do controle positivo.
	Provas bioquímicas
	Resultados
	Citrato
	+
	Nitrato
	+
	VP
	-
	MIO
	-
	OF sem óleo
	NÃO PODE SER ANALISADO
	OF com óleo
	NÃO PODE SER ANALISADO
	DNAse
	NÃO PODE SER ANALISADO
	XLD
	NÃO PODE SER NALISADO
	Glicose
	+
	Frutose
	+
	Xilose
	-
	TSI
	+
	Lactose
	+
	Ureia
	-
	Glicina
	+
	Arginina
	-
	Lisina
	-
	Manitol
	+
	Sacarose
	+
	VM
	+
	SIM
	-
A partir de uma tabela de identificação de alguns microrganismos, fez-se uma comparação entre o comportamento dos microrganismos presentes nas amostras e o comportamento de diversos microrganismos que estão descritos na tabela.
Tabela 9 - identificação de alguns microrganismos a partir de provas bioquimicas
	Característica
	E. coli
	Salmonella
	Klebsiella
	Proteus
	Enterobacter
	EMB
	Lac+
	Lac-
	Lac+
	Lac-
	Lac+
	TSI
	ác/ác
	alc/ác
	ác/ác
	alc/ác ou ác/ác
	ác/ác
	H2S
	-
	+
	-
	+
	-
	Glicose
	+
	+
	+
	+
	+
	Gás
	+
	+
	+
	+
	+
	Lactose
	+
	-
	+
	-
	+
	Sacarose
	V
	-
	+
	v
	+
	Manitol
	+
	+
	+
	v
	+
	VM
	+
	+
	+
	+
	-
	VP
	-
	-
	-
	-
	+
	Citrato
	-
	v
	+
	-
	+
	Indol
	+
	-
	-
	v
	-
	Mobilidade
	V
	+
	-
	+
	+
	Uréia
	-
	-
	v
	+
	-
Legenda: (+) = positivo, (-) = negativo, (v) = variável.
5. Conclusão
5.1 Provas bioquímicas
Em relação as provas bioquímicas, de acordo com a comparação feita através dos resultados obtidos e da tabela fornecida, pode-se dizer que a bactéria analisada tanto nas amostras de água de poço, quanto no controle positivo, se trata da Klebsiella pneumoniae. A mesma apresenta resultados de ensaios com Glicose, lactose, sacarose, manitol, VM e citrato positivos e ensaios para H2S, VP, Indol, mobilidade negativos. Apresenta também o ensaio de ureia variável, como foi possível observar na amostra de água de poço, que apresentou resultado positivo e no controle positivo, que apresentou resultado negativo.
5.2 Controle positivo
Concluiu-se que os resultados do teste de controle positivo foram satisfatórios visto que confirmaram que a bactéria analisada era realmente a Klebsiella pneumoniae. Validando, desta forma, as análises realizadas nas amostras de água de poço.
5.3 Análise da água de poço
De acordo com a Portaria Nº 2.914, DE 12 DE DEZEMBRO DE 2011, deve haver ausência de microrganismos do grupo coliformes totais em 100 mL de água analisada.
A partir dos testes de colimetria pelo método dos tubos múltiplos foi possível observar o crescimento de um microrganismo que foi identificado como Klebsiella pneumoniae através das provas bioquímicas e comparação com o controle positivo. Sendo assim, a água analisada se encontra fora dos padrões microbiológicos estabelecidos pela Portaria 2.914 e está imprópria para consumo humano.
6. Referências Bibliográficas
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BRASIL - Ministério da Saúde. Portaria Nº 2.914, DE 12 DE DEZEMBRO DE 2011. Dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Brasília, Brasil, 2012.
BRASIL - Conselho Nacional do Meio Ambiente – CONAMA. Resolução n° 274, de 29 de novembro de 2000. Define os critérios de balneabilidade em águas brasileiras. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Brasília, Brasil, 2001.
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