Aula 06 - 03 09 2021

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Banco de Sangue e Imunohematologia
Arthur Luiz de Campos Ferreira
Biomédico e Farmacêutico-Bioquímico
Especialista em Análises Clínicas
Mestre em Saúde Pública
em Região de Fronteira
Técnica - Coombs Direto
	1. Coletar amostra de sangue.
	2. Preparar uma suspensão de hemácias de 3 -5%.
	3. Colocar uma gota dessa suspensão em um tubo de hemólise.
	4. Lavar 3x com solução salina.
	5. Adicionar 2 gotas de antiglobulina humana poliespecífica (anti-IgG e C3d).
	6. Centrifugar 3400 rpm por 15 segundos.
	7. Ressuspender suavemente o botão de hemácias.
	8. Observar a presença o não de aglutinados.
Causas de erros na interpretação quando utiliza-se a AGH
	Reações falso-negativo:
	Lavagem inadequada das hemácias
	Reagente AGH sem reatividade
	Preparo inadequado das suspensões de hemácias
	Sub-centriifugação.
	Reações falso-positivo:
	Vidraria mal-lavada
	Centrifugação excessiva
Pesquisa e Identificação de Anticorpos Irregulares
	
	Existem muitas possibilidades de ativação de resposta imune em um indivíduo, como resultado da exposição a substâncias estranhas (imunógenos).
	
	Em hemoterapia, a administração de uma grande quantidade de eritrócitos pode ser responsável pela aloimunização.
O que são anticorpos irregulares?
	Quando o corpo é exposto a substâncias reconhecidas como não próprias ao seu organismo (exemplo antígenos eritrocitários), pode ocorrer ativação do sistema imune, com consequente formação de anticorpos.
	
	Anticorpos são proteínas (imunoglobulinas) produzidas pelos plasmócitos após ativação do sistema imune.
Como surgem?
	Podem se dar por estímulos naturais, como no caso da imunização ABO, sendo então denominados anticorpos regulares, pois sua ocorrência é esperada.
	
	Mas geralmente, em hemoterapia, ocorrem como resposta aos aloantígenos contidos em hemocomponentes transfundidos, ou mesmo são decorrentes da gestante com sangue fetal. Como sua ocorrência não é esperada, são denominados anticorpos irregulares.
Como surgem?
	Na rotina imunohematológica, geralmente procuramos detectar e identificar anticorpos antieritrocitários.
	
	Os anticorpos irregulares ocorrem de 0,3% a 2,0% da população em geral. O risco de aloimunização é de aproximadamente 1% por unidade transfundida. Populações com risco maior:
	Politransfundidos: 09%
	Talassêmicos: 10%
	Falciformes: 36%
Curiosidade
	Já são conhecidos aproximadamente 285 antígenos eritrocitários classificados em 30 sistemas.
	
	Produzidos a partir da expressão de 40 genes e seus 1.124 alelos.
	
	Ocorrem principalmente por sensibilização após transfusão, gestação ou, ainda, por ocorrência natural.
PAI
	Verifica a presença ou não de anticorpos irregulares no soro/plasma do indivíduo.
	
	Teste pré-transfusional obrigatório, segundo a legislação vigente.
	
Também realizada em doadores ou gestantes.
	
PAI
	Utiliza pelo menos dois frascos de reagentes comerciais, que são do tipo O e possuem a maioria dos outros antígenos de grupo sanguíneos (não ABO).
	
	É realizada colocando essas hemácias em contato com o soro/plasma.
	
	A leitura da reação pode ser feita em diversas fases, dependendo da metodologia escolhida.
PAI
	Tubo:
	Fase de temperatura ambiente
	37 ºC
	Fase da antiglobulina humana
	Gel:
	Pelo método de aglutinação em coluna, a leitura é realizada diretamente na fase de antiglobulina humana.
PAI – Técnica em Tubo
PAI – Técnica em Gel
Técnica - PAI
	Parte 1 - Fase Salínica: revela anticorpos frios de natureza IgM em geral (anti-M, anti-P e anti-Leª).
	
	1. Rotular dois tubos de hemólise como I e II.
	2. Nos dois tubos, colocar duas gotas de soro a ser testado.
	3. No tubo I, adicionar 1 gota de suspensão a 5% de hemácias de triagem I e no tubo II, idem para a hemácia de triagem II.
	4. Homogeneizar e centrifugar a 3400 rpm por 15 min.
	5. Verificar presença de hemólise.
	6. Ressuspender delicadamente o “botão” de hemácias realizando a leitura macroscopicamente.
Técnica - PAI
Técnica - PAI
	Parte 2 - Fase Albumina: a albumina é uma proteína que atua aumentando a constante dielétrica do meio, diminuindo o potencial zeta, facilitando a aglutinação. Nesta fase, alguns anticorpos de natureza IgG já podem ser revelados.
	
	7. Adicionar duas gotas de albumina bovina a 22% nos tubos I e II.
	8. Homogeneizar e centrifugar a 3400 rpm por 15 min.
	9. Verificar a presença de hemólise.
	10. Ressuspender delicadamente o “botão” de hemácias realizando a leitura macroscopicamente.
Técnica - PAI
	Parte 3 – Fase Térmica: auxilia na revelação de anticorpos IgG quando incubados a 37ºC.
	
	1. Incubar os tubos durante 15 minutos em banho maria a 37ºC.
	2. Homogeneizar e centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos.
	3. Observar presença de hemólise.
	4. Ressuspender delicadamente o “botão” de hemácias realizando a leitura macroscopicamente.
Técnica - PAI
	Parte 4 – Fase Antiglobulina Humana: revela a aglutinação de hemácias sensibilizadas por IgG. São revelados a maioria dos anticorpos.
	
	1. Lavar as hemácias dos tubos I e II, em salina, por 3 vezes.
	2. Após a terceira lavagem, retirar todo o sobrenadante por inversão rápida dos tubos.
	3. Homogeneizar bem e adicionar a cada tubo, duas gotas de antiglobulina humana.
	4. Homogeneizar bem e centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos.
	5. Observar presença de hemólise.
	6. Ressuspender delicadamente o “botão” de hemácias realizando a leitura macroscopicamente.
Técnica - Validação da AGH
	
	1. Nos tubos negativos, adicionar uma gota do Reagente Controle de Coombs.
	
	2. Misturar bem, centrifugar adequadamente, ressuspender gentilmente o “botão de hemácias” e ler macroscopicamente para aglutinação, a qual deverá forçosamente ocorrer.
Interpretação dos resultados
	Resultado positivo em qualquer uma das fases indica presença de anticorpos irregulares (PAI), que deverão ser identificados por meio de painel de hemácias.
	
	Provas negativas nem sempre significam ausência de anticorpo irregular, pois o título deste pode ter decrescido até atingir níveis indetectáveis, por diminuição do estímulo antigênico, ou, ainda, pelo teste empregado não apresentar sensibilidade suficiente para a detecção.
	Neste caso, se houver novo estímulo antigênico, através de nova transfusão fenótipo-positiva, pode ocorrer uma resposta, com produção de altos títulos desses anticorpos em período de 24 a 72 horas.
Painel de PAI positivo
	Quando a PAI é positiva, o próximo passo é identificar a especificidade do(s) anticorpo(s).
	Utiliza-se painel de hemácias contendo geralmente 11 hemácias-teste de grupo O de fenótipos eritrocitários conhecidos para os sistemas mais imunogênicos. 
	As hemácias são testadas contra o soro/plasma do indivíduo, utilizando as mesmas técnicas que apresentaram PAI positivo.
	Realiza-se conjuntamente ao painel um Autocontrole, para detectar a presença de eventuais autoanticorpos.
Alguns procedimentos auxiliares em identificação de anticorpos irregulares
Técnica enzimática
	Técnica de preaquecimento
	Redução de temperatura
	LISS (solução de baixa força iônica)
	Reagentes Thiol (DTT)
	Substâncias macromoleculares (albumina, PEG, entre outros).
	Adsorção
	Alteração do pH
	Solução de Difosfato de Cloroquina
	Técnica do bloqueio