MÓDULO 3 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL 2

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MÓDULO 3 – DIAGNÓSTICO LABORATORIAL 2
INTRODUÇÃO
As bactérias podem causar infecções em diferentes sítios no hospedeiro, como infecções sistêmicas, gastrointestinais, no trato respiratório superior e inferior, infecções urinárias, sistema nervoso, na pele, dentre outros. Ao longo dessa jornada, vamos conhecer as infecções sistêmicas, as gastrointestinais e as que afetam o sistema nervoso central. E qual a importância dessas infecções?
As infecções sistêmicas são uma das complicações mais preocupantes durante uma infecção bacteriana, a presença de bactéria no sangue aumenta significativamente as taxas de óbitos. As infecções gastrointestinais (diarreia) causadas por bactérias, apesar de acometer todas as idades, são um problema maior para crianças menores de 5 anos, onde é estimado uma ocorrência de um bilhão de casos no mundo e cerca de 5 milhões de óbitos. No Sistema Nervoso Central, as infecções, conhecidas como meningite, podem trazer danos irreversíveis para o paciente se não for diagnosticada e tratada rapidamente. Por fim, vamos falar das ISTs bacterianas mais importantes, que ainda acometem muitos pacientes.
Como sabemos, essas infecções podem ser causadas por uma variabilidade de bactérias. Para conhecer a espécie bacteriana, é necessário um diagnóstico laboratorial que empregue um conjunto de técnicas e procedimentos para a correta e rápida identificação do agente causador da doença, bem como a melhor opção de tratamento e sua epidemiologia. O diagnóstico de uma infecção se inicia na suspeita e coleta da amostra e continua no laboratório, com as técnicas de culturas, provas bioquímicas e colorações.
Como é possível perceber, o seu papel no diagnóstico laboratorial é crucial, pois envolve a vida dos pacientes. Esteja sempre atento aos procedimentos corretos, às normas de biossegurança e consulte outro profissional sempre que tiver dúvidas. Agora, vamos nos aprofundar um pouco mais sobre esse assunto.
MÓDULO 1
Identificar as principais bactérias associadas a infecções sistêmicas (hemoculturas)
INTRODUÇÃO
As doenças infecciosas são quase tão diversas quanto os microrganismos capazes de causá-las. Infecções sistêmicas são desencadeadas pela presença da bactéria na corrente sanguínea (bacteremia) podendo ser de forma transitória, intermitente, contínua ou de escape de acordo com o tempo que o microrganismo fica na corrente sanguínea. Os casos mais graves de bacteremia envolvem uma resposta imunológica sistêmica grave chamada de sepse, podendo causar a falência múltipla de órgão e consequente a morte do paciente, condição conhecida como choque séptico.
Assim, o exame de hemocultura busca identificar e isolar a presença de microrganismos na corrente sanguínea de paciente com suspeita de sepse e auxiliar na terapia antimicrobiana mais eficaz.
Hoje, a probabilidade de óbito de pacientes positivos para hemocultura é cerca de 12 vezes maior do que pacientes com resultado negativo, chamando atenção para o correto diagnóstico deste tipo de infecção e um tratamento eficaz.
COLETA DE SANGUE
O primeiro passo para a solicitação de uma hemocultura é a identificação de quais pacientes necessitam deste exame. O médico deve solicitar o exame toda vez que existir suspeita de sepse, o que vai incluir um quadro caracterizado por febre alta (>38°C) e calafrios. No entanto, em alguns casos, os pacientes podem apresentar temperatura baixa (<36°C), junto com um ou mais dos seguintes sintomas: diminuição da pressão arterial, aumento da frequência cardíaca, número muito alto ou muito baixo de glóbulos brancos no sangue.
Alguns fatores de risco devem ser considerados na escolha do exame: idade avançada, recém-nascidos, sistema imunológico debilitado, tempo de hospitalização, procedimentos invasivos, tais como uso de cateter, infusões, agulhas, entre outros, suspeita de endocardite (infecção do tecido interno do coração), doenças crônicas como diabetes e cirrose, além de pacientes com câncer ou AIDS.
COLETA DE SANGUE PARA HEMOCULTURA
A coleta de sangue pode ser realizada através de punção venosa, utilizando agulha e seringa, ou pelos métodos a vácuos (os mais recomendados). No momento da coleta, devemos sempre respeitar: os procedimentos de descontaminação do local da coleta para que não ocorra contaminação do material; os procedimentos de biossegurança e o uso correto de EPI (Equipamentos de proteção individual) para evitar possíveis problemas.
RECOMENDAÇÃO
A antissepsia é fundamental para que não ocorra contaminação da amostra, e pode ser realizada utilizando soluções de clorexidina alcoólica (0,5%), tintura de iodo (1-2%), PVPI (10%), álcool isopropanol 92% ou álcool 70%. Deve-se preparar o material para coleta com a devida identificação dos frascos (nome do paciente, data e hora da coleta, via de coleta, sítio de coleta e tomar cuidado para não cobrir o código de barras do frasco de hemocultura), realizar a assepsia da tampa do frasco e, lembre-se, não apalpar o local após a antissepsia.
É recomendado evitar coleta do cateter (alto risco de contaminação), punção venosa é a mais recomendada. O cateter somente é coletado quando existe suspeita de infecção sanguínea pelo uso dele. A coleta, sempre que possível, deve ser realizada antes da antibioticoterapia (para não ocorrer morte bacteriana antes da sua detecção), antes do pico febril (pois, a febre é uma resposta do sistema imunológico contra a infecção) e, se houver outro foco infeccioso, fazer uma coleta deste também. Caso o paciente já esteja tomando antibióticos, a coleta deve ser feita antes da administração da próxima dose.
RECOMENDAÇÃO
Recomenda-se no mínimo 2 frascos e máximo de 4 frascos de sangue, mas vai depender de cada paciente e da suspeita, por isso fique atento às recomendações do médico que solicitou o exame. Deve-se coletar de sítios diferentes, por exemplo, braço esquerdo e braço direito, para aumentar a probabilidade de detecção e diminuir a taxa de contaminação. O volume coletado varia de 5 a 10 mL de sangue para adultos e 1 a 5 mL para crianças em cada frasco.
O primeiro frasco é utilizado para procura de bactérias anaeróbicas e outro para cultura de bactérias aeróbicas, após a coleta deve-se homogeneizar o meio. Cada frasco possui meios de cultura que vão favorecer o crescimento de cada tipo de bactéria. Quando existe suspeita de infecção por dispositivos intravenosos, como o cateter, pode-se coletar a ponta do cateter e mandar para análises microbiológicas também. Para isso, deve-se cortar o segmento que estava inserido no paciente com tesoura estéril e colocar em frasco estéril, mandar para o laboratório. Após a coleta, o material deve ser levado imediatamente para o laboratório em temperatura ambiente.
ATENÇÃO
Cateter são fontes notáveis de infecção da corrente sanguínea, principalmente, pela capacidade de algumas bactérias em formar biofilme. É importante causa de infecção sistêmica em pacientes imunodebilitados internados em UTI e a contaminação pode vir da própria microbiota da pele do paciente, das mãos do profissional de saúde, contaminação do fluido de infusão ou até mesmo pela colonização do dispositivo.
BIOFILME
Capacidade de se aderir a uma superfície, formando uma estrutura de açúcares (extra polissacarídica) que protege e mantém as bactérias naquela superfície por longos períodos.
SEMEADURA EM MEIO DE CULTURA
No laboratório, diferentes meios de cultura ganham destaque, pois é neles que é possível realizar o crescimento destes microrganismos e seu diagnóstico. Os meios de cultura são combinações ricas em nutrientes que permitem o crescimento de microrganismos em laboratório. Apesar disso, existem microrganismos ditos fastidiosos (demoram a crescer em meios de culturas disponíveis atualmente) e o diagnóstico destes são mais demorados e difíceis.
Os meios de culturas podem ser comerciais ou não, devendo sempre se respeitar as condições de armazenamento, biossegurança e preparo para se garantir um resultado confiável. Microrganismos apresentam exigências nutricionais diversas e, como não se sabe o agente causador da infecção, énecessário utilizar meios ricos em nutrientes que permitirão o crescimento da maioria dos microrganismos. Entre eles, temos os caldos (meios líquidos), como o caldo BHI (Brain Heat Infusion), caldo TSB (Trypticase Soy Broth), Caldo Columbia, todos meios ricos em nutrientes que permitem o crescimento da maioria dos microrganismos.
Geralmente, os frascos para coleta de sangue para aeróbicos conterão caldo BHI ou Caldo TSB; e os frascos para anaeróbicos, o Caldo Columbia. Ambos terão um anticoagulante, geralmente, o SPS.
Os meios sólidos pela presença de Ágar, incluem o Ágar Chocolate (com sangue hemolisado, para microrganismos fastidiosos), Ágar Sangue (com sangue de cavalo ou carneiro), Ágar MacConkey ou Ágar EMB (seletivo para bactérias gram-negativas e diferencial pela fermentação da lactose). Existem diferentes meios de culturas para isolamento e identificação bacteriana, sua escolha dependerá do meio padronizado pelo laboratório de microbiologia.
HEMOCULTURA
Após a coleta, os frascos são enviados ao laboratório de microbiologia e incubados a 35-37°C em estufa. Existem diferentes formas de processamento das hemoculturas e a escolha dependerá de cada laboratório, bem como a demanda de solicitação. Podemos ter hemoculturas manuais, semiautomatizadas e automatizadas.
HEMOCULTURA MANUAL
Na hemocultura manual, os frascos coletados são incubados por 7 dias por 35-37°C com 3 subcultivos dos frascos. Sempre observar a aparência da hemocultura no frasco a fim de se detectar turbidez, produção de gás, bolhas, grumos etc, pois são indicativos de crescimento bacteriano no frasco. Após 24 horas de incubação, é realizada a primeira semeadura nos meios Ágar chocolate, Ágar Sangue e Ágar McConkey ou Ágar EMB pela técnica de esgotamento. Os frascos e os meios de cultura são incubados por 24 horas à 35-37°C, ou seja, é realizado o subcultivo do frasco em meios de cultura sólidos. Se, após 24 horas, for observado crescimento bacteriano nos meios, através da formação de colônias, segue-se para a identificação (provas bioquímicas e coloração de Gram) e o antibiograma. Se for negativo, um outro subcultivo deve ser realizado semeando a amostra no meio de cultura e incubando por mais 24 horas a 35-37°C (aqui já temos 48 horas desde a coleta). Se no segundo subcultivo tiver crescimento microbiano, seguimos para a identificação e antibiograma. Se der negativo, ele segue para um terceiro subcultivo nos meios de cultura e incubação novamente por mais tempo a 35-37°C.
SUBCULTIVOS
Os subcultivos consistem em semear a amostra dos frascos de coleta nos meios de cultura para observar se há crescimento bacteriano.
TÉCNICA DE ESGOTAMENTO
Técnica de semeadura em meio de cultura sólido para se obter colônias isoladas. Com uma alça estéril, passar na amostra e realizar estrias sobre o meio de cultura de modo que uma estria não encoste na anterior.
COLÔNIAS
Aglomerado de bactérias visível em um meio de cultura sólido, obtido por uma única célula bacteriana.
ANTIBIOGRAMA
Teste para saber qual melhor opção de tratamento para determinada bactéria.
Diferentes meios de cultura mostrado o crescimento bacteriano (unidades formadoras de colônia).
ATENÇÃO
É importante ressaltar que o frasco de anaeróbicos deve-se incubar em tensão de anaerobiose (sem oxigênio). Se após este período apresentar crescimento microbiano, seguimos para identificação e antibiograma. Se der negativo, podemos descartar o frasco e liberar o resultado como negativo. Esses três subcultivos são chamados de culturas cegas, pois não se sabe se há crescimento no frasco. Microrganismos fastidiosos demoram mais tempo para crescer, como por exemplo espécies do gênero Mycobacterium, quando tiver suspeita de infecção por espécies fastidiosas o tempo de incubação é maior.
*Para suspeita de microrganismos fastidiosos ou fungos incubar por mais 10 dias.
Fluxograma: Processamento de hemoculturas pelo método manual.
HEMOCULTURA AUTOMATIZADA
Nos sistemas automatizados, o frasco vai para o aparelho que é capaz de detectar o crescimento mínimo de microrganismos no frasco. Quando o crescimento é detectado, o aparelho emite um sinal e assim é realizada a semeadura nos meios de cultura Ágar Chocolate, Ágar Sangue e Ágar McConckey ou Ágar EMB, seguindo para identificação e antibiograma.
Os sistemas automatizados apresentam maior rapidez (tempo máximo de 5 dias dependendo da suspeita do microrganismo), não há necessidade de muitas semeaduras e, com isso, menor risco de contaminação. Como exemplo dos sistemas automatizados, podemos citar o BacT/Alert da BioMérieux e BACTEC da BD.
Aparelho de cultura automatizado.
Quando há suspeita de infecção por uso de cateter, a cultura é feita em paralelo à hemocultura, onde, com auxílio de uma pinça estéril, o segmento do cateter é rolado sobre a superfície do Ágar Sangue e incubado por 24 horas a 35-37°C, logo após é visualizado o crescimento microbiano. Recomenda-se deixar o meio de cultura incubado por mais 48 ou 72 horas caso não haja crescimento.
HEMOCULTURA AUTOMATIZADA
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
As infecções sistêmicas podem ter três origens: infecções primárias da corrente sanguínea (sem foco de infecção primário identificável), infecções secundárias da corrente sanguínea (com infecção primária identificada em outra localização) e as infecções da corrente sanguínea associadas à utilização de cateter (o cateter é a fonte da contaminação).
Os principais focos de infecções secundárias são o trato geniturinário, trato respiratório, trato intestinal, pele e abscessos. Na maioria das vezes, as bacteremias são causadas por uma única bactéria, infecções ditas polimicrobianas (mais de uma bactéria) são raras.
Foto representando colônias de Staphylococcus sp. em placas de ágar sangue.
As principais bactérias encontradas em hemoculturas com valor preditivo positivo alto (>90%), ou seja, a probabilidade da hemocultura de fato ser uma bacteremia verdadeira ou septicemia quando isolada do sangue, incluem: Staphylococcus aureus (gram-positivas), Escherichia coli e demais enterobactérias (gram-negativas), Neisseria meningitidis (gram-negativas), Pseudomonas aeruginosa (gram-negativas), Streptococcus pneumoniae (gram-positivas), Brucella spp. (gram-negativas), Streptococcus pyogenes (gram-postivas), Straptococcus agalactiae (gram-positivas), Listeria monocytogenes (gram-positivas), Haemophilus influenzae (gram-negativo). Bactérias anaeróbicas são raras de acontecer, cerca de 1% das sepses são causadas por elas e incluem espécies do gênero Bacterioides spp. (gram-negativas).
Microrganismos com valores preditivos positivos variáveis, ou seja, diferentes chances de ser uma bacteremia verdadeira, incluem Streptptococcus viridans (38%), Enterococcus spp. (78%) e Staphylococcus coagulase negativa (15%). Enquanto a presença de Corynebacterium spp., Micrococcus spp., Bacillus spp., e Propionibacterium acnes são constantemente associadas à contaminação, com apenas 5% de chance de ser uma bacteremia verdadeira.
EXEMPLO
Um paciente com infecção urinária confirmada para a bactéria E. coli realizou 2 coletas de hemocultura em braços diferentes, utilizando 2 frascos, um para cada coleta. Após o procedimento de incubação e cultura, é identificado em 1 frasco a bactéria Staphylococcus coagulase negativa. Imediatamente, devemos pensar em contaminação no momento da coleta, pois houve crescimento em apenas 1 frasco de uma bactéria comum da pele, no exemplo Staphylococcus coagulase negativa, indicando que a assepsia foi realizada de maneira errada. De forma diferente, quando ocorre uma bacteremia verdadeira ou uma endocardite, na maioria dos frascos, após incubação e cultivo, apresentam positividade para a mesma bactéria.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
MÓDULO 2
Identificar as principais bactérias associadas a infecções do trato gastrointestinal (coprocultura)
INTRODUÇÃO
Podemos definir a diarreia como um quadro de fezes aquosas com mais de duas evacuações ou fora do que é habitual do indivíduo. As diarreias são comuns, principalmente, em países em desenvolvimentos, podendo ser 2 a3 vezes mais frequentes, estando ligada ao quadro socioeconômico e de saneamento básico.
Podemos classificar as diarreias em: diarreia aguda (<14 dias), diarreia persistente (>14 dias) e diarreia crônica (>30 dias), sendo a aguda a mais comum. Apesar de todas as idades serem cometidas por este quadro, existe uma prevalência em crianças menores de 5 anos e gestantes. A maioria dos quadros de diarreia são autolimitantes, alguns podem evoluir para casos mais graves e requerem atenção médica e exames adicionais para o seu diagnóstico e tratamento.
As diarreias infecciosas possuem uma gama de agentes causadores, entre elas, vírus, protozoários, helmintos e bactérias, as mais graves, geralmente, são causadas por bactérias. A diarreia de origem bacteriana pode gerar um quadro grave de desidratação, problemas neurológicos, insuficiência renal e até a morte se não for tratada.
Agora, vamos observar como essas infeções ocorrem e como proceder para o seu diagnóstico.
SÍNDROME DISENTERIFORME E COLERIFORME
De acordo com os sintomas, podemos dividir a diarreia causada por bactérias em dois quadros clínicos, chamados de síndrome disenteriforme e coleriforme. Essas síndromes ocorrerão de acordo com o tipo de patógeno ou toxinas acometidas.
SÍNDROME DISENTERIFORME
É caracterizada por uma diarreia do tipo inflamatória, com visível sangue nas fezes, dor abdominal, perda de peso, podendo gerar febre (com exceção da E. coli enterohemorragica). O sangue nas fezes é proveniente de citotoxinas ou bactérias enteroinvasivas que destroem ou invadem o trato gastrointestinal.
SÍNDROME COLERIFORME
Tem como característica uma diarreia aquosa aguda, com três ou mais fezes líquidas ou semilíquidas por dia dentro de um intervalo de até 14 dias (a maioria dura menos de 7 dias), não apresentam sangue visível, podendo apresentar vômito, náuseas, febre e falta de apetite. Suas consequências são desidratação grave. São processos característicos de bactérias que produzem enterotoxinas (toxinas que agem sobre o intestino).
PATOGENIA DA DIARREIA BACTERIANA
O sítio de infecção, o patógeno e o mecanismo de patogenicidade podem ser relacionados com os casos clínicos. Podemos classificar os patógenos em:
PATÓGENOS QUE PRODUZEM ENTEROTOXINAS
Causam diarreia aquosa pela troca iônica e interação com as funções dos enterócitos (células epiteliais do intestino grosso e delgado).
PATÓGENOS PRODUTORES DE CITOTOXINAS
Destroem os enterócitos, causando uma inflamação intestinal com todos os sintomas inflamatórios, levando sangue nas fezes e febre.
PATÓGENOS QUE INVADEM A MUCOSA INTESTINAL E SE ADEREM A ESTA:
Chamados de patógenos enteroaderentes, alteram a função normal dos enterócitos, levando a um quadro inflamatório.
As principais formas de transmissão destes patógenos é pela via oral, de animais para pessoas, de pessoa-pessoa ou pela ingestão de alimentos contaminados. Alguns indícios (fatores de riscos) podem estar associados, como membros da família ou pessoas próximas com diarreia, viagem recente, atendimento médico frequente, fontes de abastecimento de água, dieta (contaminação de alimentos, bem comum) e uso anterior de antimicrobiano.
Os principais patógenos associados a quadros diarreicos podem ser relacionados às síndromes disenteriforme e coleriforme de acordo com sua patogenia. Os patógenos que produzem citotoxinas e/ou invadem e se aderem à mucosa intestinal levarão a um quadro inflamatório característico da síndrome disenteriforme e incluem espécies Salmonella spp., Campylobacter spp., Shigella spp., E. coli enterohemorrágica (frequentemente associada ao sorotipo 0157:H7) , E. coli enteroinvasiva, Yersinia spp., Clostridium difficile, Bacillus cereus. Enquanto os mais comuns em gerar a síndrome coleriforme incluem E. coli enterotoxigênica, E. coli enteropatogênica e enteroinvasiva, Vibrio cholerae.
PATOGENIA
Referente ao mecanismo de agressão ou ao desenvolvimento da doença.
COPROCULTURA
Na copropocultura, estamos falando de pesquisa de bactérias nas fezes, mas não é qualquer bactéria, afinal, sabemos que as fezes contêm uma grande quantidade destes microrganismos (incluindo a E. coli).
Então como saber a origem de uma infecção gastrointestinal bacteriana?
RESPOSTA
Primeiro, a pesquisa é direcionada a determinados patógenos comumente associados a este quadro infeccioso já mencionado, segundo a quantidade de determinadas bactérias nas fezes.
Sabemos que algumas bactérias não fazem parte da microbiota intestinal e sua detecção pode sinalizar um quadro infeccioso, enquanto outros fazem parte da microbiota intestinal e podem causar infecção quando ocorre um descontrole no seu crescimento, como, por exemplo, pelo uso de antimicrobianos, que podem levar à morte de algumas bactérias da microbiota. O descontrole da microbiota intestinal é chamado de disbiose e pode favorecer o crescimento de algumas espécies, é o que acontece com infecções por C. difficile, em que a intensa proliferação dessa bactéria acaba produzindo uma grande quantidade de toxinas que leva ao quadro diarreico.
COLETA DE FEZES PARA A COPROCULTURA
A coleta é feita utilizando um coletor de fezes universal estéril, evitando contato da amostra com urina ou água do vaso sanitário. A coleta deve ser feita, preferencialmente, antes do uso de antibióticos, sem a necessidade de encher o pote de coleta, deve-se tomar cuidado para não vazar material.
Coletor universal de fezes.
RECOMENDAÇÃO
O pote coletor deve ser encaminhado para o laboratório dentro de uma hora, se não for possível, deixar refrigerado por até 6 horas. Existem alguns meios de cultura de transporte que possuem conservantes, dando tempo de análise de 24 a 48 horas. Na análise, deve-se dar prioridade a porções contendo muco, sangue ou pus, quando presentes, pois neles estão grande quantidade do patógeno causador. Não deverá ser aceita amostras provenientes de fraudas, com urina ou qualquer outro líquido e após 3 dias de quadro infeccioso.
A escolha dos meios de cultura utilizados para pesquisa de bactérias depende da suspeita clínica e incluem Ágar McConkey e Ágar EMB para pesquisa de Enterobactérias Gram-negativas, Ágar SS (Salmonella Shigella), Ágar HE (Entérico de Hektoen) e Ágar XLD (Desoxicolato-Lisina-Xilose) para detecção de Salmonela spp. e Shigella spp., Ágar Campy para detecção de Campylobacter spp., Ágar CIN (Novobiocina-Irgasan-Cefsulodina) para detecção de Yersinia spp., Ágar RCBS (Tiossulfato, Citrato, Bílis e Sacarose) para detecção de Vibrio spp. Além dos meios de cultura sólidos, a amostra também é semeada em um meio enriquecido e seletivo para patógenos entéricos, como caldo Selenito, Caldo Tetrationato, caldo Campy-tioglicolato (para Campylobacter spp.) e caldo GN (para Shigella e Salmonella).
Como é possível perceber, utilizamos meios de cultura que favorecem o crescimento dos principais patógenos associados a essas infecções e que inibem ou diminuem o crescimento de bactérias provenientes da microbiota.
Em caso de amostra líquida ou swab, deve ser semeado direto nos meios de cultura. Em caso de fezes sólidas, deve-se diluir a amostra em solução salina 10% tamponada. Após semear as amostras nos meios de cultura selecionados, elas são incubadas a 35-37°C por 18 a 24 horas. Caso exista crescimento no meio de cultura, a amostra segue para a identificação e antibiograma. Caso não haja crescimento, uma nova amostra é semeada do caldo de enriquecimento e incubada novamente por 35-37°C por 18 a 24 horas. Após esse período, em caso positivo (observado o crescimento), segue-se para a identificação e, em caso negativo, o resultado é liberado como negativo.
DIAGNÓSTICO BIOQUÍMICO
Devido à grande diversidade de microrganismos encontrados na coprocultura, faz-se necessária a realização de provas bioquímicas para confirmação se o crescimento microbiano visualizado é, de fato, um enteropatógeno. Assim, as provas bioquímicas são grandes aliadas para a identificação de patógenos nestas infecções e se baseiam na capacidade de as bactérias utilizarem determinados substratos para seu crescimento, ou seja, através do seumetabolismo é possível identificar gêneros ou espécies bacterianas e seu real papel na patogênese das infecções gastrointestinais.
Entre as principais provas bioquímicas, podemos destacar:
TESTE DE OXIDASE
O teste da oxidase verifica se os isolados bacterianos apresentam a enzima citocromo oxidase, estas enzimas estão associadas à cadeia transportadora de elétrons. O teste pode ser realizado pingando uma gota de solução de Dimetil p-fenilenodiamina cloridrato sobre a colônia ou impregnando uma tira de papel filtro com a solução e aplicando a amostra sobre. Comercialmente, tiras de oxidases podem ser compradas. A cor azul/violeta indica positividade no teste. E. coli e demais enterobactérias são negativas, enquanto Campylobacter spp. e Vibrio spp. são positivos.
Teste de oxidase.
FERMENTAÇÃO DE AÇÚCARES
Esse teste é utilizado para saber qual é o metabolismo bacteriano para obtenção de energia: via oxidativa (aeróbica) ou via fermentativa (anaeróbica). Para isso, podem ser utilizadas diferentes fontes de açúcares, como a glicose, a sacarose e a lactose. Bactérias que realizam a fermentação obtêm menos energia e produzem um ácido como produto do seu metabolismo, com possível formação de gás.
Bactérias não-fermentadoras crescerão no meio de cultura, mas não produzem ácido no final e, portanto, não alteram o pH do meio. Bactérias fermentadoras crescerão no meio e produzirão ácido, mudam o pH e alteram a coloração do meio. O meio mais utilizado é o Ágar TSI. A cor original do meio é vermelha, se o meio possui crescimento sem alteração da cor indica que a bactéria é não-fermentadora.
Quando temos a acidificação do meio, este fica amarelado, indicando uma alteração de pH pela produção de ácido e que a bactéria apresenta um metabolismo fermentativo. Também é possível ver a produção de gás e H2S neste meio. A E. coli fermentam a glicose, sacarose e lactose. Salmonella e Shigella fermentam somente a glicose.
Fermentação de açúcares no meio ágar TSI.
PRODUÇÃO DE GÁS SULFÍDRICO OU SULFETO DE HIDROGÊNIO (H2S)
Esse teste detecta a capacidade da bactéria em liberar o enxofre, por ação enzimática, de determinados aminoácidos. Ao realizar esta reação, ocorre a produção de gás sulfídrico ou sulfeto de hidrogênio que reage com íons de ferro ou chumbo contidos no meio, formando um precipitado negro e resultando em positividade para o isolado em questão. Podem ser utilizados para o teste o Ágar TSI (Triplo Açúcar de Ferro), meio SIM (Sulfato de hidrogênio, Indol e Motilidade), meio AIL (Instituto Adolfo Lutz). Grupo bacteriano mais importante em infecções gastrointestinais positivo para este teste inclui a Salmonella spp. e C. difficile.
Ágar TSI do lado esquerdo, negativo para o teste. Ágar TSI lado direito (negro), positivo para o teste.
MOTILIDADE
Este teste não é uma prova bioquímica propriamente dita, mas, sim, fisiológica. Testa a capacidade da bactéria em se mover em meio semissólido devido à presença de flagelos. Os meios mais utilizados para isso incluem o meio SIM, meio MILI (Motilidade, Indol e Lisina). Apresentam motilidade no meio: E. coli, Salmonella spp., Compylobacter spp., Vibrio spp.
Mobilidade bacteriana em meio SIM.
PRODUÇÃO DE INDOL
Verifica a capacidade da degradação do aminoácido triptofano pela produção da enzima triptofanase, resultando na produção de indol, ácido pirúvico e hidróxido de amônia. A produção de indol é detectada, utilizando os reagentes de Kovac (solução de p-dimetilaminobenzadeído) que reagem com indol, formando uma coloração rosa dentro de 5 minutos e dando positividade para o teste. Pode ser realizada no meio SIM ou no meio MILI. E. coli e Vibrio cholerae são positivos.
Produção de indol.
DEGRADAÇÃO DA UREIA
A degradação da ureia ocorre pela ação da enzima urease, bactérias que possuem esta enzima têm a capacidade de degradar a ureia em amônia e CO2. Os meios utilizados para este teste incluem ureia e um indicador de pH. Conforme a ureia é quebrada, o meio torna-se mais alcalino e muda de cor para rosa, mostrando positividade do teste.
Degradação da ureia.
PROVA VERMELHO DE METILA (VM)
Detecta o metabolismo bacteriano. A glicose é a principal fonte de energia celular, algumas bactérias podem utilizar a glicose para obtenção de energia pela via oxidativa (aeróbica) ou pela via fermentativa (anaeróbica). Na via fermentativa, o produto do metabolismo da glicose é um ácido, o qual se acumula no meio, alterando o pH que é observado através de um indicador de pH. Logo, se ocorre alteração de cor, a bactéria é dita fermentadora, caso não, dita oxidativa ou não fermentadora.
Prova VM.
PROVA DE VOGES-PROSKAUER (VP)
Também detecta a via bioquímica da utilização da glicose. As amostras positivas que apresentam o teste positivo utilizam a via fermentativa para degradação da glicose do tipo butilenoglicólica, em que os produtos desta reação são diacetil. A cor avermelhada indica que o teste é positivo e que as bactérias que utilizam a via fermentativa butilenoglicólica. B. cereus apresenta positividade neste teste.
Prova Voges-Proskauer.
UTILIZAÇÃO DE CITRATO
A prova detecta a capacidade de algumas bactérias em utilizar o citrato como única fonte de carbono. O meio comumente utilizado para este teste é o Citrato de Simmons, um meio sólido contendo citrato que tem como indicador de pH, o azul de bromotimol. A entrada do citrato na bactéria e sua degradação pela citratase resulta em oxaloacetato e acetato, alcalinizando o meio. O meio é originalmente verde e, ao ser alcalinizado, muda de cor para o azul. B. cereus, indicando ser positivo.
Citrato de Simmons.
DESCARBOXILAÇÃO DE AMINOÁCIDOS
Algumas bactérias possuem enzimas específicas para descarboxilação de aminoácidos, ou seja, removem CO2 dos aminoácidos, resultando em aminas alcalinas. Os aminoácidos mais utilizados neste teste são a lisina, arginina e ornitina (LAO). São preparados um tubo para cada aminoácido e um tubo controle, sem aminoácidos. Assim as diferentes bactérias podem ter lisina-descarboxilase, arginina-descarboxilase e/ou ornitina-descarboxilase. A atividade de cada uma dessas enzimas será detectada no meio pela alteração de pH e da coloração e comparado com o grupo controle (sem aminoácidos). O meio mais utilizado é o de Moller, que apresenta uma cor violeta quando positivo. E. coli são lisina positiva e variável para arginina e ornitina.
Descarboxilação da lisina. Tubo 1: Cor original do tubo com aminoácido. Tubo 2: Tubo controle, sem aminoácido. Tubo 3: Tubo positivo para descarboxilação da lisina.
ATENÇÃO
Meios adicionais ainda podem ser realizados dependendo da necessidade do laboratório. Algumas características que podem ser observadas com esses meios adicionais são: crescimento em altas concentrações de sal (NaCl), desaminação da fenilalanina, degradação do malonato, entre outros. Além disso, a sorotipagem também é útil para identificação de alguns sorogrupos de enteropatógenos.
SOROTIPAGEM
Detecção de anticorpos específicos contra determinados grupos bacterianos e sua detecção in vitro.
IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA NA COPROCULTURA
VERIFICANDO O APRENDIZADO
MÓDULO 3
Reconhecer os principais procedimentos para o diagnóstico de meningite e das ISTs
INTRODUÇÃO
Apesar do surgimento dos antimicrobianos e de métodos de prevenção, as infecções do Sistema Nervoso Central (SNC) e as Infecções Sexualmente Transmissíveis (ISTs) continuam sendo um risco para muitas pessoas. A detecção dessas doenças tem aumentado de maneira cada vez mais agressiva devido à reemergência da resistência ao tratamento. As infecções do SNC podem apresentar consequências drásticas, pois deixam sequelas, afinal, os neurônios são células que não se regeneram após uma lesão.
As ISTs são todas as infecções transmitidas por contato sexual (oral, vaginal ou anal), mas não só, existem casos de transmissão da mãe para a criança por via transplacentária, durante o parto ou amamentação, além de casos de infecções por contato com lesão ou feridas sobre a pele ou mucosa. Uma ampla gama de patógenos podem estar associados a estas infecções.
Agora, vamos olhar algumasdas principais e mais problemáticas bactérias que apresentam uma elevada preocupação nestas infecções.
MEMBRANAS QUE REVESTEM O SNC
O SNC comanda todas as funções do nosso organismo, até mesmo o ato de pensar e raciocinar, como o que estamos fazendo aqui. Com isso, é possível imaginar a sua importância. Esse sistema é formado por encéfalo (cérebro, cerebelo, bulbo, ponte tálamo e hipotálamo) e medula espinhal, que liga todo o corpo ao encéfalo permitindo os impulsos de movimentos. Tamanha responsabilidade é aceitável que esse sistema esteja muito bem protegido, pois bem, ele está! Temos o crânio e a coluna vertebral exercendo este papel, são estruturas ocas que contêm o líquido cefalorraquidiano e as membranas que revestem esse sistema, conhecidas como meninges.
LÍQUIDO CEFALORRAQUIDIANO
Também conhecido como líquor, é um fluido corporal estéril presente entre as membranas aracnoide e pia-máter.
As meninges revestem todo esse sistema e são compostas por 3 membranas. Após o crânio (tecido ósseo), temos a primeira membrana a dura-máter, no meio temos a aracnoide e em contato com o encéfalo temos a pia-máter. Esse conjunto de membrana formam as meninges que ajudam a proteger este sistema.
A dura-máter é a membrana mais superficial, resistente, vasculariza e inervada. A aracnoide é a mediana, delicada e faz parte da absorção do líquor. A pia-máter é a interna, aderida ao encéfalo e à medula, fina e dando sustentação ao órgão.
Cérebro humano e bactérias meningocócicas.
MENINGITE ASSÉPTICA E BACTERIANA
Meningite é um processo inflamatório infeccioso que acomete as meninges, podendo ser classificada de duas formas:
MENINGITES SÉPTICAS OU BACTERIANAS
São causadas pela presença da bactéria na meninge que estimula um processo inflamatório com seus sinais e sintomas. Este tipo de meningite, geralmente, é mais grave.
MENINGITES ASSÉPTICAS
São as que não são causadas por bactérias, mais, sim, por vírus, fungos, protozoários, entre outros fatores.
As bactérias podem acessar as meninges causando um processo inflamatório através da corrente sanguínea (via hematogênica) após uma infecção primária por pneumonia, infecções de face, garganta, ouvido, nariz ou olhos, ou por infecção sistêmica, como na bacteremia. Uma bactéria pode acessar as meninges também através de traumatismos. Uma vez que esses microrganismos atingem as meninges, inicia-se o processo inflamatório, levando a um infiltrado de células e líquido, gerando uma hipertensão intracraniana. Essas alterações são facilmente percebidas na composição do líquor, que se apresenta turvo nesses casos.
A coleta do líquor é realizada por punção lombar e segue para análises bioquímicas, microbiológicas e citológicas no laboratório. Na análise microbiológica, o tubo é centrifugado e o sedimento utilizado para as análises. Inicialmente, realiza-se uma coloração de Gram e Ziehl e meios de cultura de enriquecimentos são utilizados para o crescimento, como Ágar Sangue e Ágar chocolate. Para suspeita de micobactérias, devemos realizar o cultivo nos meios Ogawa-Kudoh ou Lowentein Jesen. Para anaeróbicos, utilizar o caldo Tioglicolato, com as devidas condições de anaerobiose.
Coleta do líquor.
Os agentes etiológicos mais comuns nas causas da meningite bacteriana podem variar de acordo com a idade do paciente:
	Crianças com menos de 4 semanas de vida incluem as espécies de Streptococcus grupo B (Cocos gram-positivos anaeróbicos facultativos) e algumas enterobactérias, como a E. coli (Bacilo gram-negativo fermentador).
STREPTOCOCCUS GRUPO B
Classificação de Lancefield baseada na composição de antígeno de superfície, ou seja, as proteínas de superfície deste gênero. Cada um recebe uma letra do alfabeto. De acordo com esta classificação, há 20 grupos de Streptococcus, o grupo B inclui a espécie Strpetococcus agalacitae, importante em infecções humanas.
	Crianças entre 4 a 12 semanas, as causas mais comuns incluem Streptococcus grupo B, Streptococcus pneumoniae (Cocos gram-positivos anaeróbicos facultativos), Salmonella spp. (Bacilos gram-negativos fermentadores), L. monocytogenes (Bacilos gram-positivos anaeróbicos facultativos) e Hemophikus influenzae (Cocobacilo gram-negativo).
	Acima de 3 anos as causas mais comuns são Streptococcus pneumoniae e Neisseria meningitidis (Diplococos gram-negativos aeróbicos).
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DIAGNÓSTICO DE MENINGITES BACTERIANAS
ISTS E COLETA DE AMOSTRAS PARA DIAGNÓSTICO
Você certamente já ouviu falar sobre Doenças Sexualmente Transmissíveis, as famosas DSTs. O termo utilizado atualmente é Infecções Sexualmente Transmissíveis, as ISTs. Essa troca ocorreu pelo fato de uma doença ocorrer quando se tem os sinais e sintomas visíveis.
O termo infecção significa a presença do agente etiológico no organismo, ou seja, uma pessoa pode estar infectada, mas não apresentar os sinais e sintomas que caracterizam a doença. Assim, o termo IST reflete melhor a realidade dessas infecções.
Existem mais de 30 agentes etiológicos de ISTs que incluem bactérias, vírus e parasitas. Dentre as diversas ISTs, as mais comuns incluem as causadas por clamídias e a gonorreia, ambas causadas por bactérias. Podendo ocorrer a coinfecção. Isso acontece, pois estas ISTs possuem os mesmos fatores de risco, que incluem sexo com vários parceiros e o não uso de preservativos, e a presença de uma doença parece favorecer uma segunda infecção pela outra.
A Chlamydia trachomatis, popularmente conhecida como clamídia, é uma bactéria gram-negativa, que não se cora pelo método de Gram, intracelular (vive dentro da célula do hospedeiro). Apresenta amplo quadro clínico, que inclui inflamação da uretra (uretrite) nos homens, podendo evoluir para prostatite (infecção na próstata), se migrar pela circulação sanguínea pode chegar até as articulações, gerando a artrite infecciosa, conjuntivite e lesão de pele e mucosas. Nas mulheres, pode causar inflamação da uretra, a uretrite, no epitélio vaginal, a vaginite, e ao atingir o colo do útero, pode gerar uma cervite, e se disseminar, pode gerar ainda a doença inflamatória pélvica, infertilidade e gravidez ectópica. Em gestantes, podem causar problemas de parto precoce e morte neonatal. Em recém-nascidos, pode gerar conjuntivite de inclusão que, se não tratada, pode evoluir para uma pneumonia. A infecção neste caso é adquirida durante o parto através do canal vaginal. A infecção pode gerar dor ao urinar, corrimento amarelo ou turvo devido à formação de pus durante o processo inflamatório, sangramento espontâneo e dor durante a relação sexual.
Chlamydia Trachomatis.
A gonorreia é causada pela bactéria Neisseria gonorrhoeae, gram-negativa na forma de diplococos. Esta IST no homem, quando sintomática, pode apresentar dor ao urinar e secreção amarelo-esverdeada no pênis devido ao processo inflamatório pela presença da bactéria, chamado de uretrite. Se a bactéria chegar até a próstata, desenvolverá uma prostatite. Nas mulheres, as manifestações clínicas são menores e incluem uma vaginite, com dor na área genital, secreção na vagina, maior frequência de urina e dor ao urinar. Se a bactéria atingir o colo do útero, pode gerar uma cervicite (infecção cérvice) e, no útero, gerar a doença inflamatória pélvica. Pode ocorrer também infecções no ânus, levando à formação de pústulas devido ao processo inflamatório desencadeado. O ponto mais grave da doença pode ocorrer quando a N. gonorrhoeae se espalha pelo organismo gerando artrite infecciosa. Recém-nascidos podem se contaminar durante o parto e desenvolver um quadro de conjuntivite que pode evoluir para pneumonia e/ou meningite.
Lâmina de Gram mostrando diplococos gram-negativos sugestivos de N.gnorrhoeae.
Como é possível perceber, os sinais e sintomas destas ISTs são similares, sendo necessário um diagnóstico para sua correta identificação. A coleta para o diagnóstico de ambas as ISTs ocorrem de modo similar. Pode se utilizar secreção uretral, secreção endocervical, esperma, secreção ocular para conjuntivite em recém-nascido, secreção anal parainfecção anal, a urina pode ser utilizada quando a secreção uretral estiver escassa.
RECOMENDAÇÃO
Deve-se coletar, preferencialmente, antes do uso de antimicrobianos. Na secreção de uretra, deve-se colher durante a manhã e antes de urinar ou com intervalo de 4 horas após urinar. Durante a coleta, não realizar o uso de antissépticos, não ter relações sexuais nas últimas 24 horas e, em caso de menstruação, aguardar 48 horas ou até o término. Além da secreção, também pode ser colhido com swab endocervical ou uretral e a coleta de urina deve ser referente ao primeiro jato do dia.
TESTE PARA DIAGNOSTICO DE INFECÇÕES POR CHLAMYDIA E URETRITE GONOCÓCICA
Existem várias metodologias para o diagnostico destas ISTs e incluem meios de cultura, testes imunológicos (detecção de anticorpos ou antígenos) e testes moleculares (detecção do material genético da bactéria). As vantagens de se realizar a cultura incluem a preservação da bactéria para estudos adicionais, como o antibiograma e estudos de epidemiologia.
TESTES PARA O DIAGNÓSTICO DE C. TRACHOMATIS
C. trachomatis é uma bactéria de difícil cultivo devido ao fato de viver dentro das células do hospedeiro. Desse modo, para este patógeno, é recomendado o uso de testes imunológicos ou testes moleculares, sendo os testes moleculares ainda mais capazes de detectar a bactéria do que os imunológicos. Métodos de coloração direta não são possíveis devido ao pequeno tamanho da bactéria e sua vida intracelular.
A cultura de Chlamydia em laboratório é algo dispendioso e requer muitos cuidados. Pelo fato de ser uma bactéria intracelular, o cultivo de uma célula eucarionte é necessário para que elas consigam crescer. Assim, é realizada a cultura de células das linhagens McCoy, HeLa 229 ou BHK, em que a amostra coletada é inoculada sobre a superfície destas células. Após 3 dias de incubação, é realizada a coloração por iodo ou Giemsa, buscando as alterações celulares causadas pela presença da Chlamydia, como a presença de corpúsculos de inclusão citoplasmáticos (vacúolos citoplasmáticos). Por esse motivo, os testes moleculares se tornam úteis para o diagnóstico na maioria dos laboratórios, tendo boa sensibilidade e especificidade.
CÉLULAS MCCOY
Linhagem de células do tipo fibroblastos obtidas de camundongos.
CÉLULAS HELA 229
Linhagem de células humanas obtidas de um adenocarcinoma cervical.
CÉLULAS BHK
Linhagem de células obtidas de fibroblastos renais de hamster.
TESTES PARA O DIAGNÓSTICO DE NEISSERIA GONORRHOEAE
No caso de suspeita de uretrite gonocócica, pode-se utilizar métodos de cultura, testes imunológicos ou moleculares, porém nestas bactérias os testes de cultura respondem bem aos achados. A coloração de Gram pode ser realizada para visualização dos diplococos gram-negativos característicos desta espécie e a coleta é realizada utilizando o meio de Aimes, pois preserva o diplococo de forma viável até as análises, o gonocócico é considerado uma bactéria exigente e, sem os devidos cuidados, pode morrer facilmente atrapalhando no correto diagnóstico.
SEMEADURA DE AMOSTRAS SUSPEITAS DE N. GONORRHOEAE E OUTROS AGENTES
No caso de suspeita de N. gonorrhoeae, o meio de cultura para semeadura mais utilizado é o Thayer-Martin modificado (meio enriquecido e seletivo). Este meio possui antibióticos que permitem o crescimento seletivo desta bactéria. A amostra pode ser semeada também em Ágar Chocolate para detecção de outras espécies de Neisseria spp. que, por ventura, não cresçam no meio Tayer-Martin. Após a semeadura pela técnica de esgotamento, os meios de cultura serão incubados em temperatura de 35°C com umidade em torno de 90% e atmosfera de 3-7% de CO2. Após o crescimento, é realizada a coloração de Gram (para confirmar a morfologia), prova da catalase (resultado positivo pela formação de bolhas), prova da oxidase (oxidase positiva) e fermentação de açúcares (fermenta a glicose). Sendo então confirmado o diagnóstico para N. gonorrhoeae.
PROVA DA CATALASE
Detecta a presença da enzima catalase, responsável pela quebra de radicais de oxigênio, como o peróxido de hidrogênio (água oxigenada), em água e oxigênio. Quando positivo, observa-se a presença de bolhas proveniente do oxigênio. Esta prova é importante para diferenciação de gêneros de bactérias Gram-positivas.
ATENÇÃO
As uretrites podem ter diferentes causas, sendo a mais comum as ISTs causadas pela N. gonorrheae. Aquelas que não são causadas por este agente etiológico são ditas não gonocócicas. A uretrite não gonocócica mais comum é a causada pela C. trachomatis já comentada aqui, enquanto outros microrganismos menos frequentes podem causar este quadro infeccioso incluem Ureoplasma ureatylium, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma homins, Staphylococcus aureus, Candida albicans (fungo), Gardnerella vaginalis. Para exclusão de diagnóstico por estes agentes etiológicos, pode-se usar a semeadura em meios de cultura como Ágar Sangue e Ágar MacConkey e coloração de Gram.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
CONCLUSÃO
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Observamos as principais bactérias associadas a infecções sistêmicas e suas possíveis consequências, os principais patógenos associados a casos de diarreia no Brasil e no mundo, a problemática das infecções do SNC e os sinais clínicos similares de algumas ISTs prevalentes e sua importância no diagnóstico por cultura, tanto para epidemiologia, quanto para determinação da melhor opção de tratamento pelo antibiograma. A cultura bacteriana continua a ser usada por muitos laboratórios e com algumas particularidades, dependendo do local de diagnóstico.