Isolamento de Bactérias - Microbiologia Industrial

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Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
Centro de Tecnologia e Geociências (CTG)
Departamento de Engenharia Química (DEQ)
Química Industrial - Microbiologia Industrial 2022.1
Docente: Sara Horacio De Oliveira Maciel
Discentes: Ana Paula, Fábio Gabriel, Gabriel Eliseu, Maria Eduarda
Pereira e Samyra Letícia
PRÁTICA 1: ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS
Resumo. Esse relatório demonstra a prática das principais técnicas de semeadura, a
compreensão dos materiais utilizados para isolamento de microrganismos e a elucidação
das boas práticas de manipulação de microorganismos. Tendo como objetivo a análise
de culturas que foram isoladas, com o principal objetivo de avaliar parâmetros
microbiológicos referentes à legislação.
Palavras chave: semeadura; isolamento; microorganismos.
Introdução
O isolamento de microrganismos
consiste na obtenção de uma cultura pura e
geralmente tem como finalidade a
identificação do mesmo.[¹]
A maioria dos materiais infecciosos,
bem como amostra de solos, água ou
alimento, contém diversos tipos de bactérias.
Quando é feita a semeadura desses materiais
na superfície de meio sólido, as
colônias formam cópias exatas do
organismo original.[¹]
Acredita-se que uma colônia visível
provavelmente vem de um único esporo ou
célula vegetativa ou de um grupo dos
mesmos microrganismos juntos em
agregados ou cadeias. Já as colônias
microbianas frequentemente têm aparência
diferente, o que permite distinguir um
micro-organismo do outro. Para que essas
colônias possam ser separadas umas
das outras, as bactérias devem ser
espalhadas de maneira suficientemente
ampla na placa.[¹]
A maioria dos trabalhos de
microbiologia requer culturas puras ou
clones da bactéria. O método de
isolamento mais comumente utilizado para
obter culturas puras é o método de
esgotamento por estrias, onde uma alça de
inoculação estéril é mergulhada dentro de
uma cultura mista, contendo mais de um tipo
de microrganismo, e é semeada em estrias
na superfície de um meio nutritivo.[²]
Ao longo da estria, as bactérias são
depositadas quando a alça entra em contato
com o meio. As últimas células depositadas
na alça são afastadas o suficiente para
crescer em colônias isoladas. Essas
colônias podem ser retiradas com uma alça
de inoculação e transferidas para um tubo de
ensaio com meio nutritivo para a obtenção
de uma cultura pura contendo somente um
tipo de bactéria.[²]
O método de esgotamento por estrias
funciona bem quando o organismo a ser
isolado está presente em grande número em
relação à população total. Contudo, quando o
microrganismo a ser isolado está presente em
um número muito pequeno, sua quantidade
pode ser aumentada por enriquecimento
seletivo antes do isolamento com o método
de esgotamento por estrias.[²]
Outra técnica bastante utilizada é a
semeadura por espalhamento em placa, onde
um inóculo é adicionado à superfície de um
meio de ágar previamente solidificado. O
inóculo é então espalhado de modo uniforme
com um bastão de vidro em L esterilizado.
Esse método espalha todas as colônias na
superfície, portanto as células só irão crescer
na superfície do meio, podendo ser feita a
identificação de colônias isoladas.[²]
Procedimento Experimental
Para a prática em questão serão
necessários o seguintes materiais:
- Amostra de água poluída
- Erlenmeyer de 100mL
- Água estéril
- 4 tubos de ensaio contendo contendo
9 ml de água estéril
- Meio de cultura Ágar Nutritivo (AN)
- Placas de Petri esterilizadas
- Tubos de ensaio com meio AN
- Pipeta de 1mL estéril
- Alça de platina
A amostra de água poluída para essa
prática foi tirada do lago localizado nas
dependências da UFPE. Também é
importante salientar que o erlenmeyer deve
conter previamente um volume de 99 mL de
água estéril. Da mesma forma, os tubos de
ensaio devem conter previamente 9 mL de
água estéril para que a prática se inicie com
suas respectivas diluições.
No primeiro dia da prática, deve-se
preparar as diluições. A primeira etapa
consiste na adição de 1 mL da amostra de
água no erlenmeyer onde o mesmo é
homogeneizado para obter a suspensão dos
microrganismos. Em seguida, deve-se
transferir com o auxílio de um pipeta estéril,
1 ml da suspensão para um dos tubos de
ensaio contendo água estéril e agitar. Após,
deve-se transferir 1 mL da suspensão do
1
primeiro tubo para um segundo tubo e assim
sucessivamente. Dessa forma, temos
diluições de 10 -2 , 10 -3 ,10 -4 ,10 -5.
A próxima etapa consiste em
transferir do conteúdo de cada tubo de
ensaio, com diferentes concentrações, 1 mL
para 2 placas de petri (duplicata) e adicionar
aproximadamente 15 mL AN resfriado e
realizar leves movimentos circulares na placa
para homogeneização e aguardar
aproximadamente 3 minutos até que a
solução se solidifique. Em seguida,
inverte-se as placas e deve-se incubar as
mesmas em temperatura ambiente por 48
horas.
O segundo dia da prática consiste em
observar o crescimento das colônias bem
como suas características principais. Cada
integrante do grupo deve escolher em uma
placa uma colônia onde devem ser notados
aspectos macroscópicos, sendo os principais:
tamanho, cor, forma, consistência,
características da superfície da colônia,
brilho e presença de pigmento solúvel.
Após, deve-se transferir, com alça de
platina, uma amostra da colônia escolhida
para um tubo contendo AN e incubar em
temperatura ambiente.
No terceiro e último dia, foi
observado o crescimento no tubo de cultura
preparado no segundo dia, foi preparado a
lâmina “in vivo” a fim de observar se há
movimento. E por fim, realizou-se uma
coloração de Gram.
Resultados e Discussão
Tendo sido realizado todo o
procedimento experimental, pode-se discutir
os seguintes aspectos sobre as colônias das
placas de petri que foram escolhidas para
análise macroscópica.
1. Para a 10-2A:
Foi possível observar a presença de
colônias bordas regulares, uma aparência
leitosa, brilhosa e de coloração branca, como
mostrado na imagem 1:
Imagem 1: colônia escolhida para a análise.
2. Para a 10-2B:
Foi possível observar a presença de
colônias com pigmentação amarela solúvel,
com a presença de bordas irregulares de
aparência leitosa, brilhosa e de coloração
branca, como mostrado na imagem 2:
2
Imagem 2: colônia escolhida para a análise.
3. Para a 10-3B:
Foi possível observar a presença de
colônias bordas regulares, de coloração
amarela com aparência leitosa e brilhosa,
como mostrado na imagem 3:
Imagem 3: colônia escolhida para a análise.
4. Para a 10-4B:
Foi possível observar a presença de
colônias bordas regulares, de coloração
branca e aparência opaca, como mostrado na
imagem 4:
Imagem 4: colônia escolhida para a análise.
5. Para a 10-5B:
Foi possível observar a presença de
colônias bordas regulares, de coloração
amarela com aparência e brilhosa, como
mostrado na imagem 5:
Imagem 5: colônia escolhida para a análise.
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Após as análises macroscópicas,
foram escolhidas as colônias sinalizadas nas
imagens para a inoculação no tubo de ensaio,
por meio da técnica de semeadura por
estrias, e obtivemos resultados mostrados
nas seguintes imagens::
1. Para a 10-2A:
Imagem 6: Crescimento das colônias.
2. Para a 10-2B:
Imagem 7: crescimento das colônias.
3. Para a 10-3B:
Imagem 7: crescimento das colônias.
4. Para a 10-4B:
Não foi possível observar o
crescimento da cultura. Alguns fatores
podem ter influenciado neste resultado,
como o uso da alça de platina muito quente,
que pode ter matado todos os
microrganismos.
5. Para a 10-5B:
Imagem 8: crescimento das colônias.
4
Em seguida, fizemos a análise por
meio da técnica de observação “in vivo” de
uma das colônias, a fim de analisar se havia
mobilidade. Escolhemos a amostra com
diluição 10-2A. Foi possível observar que
as bactérias não tinham motilidade, a
única motilidade observada foi
totalmente responsável pela água.
Ao fim do processo, foi feito o
processo de coloração de Gram, para
observarmos ascolônias de forma
microscópica. Obtivemos a seguintes
visualização e os seguintes resultados para a
coloração:
1. Para a 10-2A:
Após a análise, chegamos à
conclusão de que eram bacilos Gram
negativos, mostrados na imagem 9.
Imagem 9: observação microscópica da colônia.
2. Para a 10-2B:
Após a análise, chegamos à
conclusão de que eram bacilos Gram
negativos, mostrados na imagem 10.
Imagem 10: observação microscópica da colônia.
3. Para a 10-3B:
Após a análise, chegamos à
conclusão de que eram bacilos Gram
negativos, mostrados na imagem 11.
Imagem 11: observação microscópica da colônia.
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4. Para a 10-5B:
Após a análise, chegamos à
conclusão de que eram cocos Gram
negativos, mostrados na imagem 12.
Imagem 12: observação microscópica da colônia.
Conclusão
Após a realização das etapas
laboratoriais de isolamento dos
microrganismos pode-se concluir que o
método por isolamento nos permite, através
de técnicas eficientes, a obtenção de culturas
puras, que por sua vez, auxiliam na
identificação dos microorganismos.
O que é um grande passo para estudos
microbiológicos. Ficou claro que não é
um procedimento simples, o que exige
bastante cautela, atenção e
responsabilidade do manipulador.
Tendo sido analisado todo o procedimento
experimental em si, algumas culturas
apresentam aspectos específicos entte si.
Além disso, é possível salientar que o
seguimento do procedimento de forma
correta é o principal fator para os
considerados acertos no experimento.
Foi comprovado de forma prática , que um
mau utensílio do esfregaço por exemplo não
proporciona a análise e o crescimento do
microbiota.
Envolvendo também o aspecto de uma
mesma causa básica pode demonstrar
diversos aspectos macroscópicos diferentes
mas microscopicamente iguais, sendo o
resultado uma cultura de cocos gram
negativos.
Neste caso também, o método de coloração
auxilia no objetivo final da prática, em
analisar o comportamento das culturas,
sendo comparado com o in vitro.
Conclui-se então que o isolamento de
culturas é um parâmetro base para a área de
microbiologia pois pode ser replicado em
larga escala para diferentes tipos de
amostras, as quais envolvem uma imensidão
de microrganismos úteis ao nosso
conhecimento.
Referências
1. TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.;
CASE, C. L. Microbiologia. 10.
ed. Porto Alegre: Artmed, 2012.
2. Guanabara Koogan, 2012.T.,
MADIGAN, Michael, MARTINKO,
6
John M., DUNPLAP, Paul V., and
CLARK, David P.Microbiologia de
Brock, 12ª edição. ArtMed, 2011
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