Relatório 2 Microbiologia de Alimentos

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Universidade Federal do Oeste da Bahia
Centro das Ciências Biológicas e da Saúde
Microbiologia Aplicada aos Alimentos (CBS 1027)
Relatório 2 - Efeito da concentração de solutos, do pH e da temperatura
sobre o crescimento de microrganismos
Discentes: Anna Flávia Bezerra Penha, Galathe Farida Ahocame Allotongnon,
Jeferson e Lucas Coqueiro de Souza.
BARREIRAS-BA
2022
1. INTRODUÇÃO
Microrganismos como as bactérias têm um crescimento rápido e exponencial.
Isso se deve ao fato de que as células microbianas possuem uma vida curta, de
modo que a sobrevivência de determinada bactéria somente é possível pelo
crescimento contínuo das células (BROCK, 2016).
Quando se fala em crescimento microbiano, esse termo se refere ao aumento
do número de células daquele microrganismo, não do tamanho das células. E esse
processo ocorre por meio de fissão binária. Processo onde ocorre a síntese de todo
o conteúdo celular dentro da célula-mãe, que posteriormente se divide em duas
células filhas (BROCK, 2016).
Para que o crescimento microbiano possa ocorrer de maneira adequada
diversos fatores são necessários e podem interferir diretamente na sobrevivência do
microrganismo. Além disso, as condições de cada um desses fatores podem variar
entre as diferentes espécies bacterianas, de modo que, fatores que auxiliam no
crescimento de uma espécie podem ser os mesmos que levam à morte de outra
(TORTORA, 2017).
É possível dividir os fatores que interferem no crescimento microbiano em
dois grupos: fatores ambientais e fatores químicos. Aqueles considerados fatores
ambientais são variáveis do ambiente onde a bactéria está exposta que irão afetar o
seu crescimento, como a temperatura, o pH do meio, a pressão osmótica e a
presença de oxigênio. Já os fatores químicos são compostos que, em sua ausência,
irão inviabilizar o crescimento do microrganismo, como a água, o carbono,
nitrogênio, enxofre, fósforo e alguns elementos-traço (TORTORA, 2017).
Um fator determinante no crescimento de uma bactéria é a presença de
solutos no meio onde ela está. Para que a maioria das reações químicas
necessárias para a sobrevivência de qualquer organismo aconteça há a
necessidade de água. A disponibilidade da água para o microrganismo é chamada
de “atividade de água”, que desconsidera aquela água que interage com outros
compostos. A presença de solutos no meio reduz a atividade de água, o que
dificulta o crescimento de alguns microrganismos (BROCK 2016).
Entretanto, algumas bactérias se beneficiam da presença de solutos no meio
em que ela está presente. De modo que é possível classificar os microrganismos
em categorias de acordo com a sua capacidade de crescimento na presença de
solutos. Sendo halófilos aqueles que crescem na presença de NaCl, halotolerantes
aqueles que não precisam de NaCl para crescer, mas conseguem sobreviver na
presença desse soluto, halófilos extremos aqueles que necessitam de altas
concentrações de soluto para seu crescimento e não halófilos aqueles que não são
capazes de crescer na presença de soluto (BROCK 2016).
Outro fator que irá interferir diretamente na no crescimento bacteriano é o pH
do meio em que as células se encontram. A maioria das bactérias irá crescer bem
em um pH próximo da neutralidade. Porém existem alguns microrganismos que
crescem bem em meios ácidos (pH menor que 5) e são chamado de acidófilos, ao
passo que existem alguns que também crescem bem em meios mais alcalinos (pH
acima de 8) e são chamados de alcalifílicos (BROCK 2016).
Além disso, a temperatura também é um fator extremamente importante para
o crescimento de qualquer microrganismo. Cada microrganismo tem uma
temperatura ótima de crescimento que irá favorecer o seu desenvolvimento, bem
como uma temperatura mínima de crescimento e uma temperatura máxima de
crescimento. Quando um microrganismo se encontra em um ambiente de
temperatura acima da sua temperatura máxima de crescimento essa célula irá
morrer, porém quando ela se encontra em uma temperatura inferior à sua mínima de
crescimento ela ficará paralisada, incapaz de se reproduzir, podem permanecerá
viva, de modo que, ao se restabelecer uma temperatura ideal para seu crescimento
essa célula voltará a crescer (TORTORA, 2017).
Com base na faixa de crescimento dos microrganismos, eles podem ser
classificados em: psicrófilos (-10ºC a 20ºC), psicrotróficos (0ºC a 30ºC), mesófilos
(10ºC a 50ºC), termófilos (40ºC a 70ºC) e hipertermófilos (65ºC a 110ºC)
(TORTORA, 2017).
O presente trabalho buscou avaliar o efeito de três fatores no crescimento de
diferentes microrganismos. Foram avaliados bactérias, fungos e leveduras em
diferentes condições de pH, temperatura e concentração de soluto.
2. OBJETIVOS
➢ Demonstrar o efeito da concentração de solutos e pressão osmótica sobre o
crescimento microbiano.
➢ Demonstrar o efeito do pH sobre o crescimento microbiano.
➢ Demonstrar o efeito da temperatura sobre o crescimento microbiano.
3. METODOLOGIA
3.1 Prática efeito da concentração de solutos no crescimento de
microorganismos
As placas, contendo ágar nutriente + sacarose e ágar nutriente + NaCl
possuíam as seguintes concentrações: 5%, 10% e 25% para NaCl e 15%, 30% e
60% para sacarose. Ambas foram divididas em quadrantes (4 partes iguais), cada
um para inoculação de um microrganismo. Os microrganismos: levedura, serratia
(bactéria gram-negativa), S. aureus (bactéria gram-positiva) e fungo, foram
inoculados próximo a uma lamparina com o auxílio de uma alça de repicagem
previamente esterilizada e posteriormente incubados a 30ºC para serem observados
os resultados na aula prática seguinte.
Além disso, a professora realizou o preparo de tubos de ensaio com
diferentes concentrações de caldo nutriente + Sacarose com 2 frutas distintas e
outros tubos de ensaio contendo caldo nutritivo + NaCl com abobrinha e outro com
carne que também foram incubados a 30ºC e posteriormente observados os
resultados.
3.2 Prática efeito do pH sobre o crescimento de microorganismos
Nessa prática, foram utilizadas placas de Petri contendo ágar nutriente com
diferentes valores de pH 3; 4,5; 5,5; 7 e 9 e também as placas com pH= 4,5 foram
ajustadas com ácido acético, ácido propiônico, ácido lático e HCl. Cada placa foi
dividida e identificada em quadrantes com os nomes dos diferentes microrganismos
a serem inoculados. Procedeu-se a repicagem das culturas com a alça perto da
chama e foram incubadas a 30°C e posteriormente observados os resultados.
3.3 Prática efeito da temperatura sobre o crescimento de microorganismos
Nesta prática foram usados tubos contendo água nutriente inclinado para
inocular culturas de quatro diferentes microrganismos em cinco faixas de
temperaturas (10, 25, 37, 45 e 65 °C). Com isso, para cada microrganismo fizemos
estrias no ágar de 5 tubos, totalizando 20 tubos inoculados em suas respectivas
temperaturas. Após período de incubação, analisamos os resultados da intensidade
de crescimento da cultura em cada temperatura e classificamos estes
microrganismos.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Prática efeito da concentração de solutos no crescimento de
microorganismos
A disponibilidade de água no meio e a concentração de solutos como
açúcares e sais, são importantes para o crescimento microbiano (MADIGAN et al.,
2016). Dessa maneira, a partir dos resultados dessa prática buscou-se observar de
que forma a presença de diferentes solutos influencia no crescimento microbiano.
➢ Considerações sobre a placa controle:
A placa controle, onde só havia o meio de cultura sem a adição de solutos,
serviu como nosso padrão de comparação, pois ela nos mostra que o efeito dos
nossos resultados realmente é por conta das modificações que foram inseridas.
Foto 1: Resultado da placa controle sem adição de solutos
Fonte: Autor
Normalmente quem cresce com coloração vermelha é Serratia e quem
cresce amarelo claro é S. aureus, o que nos mostra que pode ter ocorrido uma troca
de quadrante sem querer na hora da realização da estria ou que otubo da cultura
estava com uma identificação errada. Além disso, houve contaminação da própria
cultura, pois observamos pigmentação vermelha em toda borda da placa,
provavelmente por conta da coleta em grande quantidade fazendo com que o
microrganismo escorresse sobre a placa.
Em relação a intensidade de crescimento, ambas as bactérias cresceram
bem, já o fungo não cresceu bem e a levedura não cresceu nada, que pode ser
resultado de um meio inadequado ou de um erro de procedimento, onde a alça de
repicagem poderia estar com temperatura elevada ocasionando a morte das
leveduras. Ademais pode ser simplesmente um comportamento anormal da própria
cultura.
➢ Considerações sobre as placas com Sacarose 15%, 30% e 60%:
Foto 2: Placa 15% de sacarose
Fonte: Autor
Foto 3: Placa 30% de sacarose
Fonte: Autor
Foto 4: Placa 60% sacarose
Fonte: Autor
15% → Serratia (cresceu pigmentada), S. aureus (cresceu), Fungo ( cresceu) e na
levedura não conseguiu se observar nada.
30% → Serratia (não cresceu pigmentada, por conta da concentração de soluto no
meio que influenciou na modulação desse fenótipo), S.aureus (cresceu), fungo
(cresceu) e leveduras não apresentaram crescimento.
60% → Serratia, S. aureus e cresceram menos, fungo (cresceu) e levedura não
cresceu.
Com esses resultados é possível perceber que a concentração de soluto no
meio interferiu, já que foi observado que ao adicionar mais sacarose o crescimento
microbiano foi inibido, pois houve uma redução de Serratia e S. aureus ao chegar
aos 60%. Além disso, o fungo demonstrou precisar de mais sacarose para crescer.
A literatura nos diz que existem organismos que podem tolerar um certo grau
de solutos dissolvidos na água, mas que estes apresentam um melhor
desenvolvimento quando não há adição de soluto, denominados como
halotolerantes. Há também, os organismos que se desenvolvem bem em ambientes
com altas pressões osmóticas, como altas concentrações de açúcar que são os
chamados de osmofílicos (MADIGAN et al., 2016).
Seguindo essa linha de raciocínio, percebe-se que microrganismos como a
Serratia são halotolerantes pois apesar de perderem sua capacidade de
pigmentação conseguem tolerar um aumento na quantidade de soluto. Ademais, no
caso do fungo, percebe-se que trata-se de um microrganismos osmófilo visto que
necessitaria de uma concentração maior de sacarose para crescer.
➢ Considerações sobre as placas com NaCl nas concentrações 5%, 10% e
25%:
Foto 5: Placa 5% de NaCl
Fonte: Autor
Foto 6: Placa 10% de NaCl
Fonte: Autor
Foto 7: Placa 25% de NaCl
Fonte: Autor
5% → Serratia e S. aureus cresceram já em fungos e levedura não consegue se ver
nada.
10% → S. aureus continua crescendo, mostrando sua tolerância a esse aumento na
concentração de soluto. Já Serratia, fungo e levedura não crescem.
25% → Ninguém cresce.
Desse modo, percebe-se que o sal promoveu inibição que paralisou completamente
o crescimento. O sal é melhor para inibir por que ele cria um ambiente hipertônico,
reduzindo a atividade de água para os microrganismos. O sal se ioniza por isso tem
maior capacidade de interagir com as moléculas de água.
➢ Considerações sobre as amostras de alimentos em tubos de ensaio:
Tubos de 0%, 15%, 30% e 60% de sacarose com maçã e uva:
Foto 8:Tubo 0%,15%,30% e 60% de sacarose com uva
Fonte: Autor
Foto 9:Tubo 0%,15%,30% e 60% de sacarose com maça
Fonte: Autor
Observou-se a redução do crescimento microbiano com diminuição da
turbidez no fim do tubo nas maiores concentrações. No tubo de maior concentração
(60%) observa-se uma coloração límpida praticamente igual ao meio de cultura.
Tubos com NaCl de 0% a 25% com abobrinha e carne:
Foto 10:Tubos com abobrinha
Fonte: Autor
Foto 11: Tubos com carne
Fonte: Autor
Também foi observado redução do crescimento. No tubo com 25% de NaCl
se observa o meio limpo e a abobrinha com a mesma aparência de quando foi
inoculada. No caso da carne, apesar da coloração que dificulta a visualização da
turbidez, também foi observada a inibição do crescimento microbiano.
4.2 Prática efeito do pH sobre o crescimento de microorganismos
Entre os fatores que dificultam o desenvolvimento de microrganismos em um
meio, há o pH que possui uma ação direta na atividade enzimática. Segundo
PINTO; LANDGRAF; FRANCO, (2018) grande parte dos microrganismos
deterioradores possuem a capacidade de se multiplicar em uma faixa de pH próximo
a neutralidade.
Os resultados observados do efeito do pH sobre os microrganismos utilizados
(Staphylococcus aureus, Serratia marcescens, fungo ou levedura) estão
apresentados na tabela seguinte:
Tabela 1: Resultados do crescimento dos microrganismos em diferentes pH
Microrganismos pH=3 pH=4,5 pH=5,5 pH=7 pH=9
S. aureus - + + + +
Serratia marcescens - + + + +
Fungo - - - - -
Levedura - + + + +
.
Na placa 1 com pH = 3, não ocorreu nenhum crescimento microbiano:
Foto 12: Placa com pH 3
Fonte: Autor
Na placa 2 com pH = 4,5 com HCl observa-se o crescimento das bactérias e da
levedura:
Foto 13: Placa com pH 4,5
Fonte: Autor
Na placa 3 com pH = 5,5 observa-se também crescimento de bactérias e levedura:
Foto 14: Placa com pH 5,5
Fonte: Autor
Na placa controle pH= 7, o fungo não cresceu devido sua aderência por esse meio
de cultura. Normalmente é um meio adequado para crescimento de fungo porém
como não cresceu, os resultados de fungos nas outras placas não foram
considerados:
Foto 15: Placa com pH=7
Fonte: Autor
Observa-se na placa com pH = 9 apenas crescimento de bactérias e levedura:
Foto 16: Placa com pH=09
Fonte: Autor
Além disso, foram testados mais três ácidos (ácido acético, ácido propiônico,
ácido lático na placa com pH = 4,5 onde se observa crescimento microbiano
somente nas placas contendo ácido lático e HCl:
Foto 17: Placas de pH 4,5 com ácido acético, ácido propiônico, ácido lático
Fonte: Autor
Por fim, os resultados desses testes indicaram que na presença do ácido
acético e do ácido propiônico houve inibição do crescimento de todos os
microrganismos. Já na presença de ácido lático e do ácido clorídrico, observamos o
crescimento das bactérias e da levedura. Isso pode ser explicado pelo valor
constante de acidez . Quanto maior o valor do pKa mais é a forma não dissociada
das moléculas, ou seja, o par maior favorece a ionização na célula e
consequentemente a acidificação do meio que inibe o crescimento microbiano.
4.3 Prática efeito da temperatura sobre o crescimento de microorganismos
Com os resultados, observou-se que a temperatura de inoculação interfere
no crescimento microbianos, pois cada espécie tem sua faixa de temperatura ótima
para o crescimento. Este fator afeta diretamente as reações enzimáticas dos
microrganismos e a funcionalidade e estrutura dos seus sistemas membranares.
Em consequência disso se tem um desaceleramento de crescimento em dada
temperatura podendo ser até letal para a célula (NICOLAU, 2014).
Os resultados de crescimento e características da colônia observados estão
listados na tabela abaixo, com suas respectivas temperaturas que foram inoculadas:
Tabela 2: Resultados do crescimento dos microrganismos em diferentes temperaturas.
Microrganismo: 10°C 25°C 35°C 45°C 65°C
A + - - - -
B +* +* + - -
C - + + - -
D - - - - +
Legenda:
+ = Houve crescimento de colônias
- = Não houve crescimento de colônias
+* = Houve crescimento de colônias com pigmento
➢ Considerações sobre o efeito da temperatura no microrganismo A:
Figura 18 - Resultado dos tubos incubados com o microrganismo A
Fonte: Autor
Nos meios de cultura incubados com o microrganismo A ocorreu crescimento
apenas no tubo da temperatura de 10°C, porém cresceu bem pouco e as colônias
situadas na parte superior do ágar. Sendo assim, este poderia ser um problema na
realização da estria que provavelmente a alça chegou apenas nesta região. Além
disso, com a observação de crescimento apenas em baixa temperatura, pode-se
dizer que o microrganismo A é um psicrófilo. (citação do que é um psicrófilo)
Em relação aos outros tubos de temperaturas maiores (25°C,35°C, 45°C e
65°C), vale ressaltar que caso incubados posteriormente na temperatura ideal deste
microrganismo psicrófilo não haveria crescimento. Isso se deve ao fato de que
mesmo inoculado anteriormente em temperatura mais baixa (25°C), esse
microrganismo em temperatura superior a máxima de crescimento ideal ocorre
desnaturação de proteínas e morte.
➢ Considerações sobre o efeito da temperatura no microrganismo B:
Figura 19 - Resultado dos tubos incubados com o microrganismo B
Fonte: Autor
Para o microrganismo B ocorreu crescimento e produção de pigmento em
suas colônias nas temperaturas de 10°C e 25°C. Já em 35°C houve apenas
crescimento sem pigmentação. Isso se deve ao fato de alguns microrganismos
regularem a sua produção de toxinas, que nesse caso são pigmentadas, de acordo
com a condição de temperatura em que ele está. Portanto, para o microrganismo B
a faixa ideal de produção de toxinas é em temperaturas mais baixas e pode ser
classificado como um psicrófilo.
Caso esse microrganismo esteja deteriorando um alimento nessas faixas de
temperatura é possível a observação de contaminação pelo pigmento.
➢ Conclusões sobre o efeito da temperatura no microrganismo C:
Figura 20 - Resultado dos tubos incubados com o microrganismo C
Fonte: Autor
Observando o microrganismo C, houve apenas crescimento nas
temperaturas de 25°C e 35°C, por isso classificado como mesófilo.
➢ Considerações sobre o efeito da temperatura no microrganismo D:
Figura 21 - Resultado dos tubos incubados com o microrganismo D
Fonte: Autor
Para o microrganismo D foi observado o crescimento apenas na inoculação a
65°C, sendo classificado como termófilo. Este microrganismo em temperaturas
menores que a sua ideal de crescimento passa por gelificação da membrana
plasmática, e nos casos onde esse processo não mata a célula, quando colocado
novamente em sua temperatura ideal é possível observar o crescimento.
CONCLUSÃO
O presente trabalho confirmou que os três fatores: concentração de solutos,
pH e temperatura influenciam no crescimento de diferentes microrganismos. Esse
conhecimento é de grande valia pois permite prever a estabilidade microbiológica,
bem como conhecer a capacidade de crescimento e/ou a produção de toxinas dos
microrganismos.
No caso da concentração de solutos, observamos que ela influencia de forma
diferente a diferentes tipos de microrganismos, visto que o fungo por exemplo
necessitaria de mais sacarose para se desenvolver, já as bactérias Serratia e
S.aureus apesar de terem tido a capacidade de crescer e tolerar um aumento de
concentração no meio, são inibidas em grandes concentrações ela pode agir
inibindo o crescimento microbiano.
Ademais, em relação aos resultados obtidos sobre a influência do pH,
observou-se que os microrganismos não conseguem crescer em condições muito
ácidas, como indicou o resultado para todos os microrganismos na placa de pH=3.
Também foi notado que diferentes tipos de ácidos, influenciam de formas distintas
pois na presença de ácido acético e propiônico houve inibição do crescimento de
todos os microrganismos enquanto na presença de ácido lático e de ácido clorídrico
se observou crescimento das bactérias e da levedura.
Por fim, na prática em que os microrganismos foram incubados em diferentes
temperaturas, pode-se observar a influência de características ambientais como a
temperatura no crescimento microbiano. Sendo demonstrado que cada
microrganismos têm sua temperatura ótima de crescimento, que permite que os
classifique como: termófilos, psicrófilos, mesófilos e psicotróficos. Com essa
informação é possível planejar meios de conservação de alimentos envolvendo o
uso de temperaturas para o controle da proliferação de microrganismos
deteriorantes.
ANÁLISE PESSOAL
A aula foi bastante proveitosa pois conseguimos assimilar e entender o
objetivo proposto na prática e realizar o procedimento de forma adequada, tendo a
oportunidade de aprimorar as nossas habilidades no laboratório de microbiologia.
Além disso, os resultados discutidos em sala conseguiram demonstrar a influência
que os fatores como pH, concentração de solutos e temperatura tem sobre o
crescimento de microrganismos. Dessa forma, conseguimos assimilar o conteúdo
visto na aula teórica com os resultados reais obtidos através da prática. Além de
observar os problemas que podem surgir durante a execução de práticas.
REFERÊNCIAS
MADIGAN, Michael T.; MARTINKO, John M.; BENDER, Kelly S.; et al. Microbiologia de
Brock. Grupo A, 2016. E-book. ISBN 9788582712986. Disponível em:
https://integrada.minhabiblioteca.com.br/#/books/9788582712986/. Acesso em: 19
out. 2022.
PINTO, U. M.; LANDGRAF, M.; FRANCO, B. D. G. M. Deterioração microbiana dos
alimentos. Food Control., v. 18, n. 1, p. 1322-1327, 2018.
TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L. Microbiologia. Grupo A,
2017. E-book. ISBN 9788582713549. Disponível em:
https://integrada.minhabiblioteca.com.br/#/books/9788582713549/. Acesso em: 19
out. 2022.
UNIVERSIDADE ABERTA. Microrganismos e crescimento microbiano.
Disponível em:
https://repositorioaberto.uab.pt/bitstream/10400.2/6137/1/UT2_Microrganismos%20e
%20crescimento%20microbiano_PBN.pdf. Acesso em: 21 out. 2022.