Banco de sangue - Imunohematologia

Prévia do material em texto

Banco de sangue – Laís Nunes [6º semestre] 
o A imunohematologia estuda os antígenos presentes nos eritrócitos e as interações entre estes e seus respectivos anticorpos; 
 
• Essencial na busca de sangue compatível para pacientes – relacionada à hemoterapia ou medicina transfusional; 
 
o As hemácias humanas apresentam em sua superfície numerosos antígenos próprios, não ligados ao sistema HLA; 
 
o Em determinadas condições, como em pacientes submetidos a transfusões e mulheres grávidas previamente sensibilizadas a algum desses 
antígenos, sua manifestação clínica pode se dar, respectivamente, através de reações transfusionais e da Doença Hemolítica do Recém-
Nascido (DHRN) por incompatibilidade sanguínea; 
 
• Podendo também estar ligados a anemias hemolíticas autoimunes; 
o Na rotina dos bancos de sangue os testes imuno-hematológicos realizados são: 
• Tipagem ABO (direta e reversa); 
 
• Tipagem Rh (D); 
 
• Teste de antiglobulina humana (Teste de Coombs 
indireto); 
• Pesquisa de anticorpos irregulares (PAI); 
 
• Identificação de anticorpos irregulares (IAI). 
o A formação do antígeno ABH resulta da interação de três loci separados: ABO, H e Se. 
 
o Os genes: 
 
 
• FUT1 → H → codifica a substancia H; produz a a-2-L-fucosiltransferase (especifica para substancia percursora tipo2), 
transferindo a L-fucose (açúcar) para o oligossacarídeo, que ao se ligar forma a substancia H; 
 
• FUT2 → SE → produz a a-2-L-fucosiltransferase (especifica para substancia percursora tipo1), necessárias para ´produção de 
ABO secretor, fazendo com que as outras células apresentem os antígenos ABO nas secreções; 
 
• ABO → produz as glicosiltransferases especificas responsáveis pela formação de antígenos A,B e O. 
 
o As glicosiltransferases e açúcares imunológicos responsáveis pela especificidade dos antígenos H, A e B: 
Gene Glicosiltransferase Açúcar dominante Formação 
O a-2-fucosiltranferase L-fucose A cadeia percursora H produz a L-
fusosiltransferase, onde a L-fucose se liga 
na porção galactose terminal. 
A a-3-N-acetilgalactosaminiltransferase N-acetilD-galactosamina A cadeia percursora H produz a N-
acetilgalactosaminiltransferase, onde a N-
acetilgalactosamina se liga na porção 
galactose terminal. 
B a-3-N- galactosiltrasnferase D-galactose A cadeia percursora H produz a D-
galactosiltransferase, onde a D-galactose 
se liga na porção galactose terminal. 
AB a-3-N-acetilgalactosaminiltransferase 
e a-3-N- galactosiltrasnferase 
N-acetilgalactosamina e D-
galactose 
A cadeia percursora H produz a N-
acetilgalactosaminiltransferase e a D-
galactosiltransferase, ocorrendo a ligação 
dos açúcares N-acetilgalactosamina e D-
galactose na porção galactose terminal. 
Oh – Bombaim Não tem o H, dessa forma, não possui 
a fucosiltransferase ativa. 
Não transfere a fucose para 
galactose terminal, pela 
ausência do açúcar. 
A cadeia percursora do tipo 2 apresenta-se 
em alteração 
 
o Tipagem ABO → a definição do grupo sanguíneo de um individuo se dá por duas provas: 
 
• Prova direta (tipagem direta) → pesquisa de antígenos fixados nas hemácias do doador, devendo ser feitas com antissoros 
comerciais: anti-A, anati-B e anti-A, B; 
 
• Prova reversa (tipagem reversa) → pesquisa de anticorpo no soro do doador, devendo ser feita com hemácias comerciais de 
fenotipagem A1 e B, com atenção para o fato de que o anticorpo B costuma ser mais fraco que os demais anticorpos. A prova 
reversa é uma contra-prova fundamental para a conclusão do exame. 
 
 
 
 
 
Visão geral 
Tipagem ABO 
 Banco de sangue – Laís Nunes [6º semestre] 
 
 
o Prova direta → tipagem em tubo 
1. Rotular três tubos de ensaio: “A”, “B” e “AB”; 
 
2. Nos tubos adequadamente rotulados, colocar uma gota (~50 μL) dos soros anti-A, 
anti-B e anti-AB, respectivamente; 
 
3. A cada tubo acrescentar uma gota de suspensão de hemácias da amostra (~50 μL), sendo essa suspensão a 5% em soro fisiológico; 
 
4. Agitar os tubos e centrifugar adequadamente (1.000 rpm durante um min ou 3.400 rpm durante 15 seg); 
 
5. Fazer a leitura da aglutinação contra um fundo iluminado, ressuspendendo gentilmente o botão de aglutinação. 
 
o Prova reversa → tipagem em tubo 
1. Rotular dois tubos de ensaio com “A” e “B”; 
 
2. Colocar duas gotas de plasma da amostra (~100 μL) a testar em cada tubo; 
 
3. Adicionar ao tubo “A” uma gota de hemácias A1 (3 a 5%) e, ao tubo “B”, uma gota de 
hemácias B (3 a 5%); 
 
4. Agitar os tubos e centrifugar adequadamente (1.000 rpm durante 1 min ou 3.400 rpm durante 15 seg); 
 
5. Fazer a leitura da aglutinação contra um fundo iluminado, ressuspendendo gentilmente o botão. 
 
 
Em reações positivas leva a formação de imunocomplexos, impedindo a sedimentação das hemácias no fundo do tubo, dessa forma, é 
possível observar uma camada sobrenadante na superfície ou próximo a mediação do tubo. 
 
 
 Reagente anti-A Reagente anti-B 
 Anticorpo monoclonal Anticorpo monoclonal 
Tipagem Direta Altamente específico IgM Altamente específico IgM 
 Reagente com coloração 
azul claro 
Reagente com coloração 
amarelo claro 
 Reação esperada 3+ a 4+ Reação esperada 3+ a 4+ 
 Geralmente usa 1 a 2 
gotas 
Geralmente usa 1 a 2 
gotas 
 
 
o Soroclone® Anti-A, Anti-B e Anti-A,B da Fresenius Kabi → reagentes monoclonal utilizado para a classificação ABO; 
 
o Revercel® A1 e A2 (esquerda) Revercel Plus A1, A2 e B (direita) da Fresenius Kabi → reagentes de hemácias para classificação 
reversa ABO; 
o Lectina Anti-A1 (Dolichos biflorus) e Lectina Anti-H (Ulex europaeus) da Fresenius Kabi → reagentes utilizados para classificação 
ABO. 
Características gerais dos reagentes utilizados na tipagem ABO 
Como as fenotipagens ABO são realizadas 
Reagentes utilizados na tipagem ABO 
Interpretação da tipagem pelo método de gel centrifugação 
O número de cruzes corresponde à intensidade da 
aglutinação variando de: 
• 1+ até 4+ (mais forte) → aglutinação positiva; 
• 0 → corresponde à aglutinação negativa; 
• O dp → dupla população, contendo células 
aglutinadas (acima) e células não aglutinadas 
(fundo). 
Interpretação da tipagem em microplacas de fundo “U” 
Nas reações positivas → os 
imunocomplexos impedem a sedimentação 
eritrocitária no fundo do poço. 
Nas reações negativas → forma-se um 
botão contendo hemácias sedimentadas é 
formado no fundo do poço. 
 
AB+ 
 Banco de sangue – Laís Nunes [6º semestre] 
 
 
 
o Ocorre quando o resultado na prova direta e na prova reversa são divergentes, ou seja, definem fenotipagens ABO diferentes entre si. 
 
o Problemas na prova direta (discrepância): 
• Antígenos A e B fracos, em que os antígenos correspondentes só podem ser demonstrados por técnica de fixação e eluição, pela 
pesquisa de substâncias ABH na saliva, por estudo genético ou por pesquisa de transferases séricas; 
 
• Aglutinação inespecífica pela presença de geleia de Wharton (substancia gelatinosa dentro do cordão umbilical) em amostras de 
sangue de cordão umbilical, também presente no humor vítreo do globo ocular em grande parte composta de mucopolissacarídeos 
(ácido hialurónico e sulfato de condroitina); 
 
• Rouleaux é o empilhamento das hemácias tornando todas as reações falsamente positivas na determinação ABO, inclusive os 
controles. Ocorre em macroglobulinemias, nos mielomas, nas hiperfibrinemias. 
 
o Provas na prova reversa (discrepância): 
• Subgrupo de A (A2) e AB (A2B) com presença de anti-A1; 
• Presença de autoaglutinina fria (crioaglutinina) na amostra; 
 
• Ausência ou diminuição de anticorpos naturais anti-A e anti-B, como em recém-nascidos (antes dos 4 meses de idade), idosos e 
imunodeprimidos; 
 
• Presença de anticorpo irregular no plasma ou soro. 
o Teoria atual da formação do antígeno Rh → requer o envolvimento de três genes distintos: RHD, RHCE e RHAG; 
• RDH → D (D_) – Produção do antígeno RhD (Cromossomo 1); 
• RHCE → CE – Produção do antígeno RhCE (Cromossomo 1); 
•RHAG → Codificação da glicoproteína associada ao Rh: RhAG (Cromossomo 6). 
 
IPC: Os genes RDH e RHCE controlam a expressão das proteínas Rh, já o gene RHAG não expressa por se só antígenos Rh. 
 
 
o As diferenças de aminoácidos são: 
• RDH → aminoácidos extracelulares; 
 
• C/c → diferem por diversos aminoácidos, mas apenas Ser103Pro no loop 2 é predita como proteína extracelular. 
 
• E/e → diferem da Pro226Ala no loopb4, e antígenos Cw e Cx estão localizados no primeiro loop extracelular do RhCE. Os antígenos 
V e VS resultam da mudança de Leu245Val localizada na oitava região transmembrana do RhCE. 
 
• RhAG → não carreia antígenos Rh 
 
 
Rh- 
 
RhD+ 
 
RhD fraco 
 
RhD parcial 
 
Eritrócitos Rh D negativo Eritrócito RhD positivo Eritrócito RhD fraco positivo Eritrócito RhD variante positivo 
Ausência de antígenos RhD Quantidade normal de antígenos 
Rh D 
Quantidade reduzida de antígenos 
RhD 
Quantidade normal de antígenos Rh D 
--- Antígeno normal Antígeno normal Antígeno alterado 
 
 
o Determinação Rh → determina a presença do antígeno D na superfície eritrocitária utilizando antissoros comerciais; 
• Reação positiva – denota Rh+ 
 
• Reação negativa – seguir para fase de coombs indireta. Caso seja negativa, considera-se que o doador é Rh– 
 
o Pesquisa D fraco e controle → quando na classificação do Rh (D) existe ausência de aglutinação (-); 
• Detecta o anticorpo fracamente formado, devido a sua transmissão genética, usando a técnica de coombs indireto para confirmar 
sua positividade ou negatividade. 
o Controle Rh (negativo) 
• Controle com ausência de anticorpo anti-De de qualquer outro tipo de anticorpo para todos os sistemas eritrocitários, tem a 
finalidade de detectar erros ou patogenias existentes no paciente que resulte numa reação falso-positiva do controle, como por 
exemplo em casos de hiperproteinemia; A reação deve ser sempre negativa. 
Tipagem Rh 
Causas de discrepâncias na classificação ABO 
Estrutura do antígeno Rh na superfície eritrocitária 
Variantes da expressão do antígeno RhD 
Como as fenotipagens Rh são realizadas 
 Banco de sangue – Laís Nunes [6º semestre] 
• 
Fase salina (25ºC) Fase de Coombs (37ºC) Resultado 
Teste Rh (D) Controle Rh (D) Teste D fraco Controle D fraco Rh (D) 
Positivo Negativo --- --- Rh+ 
Negativo Negativo Negativo Negativo Rh- 
Negativo Negativo Positivo negativo Rh+ 
Positivo ou Negativo Positivo Positivo ou Negativo negativo Indeterminado 
 
 
IPC: O antígeno RhD apresenta um extenso polimorfismo. Pode se apresentar como um antígeno com fraca expressão (D fraco) ou como 
um antígeno modificado (D parcial), muitas vezes só podem ser determinadas por estudos moleculares. 
 
 
1. Identificar dois tubos de ensaio, como RhD e CTL; 
 
2. No tubo identificado como RhD, colocar uma gota do reagente anti-D e, no tubo identificado como 
CTL, uma gota do reagente Controle de RhD; 
 
3. Aos dois tubos adicionar uma gota de suspensão de hemácias (3 a 5%) em solução salina; 
 
4. Homogeneizar e centrifugar os dois tubos a 3400 rpm por 15 seg; 
 
5. Ressuspender o sedimento, agitando delicadamente os tubos, e ler macroscopicamente a aglutinação; 
 
6. Se o teste for negativo (aglutinação ausente), proceder conforme indicado no teste para pesquisa de RhD fraco. 
 
 
1. Incubar ambos os tubos (D e CTL) por 15 min em banho-maria a 37 °C; 
 
2. Lavar as hemácias de cada tubo três vezes, em solução salina fisiológica; 
 
3. Decantar completamente por inversão rápida dos tubos, após a última lavagem; 
 
4. A cada tubo, acrescentar duas gotas de soro antiglobulina humana (soro de Coombs); 
 
5. Centrifugar a 3.400 rpm por 15 seg; 
 
6. Ressuspender o “botão” de hemácias, por agitação delicada, e examinar para aglutinação macroscópica; 
 
7. Anotar os resultados. 
 
 
 
 
o Red Ion® - Solução de baixa força iônica (LISS modificada) → usada para pesquisa e identificação de anticorpos irregulares; 
 
o Albumina Bovina → potencializa a pesquisa e identificação de anticorpos irregulares; 
 
o Soro antigamaglobulina (soro de Coombs) → pesquisa e identifica os anticorpos irregulares e teste de Coombs direto; 
o Anti-Humano Blend → utilizado para detectar anticorpos que tenham sido absolvidos ou se fixado imunologicamente à superfície das 
hemácias; 
 
o Solução de baixa força BioPeG → pesquisa e identificação de anticorpos irregulares. 
o Os antígenos eritrocitários são bastantes diferentes estruturalmente e na sua composição; 
• Antígenos proteico (Rh, M e N), Antígenos glicoproteicos (HLA) e Antígenos glicolipídios (ABH, Lewis, li e P). 
 
Fase salina 
(25ºC) 
Fase de Coombs 
(37ºC) 
CLT Resultado 
0 0 0 RhD negativo 
0 + 0 RhD fraco 
+ 0 + Indeterminado 
Interpretação dos resultados do fator Rh 
Condição para validação do teste 
Tipagem em tubo na fase salina (20 a 25ºC) 
Tipagem em tubo na fase de Coombs (37ºC) → pesquisa de D fraco 
Tipagem de RhD positivo 
Leitura e interpretação para RhD 
Se ambos os tubos, D e CTL, aglutinarem, não 
considerar o indivíduo como RhD positivo. Nesse caso, 
considerá-lo como tendo um teste de Coombs direto 
positivo, provavelmente por sensibilização de suas 
hemácias por autoanticorpo. 
0 é sem aglutinação e + é quando possui aglutinação. 
Exemplos de potencializadores usados na triagem e pesquisa/ identificação de anticorpos irregulares 
Pesquisa de anticorpos irregulares (PAI) 
 Banco de sangue – Laís Nunes [6º semestre] 
 
 
o É um teste de triagem que consiste na determinação da presença ou ausência de anticorpos incompletos (IgG) livres no soro ou plasma de 
doadores e pacientes; 
 
o O PAI positivo → presença de um anticorpo irregular no plasma (ou soro) do paciente/doador, levando a uma realização do IAI 
(identificação de anticorpos irregulares), onde determinará a especificidade deste anticorpo; 
 
o Realização da PAI ocorre através da suspensão de hemácias imunofenotipadas → pesquisa dos anticorpos do doador no plasma ou soro, 
usando hemácias contendo pool de antígenos conhecidos para os principais sistemas eritrocitários, formando assim, um painel de seleção. 
• As hemácias devem conter os principais antígenos que caracterizam os anticorpos dos principais sistemas eritrocitários (Rh, Kell, 
Duffy, Kidd, Lewis, P, MNS, Luth e Xg). 
 
 
 
o Deve incluir uma fase de incubação a 37 ºC → facilita a ligação do anticorpo ao antígeno eritrocitário e a utilização do soro de AGH; 
• A AGH (antiglobulina humana – soro de Coombs) poliespecifica contém atividade anti-IgG e anti-C3d; 
 
o A maioria dos anticorpos clinicamente significativos, detectados durante a investigação, são da classe IgG; 
 
o É preciso realizar uma auto-prova, que visa avaliar a formação de auto-anticorpos produzidos pelo próprio paciente ou por um 
medicamento que está sendo ministrado, funcionando como um complemento e auxiliando no diagnóstico, e possível tratamento. 
 
 
o Painéis de hemácias comerciais I+II 
 
1. Fase → fase salina temperatura ambiente. Visa detectar anticorpos salinos (aglutininas da classe IgM) reativos em temperatura 
ambiente (20 a 25 oC). 
 
2. Fase → fase proteica temperatura ambiente (albumina bovina 22% ou uso de outro meio potencializador). Visa detectar 
anticorpos salinos (IgM) com ação intensificada em meio proteico, assim como anticorpos incompletos albumínicos mais potentes 
(IgG). 
 
3. Fase → fase proteica quente (37 ºC). Visa detectar anticorpos incompletos albumínicos reativos (IgG) à 37 ºC. 
 
4. Fase → fase de Coombs indireto (adição do soro de Coombs). Visa detectar anticorpos reativos (IgG e anticorpos fixadores de 
componentes de complemento à membrana celular). 
 
o Interpretação dos resultados 
• Ausência de aglutinação/hemólise → ausência de Acs irregulares; 
 
• Presença de aglutinação/hemólise → presença de Acs irregular. 
▪ Observando a reação e a intensidade dela, pode-se concluir na maioria das vezes se o anticorpo é do tipo quente ou frio. 
 
• Observandoa reação com o TRIACEL® I, exclusivamente, o anticorpo presente no soro testado deverá ser contra algum antígeno 
presente (+) no TRIACEL® I e ausente (0) no TRIACEL® II. 
 
• Observando reação com TRIACEL® II, exclusivamente, o anticorpo presente no soro testado deverá ser contra algum antígeno 
presente (+) no TRIACEL® II e ausente (0) no TRIACEL® I. 
 
• Observando reação com TRIACEL® I e II simultaneamente, o anticorpo presente no soro testado deverá ser contra algum 
antígeno presente (+) tanto no I quanto no II, 
 
• Alguns anticorpos, como por exemplo, Anti-hr’(c), Anti-rh’(C) e Anti-M, podem apresentar “efeito de dose”, isto é, reagem apenas 
com células homozigotas para o respectivo antígeno; 
 
• A presença de dois ou mais anticorpos de especificidades diferentes no soro sob teste pode causar positividade com TRIACEL® I 
e/ou II. 
o Após a pesquisa realiza-se a IAI, onde são utilizadas várias suspensões de hemácias revestidas com determinados antígenos conhecidos. 
As reações positivas indicam que o plasma de doadores/receptores apresenta anticorpos específicos (irregulares) dirigidos contra esses 
antígenos; 
 
o Os resultados do IAI devem ser interpretados pela análise do diagrama de antígenos específicos do Painel; 
o A caracterização do anticorpo deverá estar de acordo com a coluna vertical do diagrama referente a cada antígeno dos Sistemas 
Eritrocitários (coluna horizontal); 
 
o Os resultados do soro pesquisado deverão ser similares à coluna referente ao anticorpo identificado. Esta igualdade dará o resultado do 
anticorpo presente no respectivo soro. 
 
 
Pesquisa de anticorpos irregulares (PAI) 
Considerações importantes sobre a PAI 
Etapas da PAI em tubo 
de ensaio 
Identificação de anticorpos irregulares (IAI) 
Etapas do IAI – método de avaliação do painel à quente 
 Banco de sangue – Laís Nunes [6º semestre] 
1. Etapa → meio salino em temperatura ambiente. Visa detectar anticorpos salinos (IgM) reativos em temperatura ambiente (20 a 25ºC); 
 
2. Etapa → meio proteico (temperatura ambiente 20 a 25ºC). Visa detectar anticorpos salinos (IgM) que possui reações inespecificadas em 
meio proteico e anticorpos incompletos albuminosos mais potentes (IgG); 
 
3. Etapa → meio proteico (temp. 37ºC). Visa detectar anticorpos incompletos albuminosos reativos a 37 ºC. 
 
4. Etapa → teste de antiglobulina humana (Coombs indireto). Visa detectar anticorpos incompletos reativos (classe IgG e anticorpo, 
fixadores de componentes do complemento à membrana celular). 
 
 
o Etapa única → teste de antiglobulina humana (Coombs indireto). visa detectar anticorpos salinos frios (IgM) reativos entre 15 a 18 oC. 
Paciente (coleta de amostra) Doador (segmento da bolsa) 
Classificação ABO direta e reversa Reclassificação ABO direta 
Classificação Rh Reclassificação Rh 
Pesquisa de anticorpo irregular (PAI) 
 
 
 
o Mistura do plasma/soro do receptor com as hemácias da bolsa. Tem a 
finalidade de investigar no plasma do receptor, a presença de anticorpos 
contra os antígenos eritrocitários clinicamente significantes no doador. Podendo ser realizada com a adição de substancias 
potencializadoras; 
 
o Tem como finalidade: 
 
• Prevenir erros na tipagem ABO do doador e do receptor; 
• Detectar anticorpos irregulares clinicamente significantes não detectados na P.A.I. do receptor; 
• Detectar anticorpos contra antígenos de baixa frequência presentes nas hemácias do doador. 
 
o Limitações: 
• Anticorpos que possuem efeito de dose podem não ser detectados (títulos baixos); 
• Não há garantias de que o paciente foi aloimunizado; 
• Anticorpos de relevância clínica podem não ser detectados. 
 
 
1. Etapa → fase salina em temperatura ambiente (20 a 25 °C). A observação de aglutinação ou hemólise, resultado positivo, indica a 
presença de anticorpo frio na amostra ou erro de classificação ABO do doador ou receptor. 
• Deve-se observar rigorosamente a tipagem ABO, visto que a maioria dos acidentes transfusionais graves ocorrem por este 
tipo de incompatibilidade. 
 
2. Etapa → fase salina a 37 °C. A observação de aglutinação ou hemólise, resultado positivo, indica a presença de anticorpo quente na 
amostra. 
 
3. Etapa → teste da Antiglobulina Humana (COOMBS INDIRETO). A observação de aglutinação ou hemólise, resultado positivo, indica a 
presença de anticorpo quente na amostra. 
 
 
 
o A observação de aglutinação ou hemólise → resultado positivo, presença de anticorpo quente na amostra; 
 
o A ausência de aglutinação ou hemólise → resultado negativo, indica compatibilidade entre a amostra do doador e do receptor. 
 
Etapas do IAI – método de avaliação do painel à frio 
Testes pré-transfusionais 
Prova cruzada ou prova de compatibilidade 
Etapas da prova cruzada ou prova de compatibilidade 
Interpretação dos resultados 
Liberação do hemocompo 
Todo hemocomponente liberado deve ser devidamente 
identificado com etiqueta, contendo: 
• Dados do receptor; 
• Hemocomponente a ser transfundido; 
• Resultado do teste; 
• Responsável pela liberação.nente para transfusão 
 TA- temperatura ambiente; PC- prova cruzada; a Controle de Coombs: reagente de 
hemácias sensibilizadas com ac IgG; Resultado invalido- refazer o teste.