Exames Parasitológicos

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BIOMEDICINA
EXAMES
PARASITOLÓGICOS
___
CLEONICE SANTOS
Exame direto à fresco de fezes
O exame direto à fresco representa uma
alternativa simples e rápida para a identificação de
trofozoítos móveis de amebas e flagelados
intestinais em amostras com consistência pastosa
ou líquida. Tem baixa sensibilidade, contudo, para
a identificação de cistos de protozoários e de ovos
e larvas de helmintos. Utiliza-se uma pequena
porção de fezes (aproximadamente 2 mg)
recém-eliminadas colocada sobre uma lâmina e
emulsificada em solução salina. Pode-se utilizar
corantes como lugol, que facilita a identificação de
cistos de protozoários, por tornar possível a
visualização de seus núcleos e corar vacúolos de
glicogênio eventualmente presentes em seu
interior, ou como uma solução tamponada de azul
de metileno que possibilita uma boa análise de
características morfológicas de trofozoítos.
Procedimento
1. Identifica-se a lâmina com lápis.
2. Coloca-se de duas a três gotas de salina
0,9% na lâmina.
3. Toca com a ponta do palito em vários
pontos das fezes, transferindo uma
pequena porção para lâmina.
4. Espalha-se as fezes, fazendo um
esfregaço.
5. Examina-se ao microscópio.
Hoffman, Pons E Janer ou Lutz modificado
O método de Hoffman, Pons e Janer é também
conhecido como método de Lutz ou sedimentação
espontânea, é de fácil realização e de baixo
recurso financeiro, sendo um dos métodos mais
utilizados em laboratórios de análises clínicas.
Esse método permite a pesquisa de ovos e larvas
de helmintos e de cistos de alguns protozoários.
Principalmente a detecção de ovos pesados de
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helmintos. O método de sedimentação por
gravidade foi inicialmente descrito para a detecção
de ovos de Schistosoma mansoni nas fezes. É
recomendável o exame de fezes em três amostras
colhidas em dias diferentes, pois a ausência de
parasitas em uma amostra de fezes não elimina a
possibilidade da presença do mesmo no
organismo.
Procedimento
1. Depositar aproximadamente 2 g- 5g de
fezes em um copo plástico descartável e
acrescentar cerca de 5 mℓ de água filtrada
ou destilada para dissolver o material
biológico, deve-se triturar bem com bastão
de vidro.
2. Acrescentar mais 20 mℓ de água filtrada
ou destilada.
3. Proceder à filtração da solução para um
cálice cônico de 200 mL de capacidade,
empregando parasitofiltro ou gaze
dobrada em quatro, os detritos retidos são
lavados com mais 20mL de água,
agitando-se constantemente com o bastão
de vidro, devendo o líquido da lavagem
ser recolhido no mesmo cálice.
4. Completar o volume do cálice com água.
5. Manter o material (suspensão) em
repouso, por um intervalo de
aproximadamente 2 h - 24h para
sedimentação.
6. Após este interregno, observar as
características do fluido sobrenadante,
previamente ao próximo passo. Duas
ocorrências poderão sobrevir:
O sobrenadante apresentar-se turvo:
nesse caso, o líquido deve ser descartado
com cuidado, para que não se mobilize –
e/ou para que não se perca – o sedimento;
ato contínuo, deve-se acrescentar água,
até que o volume prévio seja atingido; o
material deve ser mantido em repouso por
mais 1 h.
O sobrenadante apresentar-se limpo: dar
seguimento aos próximos passos.
7. Coletar o material (sedimento)
empregando um dos seguintes
procedimentos:
Técnica 1: desprezar o fluido
sobrenadante, cautelosamente; na
sequência, deve-se homogeneizar o
material (sedimento), de modo a obter-se
uma gota; tal abordagem è considerada a
mais adequada, na medida em que a gota
obtida è, costumeiramente, mais
representativa do sedimento.
Técnica 2: inserir uma pipeta no cálice – o
qual contém o sedimento e o fluido – até o
fundo; obter uma gota do material
(sedimento); a pipeta – com a extremidade
superior obliterada pelo dedo indicador –
deve atingir o fundo do cálice; ato
contínuo, cessa-se a ação do dedo
indicador, permitindo que uma pequena
porção do material (sedimento) penetre a
pipeta; recolocar o dedo, prontamente,
para que a porção superior da pipeta
torne-se novamente obliterada; na
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sequência, esta deve ser retirada do
cálice.
8. Depositar o sedimento – obtido a partir de
uma das técnicas descritas – em uma
lâmina; acrescentar solução de Lugol
(uma gota é suficiente); em seguida,
proceder à homogeneização, colocar uma
lamínula sobre o material e examinar ao
microscópio utilizando as objetivas de 10×
e 40×; avaliar, no mínimo, duas lâminas de
cada sedimento.
Willis
O método de Willis consiste em dissolver
pequenas amostras de fezes em solução saturada
de cloreto de sódio. É utilizado para investigar a
existência de ovos leves de helmintos
(principalmente de ancilostomídeos, mas também
Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura). O
método de Willis é baseado na flutuação
espontânea. Não sendo recomendado para a
busca de cistos de protozoários, larvas de
helmintos, ovos de Schistosoma mansoni, nem
ovos inférteis de Ascaris lumbricoides.
Procedimento
1. Preparar previamente a solução saturada
de cloreto de sódio.
2. Colocar 10g de fezes em um frasco de
coleta (pode ser usado o próprio frasco no
qual as fezes foram enviadas).
3. Diluir as mesmas em solução saturada de
cloreto de sódio (NaCl).
4. Completar o volume até a borda do frasco.
5. Colocar na boca do frasco uma lâmina,
que deverá estar em contato com o
líquido.
6. Deixar em repouso por 5 minutos.
7. Findo esse tempo, retirar rapidamente a
lâmina, voltando a parte molhada para
cima.
8. Corar com o lugol. Levar ao microscópio e
examinar com objetiva de 10x e/ou 40x. O
uso de lamínula é facultativo.
Coproplus®
O Coproplus® foi desenvolvido para facilitar ainda
a rotina dos laboratórios, durante a coleta, o
transporte e identificação microscópica, garantindo
a máxima qualidade dos resultados. Uma
metodologia rápida, prática e higiênica, aprovada
por laboratórios de todo o país e do exterior.
Conservando a amostra por até 30 dias, sem a
necessidade de refrigeração e permitindo a coleta
padronizada e reduzida de amostra, o método
minimiza o contato com as fezes, tanto na coleta,
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quanto na execução do exame. Seus líquidos
conservantes ajudam a eliminar o mau odor e
permitem a obtenção de resultados práticos e
confiáveis. Permite o diagnóstico otimizado de
todas as espécies: ovos, larvas e cistos.
Dependendo do tipo de conservante poderemos
observar também trofozoítos. Os ovos, larvas e
cistos de todas as espécies são concentrados, e o
seu encontro ao exame microscópico é muito
facilitado, porque o sedimento fica ainda mais
limpo e isento de inúmeros detritos, facilitando a
identificação dos organismos.
Procedimento de coleta
1. Abrir o frasco cuidadosamente para não
derramar o conteúdo e mantê-lo sempre
em pé.
2. Utilizando a haste interna do produto,
colher a amostra de fezes e encher o
coletor.
3. Fechar o frasco com cuidado e enviá-lo ao
laboratório.
Procedimento de análise
1. Ao receber a amostra, agitar o frasco em
movimentos circulares até a dissolução.
2. Remover a capa de vedação e pressionar
o frasco levemente para a saída de ar.
Inverter o frasco e colocá-lo na bandeja de
sedimentação por 15 minutos.
3. Desprezar a 1ª gota e gotejar na lâmina de
vidro. Adicionar Lugol e examinar o
microscópio.
Rugai
O método de Rugai é empregado para identificar
larvas de Strongyloides stercoralis. Trata-se de um
método que detecta larvas vivas, através do
termohidrotropismo positivo. O diagnóstico
diferencial pode ser realizado utilizando-se a
coloração pela solução de Lugol. A temperatura da
água deve estar entre 40 e 45°C. O ideal é que as
fezes sejam colhidas no dia do exame, pois a
refrigeração diminui a viabilidade das larvas.
Fezes diarreicas ou colhidas em conservador não
se prestam para este método.
Procedimento
1. Pesar 10g de fezes frescas sem
conservantes diretamente na tampa do
frasco da amostra ou em na tampa de
outro frasco estéril;
2. Envolver a tampa com a amostra em uma
gaze dobrada em quatro, fazendo uma
pequena "trouxa".
3. Colocar o material assim preparado, com
a abertura voltada para baixo, num cálice
de sedimentação, contendo água
aquecida (45ºC),em quantidade suficiente
para entrar em contato com as fezes.
4. Deixar uma hora em repouso.
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5. Colher o sedimento no fundo do cálice,
com a ajuda de uma pipeta.
6. Examinar no microscópio, com a objetiva
de 10x.
7. Corar as larvas com o lugol e observá-las
com o maior aumento, para identificação.
Kato-katz
O método de Kato-Katz é empregado para
investigar a presença de ovos de Schistosoma
mansoni (no material fecal) e, menos
frequentemente, de outros helmintos. A técnica
tem menor reprodutibilidade e costuma ser
utilizada como método quantitativo. O ensaio
depende da separação de uma pequena amostra
de fezes por meio de filtros e da aderência dos
ovos a um papel-celofane, o qual deve estar
embebido em solução de verde malaquita. Após a
aderência – e a ação do verde malaquita, por 1
hora –, o material em análise é levado ao
microscópio para identificação dos agentes
parasitários. É indicado para pesquisa de ovos de
Schistosoma mansoni, Ascaris lumbricoides,
Trichuris trichiura e ancilostomídeos. Cistos de
protozoários não são visualizados nessa
preparação. O método de Kato-Katz se baseia na
concentração de ovos de helmintos através de
filtração em tela metálica ou de náilon, que retém
os detritos maiores e permite a passagem dos
detritos menores e ovos, ocorrendo,
consequentemente, a concentração destes últimos
na amostra fecal.
Procedimento
1. Preparar previamente a solução de verde
de malaquita de acordo com a seguinte
fórmula:
a. Glicerina 100 ml
b. Água destilada 100 ml
c. Verde malaquita a 3% 1 ml
2. Cortar papel celofane semipermeável em
pedaços de 24 mm por 30 mm e deixá-los
mergulhados na solução de
verde-malaquita por pelo menos 24 horas.
3. Colocar, sobre um papel higiênico, uma
pequena quantidade da amostra fecal.
4. Comprimir as fezes com um pedaço de tela
metálica (marca Ibras, nº 120, fios e trama:
0,09mm) ou similar de náilon.
5. Retirar as fezes que passaram para a parte
superior da tela e transferi-la, com o auxílio
de um palito, para o orifício (6 mm de
diâmetro) de um cartão retangular de
plástico, colocado sobre uma lâmina de
vidro.
a.
6. Após encher completamente o orifício,
retirar o cartão cuidadosamente, deixando
as fezes (42 mg) sobre a lâmina.
7. Cobrir as fezes com o papel celofane.
Inverter a lâmina sobre uma folha de papel
e comprimi-la.
8. Após uma hora, examine o microscópio
contando os ovos presentes na
preparação.
9. O número de ovos encontrados, na
preparação fecal, multiplicado por 24,
corresponderá ao nº de ovos por grama de
fezes.
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Faust et al.
O método de Faust et al. também conhecido por
método de centrifugação-flutuação, consiste em
uma técnica simples e eficiente para a
concentração de ovos leves de helmintos e cistos
de protozoários. Esse método consiste em
algumas etapas de centrifugação de uma
suspensão de fezes em água, que objetiva
concentrar os elementos parasitários mediante as
diversas etapas de centrifugação. O material deve
ser examinado imediatamente, pois o contato com
a solução de sulfato de zinco pode deformar as
formas parasitárias, especialmente os cistos de
protozoários.
Procedimento
1. Dissolver cerca de 10 g de fezes em
aproximadamente 20 mℓ de água,
utilizando bastão de vidro.
2. Filtrar a suspensão contendo as fezes em
gaze dobrada ou parasitofiltro, e
posteriormente, transferir 12ml para um
tubo Falcon.
3. Centrifugar (utilizar 2.500rpm por 1
minuto).
4. Desprezar todo o sobrenadante e, ato
contínuo, suspender o resíduo (resultante)
em água.
5. Repetir até que o sobrenadante se torne
claro.
6. Desprezar a água sobrenadante e
ressuspender o sedimento com uma
solução de sulfato de zinco a 33%,
densidade de 1,180g/ml.
7. Centrifugar (utilizar 2.500 rpm por 1
minuto).
8. Recolher a película superficial e
depositá-la na superfície da lâmina,
empregando alça platina.
9. Adicionar solução de Lugol (uma gota é
suficiente); cobrir o material com lamínula.
10. Examinar exaustivamente o microscópio,
utilizando as objetivas de 10x e 40x.
Figura 01 - Método de Faust. Ilustração: Igor Rodrigues Mendes (UFV). Fonte:
SIQUEIRA-BATISTA, Rodrigo et al. Parasitologia - Fundamentos e Prática
Clínica 2020.
Ritchie
O método de Ritchie se baseia na
centrífuga-sedimentação em solução de acetato
de etila ou éter etílico. As estruturas parasitárias
são mais pesadas que a solução e se acomodam
no sedimento do tubo, enquanto os detritos fecais
são normalmente mais leves e sobem para as
camadas mais superficiais do tubo de ensaio.
Embora seja usado com frequência em diversos
países, tem o inconveniente de empregar o éter,
substância volátil e de acesso restrito. O método é
usado para a pesquisa de ovos de helmintos,
oocistos de coccídeos e cistos de protozoários. A
vantagem desta técnica é que proporciona uma
boa recuperação da maioria dos parasitos e é de
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fácil realização. A desvantagem é que a
preparação contém mais detritos fecais do que
uma técnica de flutuação, dificultando um pouco a
visualização ao microscópio.
Procedimento
1. Pesar 1 a 2 g de fezes em um copo
descartável e diluir em 10mL de água
destilada.
2. Homogeneizar bem.
3. Filtrar a suspensão de fezes em gaze
cirúrgica dobrada em quatro ou
parasitofiltro, num copo plástico
descartável.
4. Transferir o filtrado para um tubo cônico de
centrifugação, com capacidade para
15mL.
5. Centrifugar por um minuto a 2.500 rpm.
6. Desprezar/decantar o líquido
sobrenadante e ressuspender o sedimento
em água destilada.
7. Repetir as operações 5 e 6 mais duas ou
três vezes ou até que o líquido
sobrenadante fique claro
8. Decanta-se o líquido sobrenadante da
última lavagem e acrescenta-se 1 a 2 ml
de solução tamponada de formalina a
10%, misturando-se bem.
9. Após a homogeneização, acrescenta-se a
solução de formalina até completar-se o
volume de 10 ml, deixa-se a suspensão
em repouso por 10 minutos e adicionar-3
ml de éter etílico (C4H10O) (que pode ser
substituido por igual volume de acetato de
etila, C4H10O2), com agitação vigorosa
subsequente.
10. Centrifugar por um minuto a 1.500 rpm.
11. Ao final da última etapa de centrifugação,
formam-se quatro camadas: (a) o
sedimento no fundo, contendo os
elementos parasitários; (b) uma camada
de formalina; (c) uma camada rica em
detritos fecais; e (d) uma camada de éter
na superfície. As três camadas superiores
são decantadas e as paredes do tubo são
limpas com um swab de algodão tipo
cotonete.
12. O sedimento é colocado sobre lâmina de
microscopia e examinado ao microscópio,
entre lâmina e lamínula, corado com
solução de Lugol ou outros corantes.
13. Examinar com as objetivas de 10x e/ou 40
x.
Figura 01 - Método de Ritchie. A figura ilustra as etapas finais do
procedimento. A. Ao final da última etapa de centrifugação,
separam-se quatro camadas no tubo: (1) sedimento que contém os
elementos parasitários; (2) solução de formalina; (3) camada rica em
detritos fecais; (4) solução de éter ou acetato de etila. B. As três
camadas superiores são descartadas, e as paredes do tubo são
limpas com um swab de algodão. C. O sedimento é removido com
uma pipeta tipo Pasteur. D. O sedimento é colocado sobre lâmina de
microscopia e examinado ao microscópio, entre lâmina e lamínula,
corado com solução de Lugol ou outros corantes.
Exame parasitológico de sangue
Diversos parasitos tem estágio evolutivo no
sangue, tais como malária, filariose, doença do
sono e doença de Chagas, portanto a análise do
sangue é etapa importante para o diagnóstico das
enfermidades parasitárias. Basicamente, as
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amostras sanguíneas podem ser dispostas em
lâminas de microscopia de dois modos: em
esfregaços sanguíneos delgados ou espessos, as
chamadas gotas espessas. Na gota espessa, o
sangue é coletado por punção venosa ou digital e
colocado sobre a lâmina de microscopia, na qual
permanece secando para o exame, sem a
utilização de anticoagulantes. Nos esfregaços
sanguíneos delgados, coleta-se uma microgota, a
qual é espalhada sobre a lâmina. Após a
coloração da lâmina, verifica-se a existência de
hemoparasitos.
Gota espessa
A gota espessa é amelhor alternativa para a
detecção do Plasmodium spp., considerada
padrão-ouro para o diagnóstico da malária. É
também utilizada para encontrar tripomastigotas
sanguíneos de Trypanosoma cruzi durante a fase
aguda da infecção chagásica e de tripomastigotas
sanguíneos na tripanossomíase africana humana.
A técnica baseia-se no exame de grande volume
de sangue concentrado em uma área
relativamente pequena da lâmina, aumentando a
probabilidade de detecção do parasito em um
número reduzido de campos microscópicos.
Procedimento
1. Colocar 3-5 ml de sangue na lâmina (2 a 3
gotas); com o canto de outra, espalhar
essa gota numa área de 1cm²;
2. Deixar secar ao ar durante 36 horas;
3. Entre 6 e 36 horas (não ultrapassar esse
período), corar pelo Giemsa (uma gota de
solução-estoque por mL de
solução-tampão);
4. Deixar em repouso por 30 minutos;
5. Lavar e examinar
 
Gota delgada
O esfregaço sanguíneo delgado, possibilita a
avaliação de características morfológicas dos
parasitos, especialmente dos plasmódios, e de
parâmetros essenciais para a sua identificação,
como a precisa localização dos parasitos, o
diâmetro das hemácias infectadas e não
infectadas e a existência de grânulos parasitários.
Por empregar volume reduzido de sangue
distendido em uma única camada, essa técnica
apresenta como limitação fundamental a
necessidade de análise de um grande número de
campos microscópicos, especialmente em
condições de baixas parasitemias.
Procedimento
1. Colocar uma gota de sangue na
extremidade direita de uma lâmina (esta
deve estar apoiada sobre a mesa);
2. Pegar outra lâmina, segurar por cima com
a mão direita e, com uma inclinação de
45º, encostar adiante da gota;
3. Deixar a mesma se espalhar pela
superfície de contato das duas lâminas;
4. Puxar a gota espalhada até o fim da
lâmina;
5. Secar por agitação vigorosa
imediatamente (se não secar rápido,
haverá hemólise das hemácias);
6. Corar pelo Giemsa ou Panótico.
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Referências
DE CARLI, Geraldo Attilio; Parasitologia Clínica.
Ed. Atheneu.
FERREIRA, Marcelo U. Parasitologia
contemporânea. 2. ed. - Rio de Janeiro :
Guanabara Koogan, 2021
NEVES, David P. Parasitologia Humana. 13. ed.
São Paulo : Editora Atheneu, 2016.
REY, Luís. Parasitologia: parasitos e doenças
parasitárias do homem nos trópicos ocidentais
4.ed. Rio de Janeiro : Guanabara Koogan, 2018.
SIQUEIRA-BATISTA, Rodrigo et al. Parasitologia -
Fundamentos e Prática Clínica.1. ed. Rio de
Janeiro : Guanabara Koogan, 2020.