teorico - 2022-12-03T170818.325

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Banco de Sangue
Responsável pelo Conteúdo:
Prof.ª Dra. Bruna Amorin
Revisão Textual:
Prof.ª Dra. Selma Aparecida Cesarin
Prática
Prática
• Tema 1 – Tipagem ABO e Rh;
• Tema 2 – Tipagem Rh e Pesquisa de D Fraco;
• Tema 3 – Coombs Direto e Coombs Indireto;
• Tema 4 – Pesquisa de Anticorpos Irregulares (Pai) e Prova Cruzada.
UNIDADE Prática
Tema 1 – Tipagem ABO e Rh
O Sistema ABO foi o primeiro sistema de grupos sanguíneos, descrito em 1900 por 
Landsteiner, que descreveu os antígenos A, B e C (depois renomeado como O). Landsteiner 
descobriu que, misturando soro e hemácias de diferentes pessoas, poderiam ser defini‑
dos três grupos e, alguns anos após, Decastello descreveu o fenótipo AB.
Os genes ABO se localizam no braço longo do cromossoma 9 (posição 9q34.1‑q34.2). 
Foram definidos quatro genes: A1, A2, B, O. Esses genes codificam a produção de duas 
enzimas glicosiltransferases A e B.
Os antígenos do Sistema ABO não são restritos à membrana eritrocitária, mas tam‑
bém estão presentes na saliva e outros líquidos biológicos, exceto fluido espinhal.
Os anticorpos do Sistema ABO estão ausentes no nascimento e são detectáveis após 
os quatro meses de idade. Uma das teorias propostas para seu aparecimento consiste na 
heteroimunização (flora bacteriana intestinal, anatoxinas diftéricas ou tetânicas, sorote‑
rapia antitetânica, medicamentos de origem animal, vacina antigripal, etc.).
Anticorpos:
• Anti‑A: ocorre naturalmente no soro de todos os indivíduos do Grupo B;
• Anti‑B: ocorre naturalmente no soro de todos os indivíduos do Grupo A;
• Anti‑AB: ocorre naturalmente no soro de todos os indivíduos do Grupo O;
• Anti‑A1: pode ocorrer naturalmente nos indivíduos A2, quase sempre é uma aglu‑
tinina fria, tipo IgM, encontrada em cerca de 1% a 4% dos indivíduos A2 e em 25% 
dos indivíduos A2B. Geralmente não está associada a reação hemolítica transfu‑
sional ou doença hemolítica perinatal. Na presença de anti‑A1, só é necessário 
selecionar hemácias A2 para transfusão se o anticorpo reagir a 37ºC.
Por sua vez, o sistema Rh é o mais complexo dos sistemas eritrocitários e o 2º mais 
importante, depois do sistema ABO, na medicina transfusional. Foi descoberto em 1939, 
por Levine e Stetson, por meio de um caso de Doença Hemolítica Perinatal (DHPN). 
Os antígenos do sistema Rh são encontrados exclusivamente nas hemácias. São 
proteínas codificadas por um par de genes homólogos, RHD e RHCE. O gene RHD 
codifica a produção do antígeno RhD e o gene RHCE, a produção de dois pares de 
antígenos antitéticos: C, c, E, e. Embora o sistema apresente mais de 50 antígenos, 
apenas a classificação RhD, que se refere a presença ou ausência do antígeno RhD, deve 
ser realizada obrigatoriamente nas rotinas pré‑transfusionais e em doadores de sangue.
Aplicação da Teoria na Prática 
Tanto o Sistema ABO quanto o Rh são de extrema importância na medicina 
transfusional.
A tipagem ABO deve ser realizada obrigatoriamente por meio de duas provas:
8
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• Prova direta: consiste em pôr em contato soros‑teste conhecidos: anti‑A, anti‑B 
e anti‑AB – com glóbulos vermelhos (GV) a serem testados, para identificar a pre‑
sença ou não dos antígenos A e B. Assim, serão definidos os grupos sanguíneos: 
A, B, AB, O;
• Prova reversa: consiste em colocar em contato o soro a testar com pelo menos 
GV conhecidos A1 e B, permitindo reconhecer a presença ou não de anticorpos 
dirigidos contra esses antígenos.
Essas duas provas, direta e reversa, devem ser realizadas preferencialmente por dois 
técnicos diferentes, sendo que cada teste realizado confirma o outro.
A classificação rotineira do RhD refere‑se somente a presença ou ausência do antí‑
geno RhD. Contrariamente ao sistema ABO, não há prova reversa, pois os indivíduos 
não apresentam naturalmente anticorpos séricos contra o antígeno RhD. Porém toda 
a vez que houver aglutinação negativa, a pesquisa de D FRACO / D PARCIAL / DU 
deve ser feita. Sua finalidade é detectar o anticorpo fracamente formado, devido a sua 
transmissão genética.
Experimento 1 (Atividade prática)
Preparo de Solução de Hemácias 5% e Tipagem Abo
Materiais e Reagentes Necessários
• Amostras de sangue total e plasma; 
• Salina;
• Anti‑a, anti‑b e anti‑ab (tipagem direta);
• Hemácias a1 e hemácias b (tipagem reversa);
• Tubos de ensaio de 12 x 75 mm;
• Descarte;
• Estante para tubos;
• Centrífuga;
• Pipetas pasteur;
• Pipetadores; 
• Ponteiras. 
Preparo da solução de hemácias 5%
1. Pingar de 3 a 5 gotas de sangue total do tubo de ensaio;
2. Adicionar aproximadamente 3/4 de salina no tubo (Primeira lavagem);
3. Centrifugar a 3400 rpm por 1 minuto;
4. Desprezar o sobrenadante;
5. Adicionar aproximadamente 3/4 de salina no tubo (Segunda lavagem;)
6. Centrifugar a 3400 rpm por 1 minuto;
9
UNIDADE Prática
7. Desprezar o sobrenadante;
8. Adicionar aproximadamente 3/4 de salina no tubo (Terceira lavagem);
9. Centrifugar a 3400 rpm por 1 minuto;
10. Desprezar o sobrenadante;
11. Adicionar 19 gotas de salina.
Determinação grupo ABO: Prova Direta
1. Identificar três tubos como: anti‑A, anti‑B, anti‑AB;
2. Colocar 50µL da suspensão de hemácias 5% (preparada anteriormente) em 
cada tubo;
3. Acrescentar 1 gota dos reagentes anti‑A, anti‑B, anti‑AB nos respectivos tubos;
4. Centrifugar a 1000 rpm por 1 minuto;
5. Ressuspender o botão de hemácias, agitando suavemente cada tubo, ler contra 
fundo luminoso e interpretar o resultado.
Tabela 1 – Interpretação
Tubo Anti-A Tubo Anti-B Tubo Anti-Ab Grupo
Aglutinação Ausência de aglutinação Aglutinação A
Ausência de aglutinação Aglutinação Aglutinação B
Aglutinação Aglutinação Aglutinação AB
Ausência de aglutinação Ausência de aglutinação Ausência de aglutinação O
Determinação grupo ABO: Prova Reversa
1. Identificar dois tubos como: A1 e B;
2. Adicionar 1 gota da suspensão de hemácias A1(reagente) no tubo A1 e 1 gota 
da suspensão de hemácias B (reagente) no tubo B;
3. Acrescentar 100µL do plasma (paciente) em cada tubo;
4. Centrifugar a 1000rpm por 1 minuto;
5. Ressuspender o botão de hemácias, agitando suavemente cada tubo, ler contra 
fundo luminoso e interpretar o resultado.
Tabela 2 – Interpretação
Tubo A Tubo B Grupo
Ausência de aglutinação Aglutinação A
Aglutinação Ausência de aglutinação B
Ausência de aglutinação Ausência de aglutinação AB
Aglutinação Aglutinação O
Perguntas: 
a) Qual a tipagem ABO identificada em seu experimento? 
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b) A prova direta e reversa foram compatíveis?
c) Caso a prova direta e reversa não forem compatíveis, o que deve ser feito?
Experimento 2 (Atividade prática)
Tipagem Rh
Materiais e Reagentes Necessários
• Amostras de sangue total (solução de hemácias 5% do experimento 1);
• Tubos de ensaio de 12 x 75 mm;
• Descarte;
• Estante para tubos;
• Soro anti‑d;
• Controle rh;
• Centrífuga;
• Pipetador;
• Ponteiras.
Determinação do Rh
1. Identifi car 2 tubos como: RH e o outro CONTROLE;
2. No tubo RH colocar 1 gota de soro anti‑D e 50µL da suspensão de hemácias 5%;
3. No tubo CONTROLE 1 gota de Controle RH e 50µL da suspensão de hemá‑
cias 5%;
4. Centrifugar os tubos a 1000 rpm por 1 minuto;
5. Ressuspender o botão de hemácias, agitando suavemente cada tubo, ler contra 
fundo luminoso e interpretar.
Tabela 3 – Interpretação
Tubo RH Tubo Controle RH
Aglutinação Ausência de aglutinação Positivo
Ausência de aglutinação Ausência de aglutinação Negativo
Perguntas
a) Qual a tipagem Rh identifi cada em seu experimento?
b) Qual a importância do tubo controle?
c) Em caso de RhD negativo, o que deve ser feito?
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UNIDADE Prática
Material Complementar
Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade:
 Vídeos
Fator Rh: por que o sangue é positivo ou negativo?
https://youtu.be/DhndJ4R5GwA
 Leitura
Imuno-hematologia Laboratorial
Leitura do cap. 2 – Sistema ABO e cap. 3 – Sistema Rh
https://bit.ly/3zJ4pgB
Aspectos moleculares do sistema sanguíneo ABO
https://bit.ly/3tdPE2C 
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Tema 2 – Tipagem Rh e Pesquisa de D FracoO sistema Rh é determinado por um par de genes alelos com dominância completa. 
O alelo R é dominante e o r recessivo. Assim os possíveis genótipos para o sistema Rh são:
 Tabela 4
Sistema Rh Genótipo
Rh+ RR ou Rr
Rh‑ rr
A presença ou ausência do antígeno (Ag) D que define se o indivíduo é Rh+ ou Rh‑. 
Um Indivíduo Rh‑ só produzirá anti‑D por meio de imunização com hemácias Rh+ atra‑
vés de:
• Gravidez ; 
• Transfusão . 
A tipagem Rh é realizada com soro anti‑D  Presença ou ausência do Ag D nas 
hemácias.
Receptores Rh+ podem receber:
• Sangue Rh+ ; 
• Sangue Rh – . 
Receptores Rh‑ podem receber:
• Sangue Rh‑. 
Interpretação da testagem para Rh:
Tabela 5
Tubo RH Tubo Controle RH
Aglutinação Ausência de aglutinação Positivo
Ausência de aglutinação Ausência de aglutinação Negativo
Pesquisa de D Fraco / D Parcial / Du
O antígeno D Fraco é uma variante do antígeno D e necessita de testes adicionais 
para sua identificação. 
Essa pesquisa do antígeno D fraco é realizada em amostras de sangue que apresen‑
tam reações fracas/nulas em testes de aglutinação direta com soro anti‑D. O paciente 
com a presença desta variante poderá desenvolver anticorpos anti‑D quando exposta ao 
antígeno D não identificado como D fraco.
A pesquisa de D FRACO / D PARCIAL / DU deve ser feita, quando na classifi‑
cação do Rh (D) existe ausência de aglutinação (negativa). Sua finalidade é detectar o 
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UNIDADE Prática
anticorpo fracamente formado, devido a sua transmissão genética. Nesta prova é necessá‑
rio usar técnicas mais sensíveis (como a Técnica de Coombs Indireto) para confirmar sua 
positividade ou negatividade  Estas hemácias com teste positivo serão consideradas D+!
Receptores de sangue ou gestantes que possuem antígenos D parciais podem se 
sensibilizar caso sejam expostos aos antígenos D positivo. Por isso cada vez mais se in‑
veste na obtenção de reagentes que sejam capazes de realizar a detecção de todos esses 
antígenos D variantes.
Aplicação da Teoria na Prática 
O antígeno RhD apresenta um extenso polimorfismo. Pode se apresentar como um 
antígeno com fraca expressão (D fraco) ou como um antígeno modificado (D parcial) e por 
isso existe a necessidade de muita atenção na prática profissional com este tipo de teste.
Esse polimorfismo causa dificuldades na classificação RhD. O reconhecimento de 
amostras com fraca expressão do antígeno RhD depende do método e da qualida‑
de do reagente anti‑D empregado. O surgimento dos reagentes monoclonais e o de‑
senvolvimento das técnicas moleculares nos trouxeram grande contribuição para o es‑
clarecimento dessas diferentes formas de expressão do antígeno RhD. Assim, mesmo 
apresentando‑se enfraquecido ou parcial, o antígeno RhD pode determinar formação de 
anticorpos em indivíduos RhD negativos.
Os antígenos D fraco e D parcial
O antígeno D pode apresentar variações em sua expressão fenotípica devido a alte‑
rações em sua qualitativas e/ou quantitativas. Esses antígenos são globalmente denomi‑
nados D variantes.
• Antígenos D fraco: Os antígenos D fracos são variações quantitativas do antígeno 
RhD e todos os epítopos (regiões reconhecidas por anticorpos) estão íntegros na 
membrana eritrocitária, porém expressos fracamente;
• Antígenos D parciais: Os antígenos D parciais são caracterizados pela ausência de 
um ou mais epítopos da proteína D, que são substituídos por epítopos da proteína 
CcEe. Estas alterações ocorrem por alterações moleculares no gene RhD, que leva 
a substituições dispersas de aminoácidos nas alças extracelulares da proteína, em 
especial nas alças extracelulares. Vários epítopos apresentam‑se alterados devido à 
presença de aminoácidos diferentes da proteína D normal. Dependendo do tipo de 
antígeno D a densidade antigênica varia.
Veja o fluxograma a seguir acerca de interpretação do Rh:
14
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Figura 1 – Fluxograma de Interpretação
Fonte: Adaptada de bvsms.saude.gov
Experimento 1 (Atividade prática)
Preparo de Solução de Hemácias 5% E Tipagem Rh
Materiais e Reagentes Necessários
• Amostras de sangue total (preferencialmente que seja Rh‑);
• Salina;
• Tubos de ensaio de 12 x 75 mm;
• Descarte;
• Estante para tubos;
• Centrífuga;
• Pipetas pasteur;
• Pipetadores; 
• Ponteiras; 
• Soro anti‑D;
• Controle Rh.
Preparo da solução de hemácias 5%
1. Pingar de 3 a 5 gotas de sangue total do tubo de ensaio;
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UNIDADE Prática
2. Adicionar aproximadamente 3/4 de salina no tubo (Primeira lavagem);
3. Centrifugar a 3400 rpm por 1 minuto;
4. Desprezar o sobrenadante;
5. Adicionar aproximadamente 3/4 de salina no tubo (Segunda lavagem);
6. Centrifugar a 3400 rpm por 1 minuto;
7. Desprezar o sobrenadante;
8. Adicionar aproximadamente 3/4 de salina no tubo (Terceira lavagem);
9. Centrifugar a 3400 rpm por 1 minuto;
10. Desprezar o sobrenadante;
11. Adicionar 19 gotas de salina.
Determinação do Rh
1. Identificar 2 tubos como: RH e o outro CONTROLE;
2. No tubo RH colocar 1 gota de soro anti‑D e 50µL da suspensão de hemácias 5%;
3. No tubo CONTROLE 1 gota de Controle RH e 50µL da suspensão de hemá‑
cias 5%;
4. Centrifugar os tubos a 1000 rpm por 1 minuto;
5. Ressuspender o botão de hemácias, agitando suavemente cada tubo, ler contra 
fundo luminoso e interpretar.
Tabela 6 – Interpretação
Tubo Rh Tubo Controle Rh
Aglutinação Ausência de aglutinação Positivo
Ausência de aglutinação Ausência de aglutinação Negativo
*Reação positiva no tubo controle, invalida o teste para a determinação do RH
Pergunta
a) Qual a tipagem Rh identificada em seu experimento? 
Experimento 2 (Atividade prática)
Pesquisa do D Fraco
Materiais e Reagentes Necessários
• Hemácias à 5% (feitas no experimento 1);
• Salina;
• Tubos de ensaio de 12 x 75 mm;
• Descarte;
• Estante para tubos;
• Centrífuga;
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• Banho‑maria;
• Pipetas pasteur; 
• Pipetadores; 
• Ponteiras; 
• Soro anti‑d;
• Controle rh;
• Soro de Coombs;
• Controle de Coombs (controcel).
Procedimento para Pesquisa D fraco
1. Identifi car 2 tubos como: D fraco e o outro CONTROLE;
2. No tubo D fraco 1 gota de soro anti‑D e 50µL da suspensão de hemácias 5%; 
3. No tubo CONTROLE 1 gota de Controle RH e 50µL da suspensão de hemá‑
cias 5%;
4. Centrifugar os tubos a 1000 rpm por 1 minuto;
5. Ressuspender o botão de hemácias, agitando suavemente cada tubo, ler contra 
fundo luminoso e interpretar;
6. Se negativo, incubá‑los por 15 minutos a 370C;
7. Centrifugar os tubos a 1000 rpm por 1 minuto;
8. Se negativo, lavá‑los 3 vezes com salina, centrifugando a 3400 rpm por 1 mi‑
nuto, desprezando completamente o sobrenadante na última lavagem;
9. 2 gotas de soro de Coombs em cada tubo, centrifugar a 1000 rpm por 1 minu‑
to e ler (FASE DE COOMBS);
10. Se negativo, 1 gota de Controle de Coombs (controcel) em cada tubo, centrifugar 
a 1000 rpm por 1 minuto e ler. A leitura deste item deverá ser sempre POSITIVA;
11. *a leitura do tubo Controle do RH deverá ser negativa.
Interpretação:
• RH Negativo: se após a leitura na fase de Coombs não ocorrer aglutinação: Au‑
sência do antígeno D fraco;
• RH Positivo: se houver aglutinação em qualquer das fases: Presença do antígeno 
D fraco.
Perguntas
a) Qual a tipagem identifi cada em seu experimento?
b) Qual a importância da pesquisa de D fraco / D parcial?
c) Se houver presença de D fraco (aglutinação), este paciente é considerado Rh+ 
ou Rh‑?
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UNIDADE Prática
Material Complementar
Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade:
 Livros
Fundamentos e técnicas em banco de sangue
Leia o capítulo 4 do livro: VIZZONI, A. G. Fundamentos e técnicas em banco de sangue. 
São Paulo: Erica, 2015. (e-book)
Fundamentos da imuno-hematologia eritrocitária
Leia o capítulo 7 – Sistema Rh (ISBT 004) GIRELLO, A. L.; KUHN, T. I. B. B. Fundamen‑
tos da imuno‑hematologia eritrocitária. 3ª Ed. 
 Leitura
Antígeno RhD: Du, D fraco, D parcial e testes laboratoriais
https://bit.ly/3BA41Bi
Serological weak D phenotypes: a review and guidance 
for interpreting the RhD blood type usingthe RHD genotype
https://bit.ly/3DHfb9z
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Tema 3 – Coombs Direto e Coombs Indireto
O teste de Coombs Direto ou também chamado de Teste da Antiglobulina Direto 
(TAD) é uma técnica laboratorial da imuno‑hematologia que serve para determinar se os 
eritrócitos foram fixados in vivo por imunoglobulinas, complemento ou ambos.
É usado principalmente na investigação de:
• Reações transfusionais hemolíticas;
• Doença hemolítica do feto e do recém‑nascido;
• Anemia hemolítica autoimune;
• Hemólise induzida por drogas etc. 
Os anticorpos ditos incompletos “imunes”, quando em contato com hemácias que 
contenham o antígeno correspondente, fixam‑se na membrana das mesmas, bloqueando 
o antígeno; não têm, entretanto, a capacidade de aglutinar estas hemácias.
O soro de Coombs (soro antiglobulina humana) é capaz de promover a aglutinação 
dessas hemácias, ditas sensibilizadas.
Já quando um soro que contenha anticorpos incompletos for incubado, em um ótimo 
de temperatura, com hemácias que contenham o antígeno correspondente, os anticor‑
pos fixam‑se à superfície destas hemácias e bloqueiam o antígeno. As hemácias assim 
bloqueadas (sensibilizadas) serão reveladas pelo soro de Coombs (soro antiglobulina hu‑
mana). Através do teste de Coombs Indireto ou também chamado de Teste da Anti‑
globulina Indireto (TAI), pesquisa‑se a presença de anticorpos incompletos ou imunes 
presentes no soro.
Aplicação da Teoria na Prática 
A utilização do soro antiglobulina humana, na avaliação imunológica eritrocitária, 
pode ser considerada como a mais importante descoberta da medicina transfusional, 
depois do sistema de grupo sanguíneo ABO. A facilidade de execução do teste antiglo‑
bulina e a informação diagnóstica que fornece contribuíram para sua utilização em larga 
escala até os dias de hoje.
Indicações do teste da antiglobulina direto (TAD) ou Coombs direto:
O TAD é uma ferramenta importante no diagnóstico das anemias hemolíticas imu‑
nes, incluindo as anemias: hemolíticas autoimunes, hemolíticas induzidas por drogas e 
as hemolíticas aloimunes (doença hemolítica perinatal e reação hemolítica transfusional). 
Veja na tabela a seguir exemplos das principais causas de TAD positivo:
Quadro 1 
Reação transfusional 
hemolítica
• Aloanticorpos do receptor de uma transfusão recente reagem 
com antígenos presentes nas hemácias do doador;
• Anticorpos presentes no plasma do doador reagem com antí‑
genos nas hemácias de um receptor de transfusão.
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UNIDADE Prática
Drogas (medicamentos)
• Anticorpos “drogas dependentes”. Anticorpo IgG e complemento 
podem ser detectados na membrana da hemácia quando a droga 
participa da reação. Exemplos: penicilinas e cefalosporinas;
• Anticorpos “drogas independentes”. Droga induz à formação 
de um anticorpo indistinguível dos autoanticorpos encontra‑
dos nas AHAI. Não é necessária a adição da droga “in vitro” para 
a detecção do anticorpo. Exemplos: metildopa e fludarabine.
Anemia hemolítica 
autoimune (AHAI)
• AHAI “a quente”: autoanticorpos IgG e/ou C3 reagem “in vivo” 
com hemácias;
• Doença da aglutinina a frio: autoanticorpos IgM e complemen‑
to ligam‑se às hemácias na circulação periférica e podem ser 
posteriormente eluídos em áreas mais aquecidas, restando 
apenas o complemento aderido à hemácia;
• Hemoglobinúria paroxística ao frio: autoanticorpos IgG reagem 
com hemácias na periferia e podem posteriormente ativar a via 
do complemento.
Doença hemolítica 
perinatal (DHPN)
• Aloanticorpos maternos (IgG) atravessam placenta e reagem 
com hemácias fetais.
Fonte: Adaptado de bvsms.saude.gov
Teste da antiglobulina indireto (TAI) ou Coombs Indireto
O TAI tem como objetivo determinar a sensibilização de hemácias “in vitro”. O teste 
é largamente empregado na investigação imuno‑hematológica para a detecção e identi‑
ficação de anticorpos incompletos (não aglutinantes) de importância clínica no soro de 
doadores e pacientes, na fenotipagem eritrocitária e titulação de anticorpos incomple‑
tos. Veja a tabela a seguir sobre aplicações do teste da antiglobulina indireto:
Quadro 2
Detecção de 
anticorpos 
antieritrocitários
• Pesquisa de anticorpos antieritrocitários irregulares (PAI): anti‑
corpos reagem com reagentes eritrocitários / triagem;
• Prova cruzada: anticorpos do receptor reagem com hemácias 
do doador.
Identificação 
de anticorpos 
antieritrocitários
• Painel de hemácias: anticorpos reagem com hemácias do painel.
Titulação de 
anticorpos
• Anticorpos (diferentes diluições) reagem com hemácias selecionadas.
Fenotipagem 
eritrocitária
• Detecção de antígenos eritrocitários (K, Fy etc.);
• Pesquisa de antígenos de fraca expressão.
Fonte: Adaptado de bvsms.saude.gov
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Experimento 1 (Atividade prática)
Coombs Direto
Materiais e Reagentes Necessários
• Amostra de sangue total;
• Salina;
• Tubos de ensaio de 12 x 75 mm;
• Pipetas Pasteur;
• Estante para tubo;
• Descarte;
• Pipetas;
• Ponteiras;
• Soro de coombs;
• Controle de coombs;
• Centrifuga.
Preparo da solução de hemácias 5%
1. Pingar de 3 a 5 gotas de sangue total do tubo de ensaio;
2. Adicionar aproximadamente 3/4 de salina no tubo (Primeira lavagem);
3. Centrifugar a 3400 rpm por 1 minuto;
4. Desprezar o sobrenadante;
5. Adicionar aproximadamente 3/4 de salina no tubo (Segunda lavagem);
6. Centrifugar a 3400 rpm por 1 minuto;
7. Desprezar o sobrenadante;
8. Adicionar aproximadamente 3/4 de salina no tubo (Terceira lavagem);
9. Centrifugar a 3400 rpm por 1 minuto;
10. Desprezar o sobrenadante;
11. Adicionar 19 gotas de salina.
Coombs Direto
1. 50µL da suspensão de hemácias 5% (paciente);
2. Lavar 4 vezes com salina, centrifugando a 3400 rpm por 1 minuto, desprezan‑
do completamente o sobrenadante na última lavagem;
3. 2 gotas de soro de Coombs, centrifugar a 1000 rpm por 1 minuto, ressuspen‑
der o botão de hemácias agitando suavemente e ler;
4. Controle da reatividade do soro Antiglobulina Humana (Coombs): se o teste for 
negativo, adicionar 1 gota do Controle de Coombs, centrifugar a 1000 rpm por 
1 minuto. Esta etapa deverá ser POSITIVO (controle).
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UNIDADE Prática
Tabela 7 – Interpretação
Leitura Teste de Coombs Direto
Aglutinação Positivo
Ausência de aglutinação Negativo
Pergunta
a) Qual o resultado obtido em seu experimento? O que isso significa?
Experimento 2 (Atividade prática)
Coombs Indireto
Materiais e Reagentes Necessários
• Suspensão de hemácias à 5% com hemácias conhecidas quanto ao antígeno;
• Soro a ser testado;
• Salina;
• Tubos de ensaio de 12 x 75 mm;
• Pipetas pasteur;
• estante para tubo;
• descarte;
• pipetas;
• ponteiras;
• soro antiglobulina humana;
• centrífuga;
• banho‑maria;
Coombs Indireto
1. Preparar uma suspensão salina a 5% com hemácias conhecidas quanto ao 
antígeno e cujo anticorpo correspondente se deseja detectar (o mais comum 
é a detecção de anticorpos anti‑ Rh positivo, anti‑D). As hemácias devem ser 
compatíveis com o soro quanto ao sistema ABO (comumente empregam‑se 
hemácias do grupo O, Rh positivo);
2. Colocar duas gotas da suspensão em um tubo de 12x75 mm e lavar três vezes 
com solução salina
3. Adicionar duas gotas do soro a ser testado;
4. Misturar e incubar em banho a 37oC, durante 30 a 45 minutos
5. A seguir, lavar as hemácias três vezes com solução salina e adicionar o soro 
anti‑globulina humana (duas gotas);
6. Agitar e centrifugar a 1.000 rpm. por 15 segundos;
7. Proceder a leitura.
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Interpretação
• Presença de aglutinação: Teste de Coombs Indireto Positivo;
• Ausência de aglutinação: Teste de Coombs Indireto Negativo.
Observações
• É aconselhável o emprego de controles positivos e negativos;
• Nos casos da prova de Coombs Indireta ser positiva, o soro deverá ser diluído em 
salina (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, etc.) e repetir a prova em cada um dos tubos. O título 
será dado pela última diluição com resultado positivo (cuidado com “o fenômeno 
de zona”).
Pergunta
a) Qual o resultado obtido em seu experimento? O que isso signifi ca?
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UNIDADE PráticaMaterial Complementar
Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade:
 Livros
Fundamentos da imuno-hematologia eritrocitária
Leia o Capítulo 4: Teste de antiglobulina humana, capítulo 9: Doença hemolítica perinatal 
e capítulo 10: Anemia hemolítica autoimune (AHAI). GIRELLO, A. L.; KUHN, T. I. B. B. 
Fundamentos da imuno‑hematologia eritrocitária. 3. ed. 
 Leitura
Teste de Coombs Indireto
https://bit.ly/3yIuhYs
Teste da Antiglobulina Direto (Coombs direto)
https://bit.ly/3jItfHD
Teste de Antiglobulina do livro Imunohematologia Laboratorial
https://bit.ly/3zJ4pgB
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Tema 4 – Pesquisa de Anticorpos
Irregulares (Pai) e Prova Cruzada
A pesquisa de anticorpos irregulares (P.A.I) é realizada testando‑se o soro do 
receptor contra hemácias tipo O (coombs indireto), com fenotipagem conhecida para 
os mais importantes sistemas sanguíneos.
O teste PAI tem como finalidade detectar possíveis anticorpos clinicamente significa‑
tivos. É importante conhecer diagnóstico clínico do paciente:
• História de transfusões; 
• Gestação . 
Interpretação:
P.A.I: 
• Positivo (+): aglutinação e/ou hemólise;
• Negativo (‑): ausência de aglutinação e/ou hemólise.
Se P.A.I+, deve‑se proceder com a identificação de anticorpos irregulares (IAI), a 
qual é uma interpretação complexa, porém necessária que é feita através de diagrama:
1º passo: entender o diagrama...
No diagrama do painel estão listados, nas colunas verticais, os antígenos de grupos 
sanguíneos mais importantes na prática pré‑transfusional (Figura 2).
Cada hemácia contida nos frascos do kit provém de doadores diferentes, identificados 
com números nas linhas horizontais e, portanto, possuem fenótipos eritrocitários distintos.
Figura 2 – Exemplo de diagrama de IAI
Fonte: Reprodução
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UNIDADE Prática
2º passo: registrar os resultados...
Registrar positivo (+) e negativo (0), avaliando‑se a presença ou ausência das aglutinações.
3º passo: avaliar os resultados possíveis e interpretar...
__________________________________________________________
Prova Cruzada (= Prova de Compatibilidade Maior)
Propósito: selecionar a bolsa de concentrado de hemácias que possibilite alcançar a 
sobrevida mais próxima do normal das hemácias transfundidas. Dessa forma podemos:
• Assegurar compatibilidade ABO; 
• Evitar sensibilização ao Ag RhD e assegurar compatibilidade em pacientes já 
sensibilizados; 
• Detectar: 
 » O maior número de anticorpos com importância clínica (mesmo quando em 
baixos níveis);
 » O menor número possível de anticorpos sem importância clínica.
A prova cruzada tem como princípio a pesquisa do anticorpo existente no soro 
do paciente (receptor) em relação a presença ou não do antígeno da hemácia do 
doador. Esta prova, também chamada de Prova Cruzada Maior, é um dos ensaios 
que compreende as Provas de Compatibilidade realizadas nos Serviços de Hemoterapia 
como pré‑requisito de uma transfusão sanguínea de Concentrados de Hemácias. 
A prova cruzada deve ser realizada concomitantemente com outras provas, como por 
exemplo, o PAI, que deve ser acompanhado de uma Auto‑Prova (soro do paciente com 
hemácias do paciente), para que se possa avaliar auto‑anticorpos presentes na circulação.
Porém, ATENÇÃO! O teste compatível não garante sobrevida normal das hemácias 
transfundidas, nem previne reações indesejáveis  pois pode haver sensibilização pré‑
via, em caso de anticorpos em baixa concentração no soro do receptor!
Aplicação da Teoria na Prática 
A pesquisa de anticorpos irregulares (P.A.I) tem como princípio a triagem de an‑
ticorpos eritrocitários desenvolvidos no soro do paciente pela ausência dos respectivos 
antígenos correlatos do sistema sanguíneo com a utilização da Anti‑Globulina Humana 
ou Soro de Coombs, usando a Técnica de Coombs Indireto, também conhecida como 
Teste da Anti‑Globulina Indireta.
Já a identificação de Anticorpos Irregulares (I.A.I) tem como princípio a iden‑
tificação de anticorpos eritrocitários irregulares desenvolvidos pela ausência dos res‑
pectivos antígenos correlatos dos sistemas sanguíneos pela utilização de um Painel de 
Identificação, constituído de várias hemácias fenotipadas e caracterizadas por diagrama 
com as características de cada anticorpo de importância clínica. Atualmente os kits 
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disponíveis no mercado podem variar a quantidade de hemácias que caracterizam este 
painel (de 10 a 15 hemácias).
E por fim, a prova cruzada tem como princípio a pesquisa do anticorpo existente 
no soro do paciente (receptor) em relação a presença ou não do antígeno da hemácia 
do doador. Esta prova, também chamada de Prova Cruzada Maior, é um dos ensaios 
que compreende as Provas de Compatibilidade realizadas nos Serviços de Hemoterapia 
como pré requisito de uma transfusão sanguínea de Concentrados de Hemácias. Deve 
ser realizada concomitantemente com outras provas, como por exemplo, o PAI, que 
deve ser acompanhado de uma Auto‑Prova (soro do paciente com hemácias do pacien‑
te), para que se possa avaliar auto‑anticorpos presentes na circulação, ou quando um 
resultado positivo é obtido para a pesquisa de anticorpo intravascular pela Técnica do 
Coombs Direto.
Sendo assim, estes testes imunohematológicos estão diariamente na rotina do profis‑
sional atuante nesta área.
Experimento 1 (Atividade prática)
Pesquisa de Anticorpos Irregulares por Coombs Indireto (P.A.I)
Materiais e Reagentes Necessários
• Tubos de ensaio de 12 x 75 mm;
• Suspensão de hemácias do tipo i (reagente);
• Suspensão de hemácias do tipo ii (reagente);
• Albumina bovina a 22%;
• Soro de coombs;
• Controle de coombs;
• Amostra de plasma a ser testado;
• Centrífuga; 
• Banho‑maria;
• Estante para tubo;
• Descarte;
• Pipetas;
• Ponteiras;
• Tubos de ensaio de 12 x 75 mm.
Procedimento 
1. Identifi car 2 tubos como 1 e 2;
2. Adicionar 1 gota de suspensão de hemácias do tipo I (reagente) no tubo 1 e 1 
gota de suspensão de hemácias do tipo II (reagente) no tubo 2;
3. Adicionar 100 uL de plasma do paciente;
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UNIDADE Prática
4. Centrifugar a 1000rpm por 1 minuto, ressuspender o botão de hemácias, agi‑
tando suavemente cada tubo, ler contra fundo luminoso e interpretar o resultado 
(FASE SALINA);
5. Adicionar 2 gotas de albumina bovina a 22% em cada tubo;
6. Centrifugar a 1000rpm por 1 minuto, ressuspender o botão de hemácias, agi‑
tando suavemente cada tubo, ler contra fundo luminoso e interpretar o resultado 
(FASE ALBUMINOSA);
7. Incubar a 370C por 30 minutos;
8. Centrifugar a 1000rpm por 1 minuto, ressuspender o botão de hemácias, agi‑
tando suavemente cada tubo, ler contra fundo luminoso e interpretar o resulta‑
do (FASE TÉRMICA);
9. Lavar 3 vezes com salina, centrifugando a 3400 rpm por 1 minuto, desprezan‑
do completamente o sobrenadante na última lavagem;
10. Adicionar 2 gotas de soro de Coombs, centrifugar a 1000rpm por 1 minuto, 
ressuspender o botão de hemácias, agitando suavemente cada tubo, ler contra 
fundo luminoso e interpretar o resultado (FASE DE COOMBS);
11. Controle da reatividade do soro Antiglobulina Humana (Coombs): se o teste for 
negativo, adicionar 1 gota do Controle de Coombs em ambos os tubos, centri‑
fugar a 1000 rpm por 1 minuto. Esta etapa deverá ser POSITIVO (controle).
Tabela 8 – Interpretação
Leitura Teste de Coombs Indireto
Aglutinação Positivo
Ausência de aglutinação Negativo
Pergunta
a) Qual o resultado obtido em seu experimento? O que isso significa?
b) Caso resultado positivo, qual a próxima etapa a ser feita em um banco de sangue?
Experimento 2 (Atividade prática)
Prova-Cruzada – Prova de Compatibilidade Maior
Materiais e Reagentes Necessários
• Amostra do “paciente”;
• Amostra do “doador” (bolsa);
• Salina;
• Pipetadores;
• Ponteiras;
• Pipetas pasteur;
• Tubo de ensaio de 12 x 75 mm;
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• Estante para tubo;
• Descarte;
• Centrífuga;
• Banho‑maria;
• Albumina bovina a 22%;
• Soro de Coombs;
• Controle de Coombs.
Preparo da solução de hemácias 5% (da bolsa a ser testada)
1. Pingar de 3 a 5 gotasde sangue total do tubo de ensaio;
2. Adicionar aproximadamente 3/4 de salina no tubo (Primeira lavagem);
3. Centrifugar a 3400 rpm por 1 minuto;
4. Desprezar o sobrenadante;
5. Adicionar aproximadamente 3/4 de salina no tubo (Segunda lavagem);
6. Centrifugar a 3400 rpm por 1 minuto;
7. Desprezar o sobrenadante;
8. Adicionar aproximadamente 3/4 de salina no tubo (Terceira lavagem);
9. Centrifugar a 3400 rpm por 1 minuto;
10. Desprezar o sobrenadante;
11. Adicionar 19 gotas de salina.
Prova Cruzada (Prova de Compatibilidade)
1. Centrifugar a amostra do paciente;
2. Preparar a suspensão de hemácias do doador (bolsa) 5%;
3. Identifi car o tubo e adicionar 50µL de suspensão de hemácias 5% do doador 
(bolsa);
4. Adicionar 100µL de soro do paciente;
5. Centrifugar a 1000rpm por 1 minuto, ressuspender o botão de hemácias, agi‑
tando suavemente cada tubo, ler contra fundo luminoso e interpretar o resulta‑
do (FASE SALINA);
6. Adicionar 2 gotas de albumina bovina a 22% em cada tubo;
7. Centrifugar a 1000rpm por 1 minuto, ressuspender o botão de hemácias, agi‑
tando suavemente cada tubo, ler contra fundo luminoso e interpretar o resulta‑
do (FASE ALBUMINOSA);
8. Incubar a 370C por 15 minutos;
9. Centrifugar a 1000rpm por 1 minuto, ressuspender o botão de hemácias, agi‑
tando suavemente cada tubo, ler contra fundo luminoso e interpretar o resulta‑
do (FASE TÉRMICA);
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UNIDADE Prática
10. Lavar 3 vezes com salina, centrifugando a 3400 rpm por 1 minuto, desprezan‑
do completamente o sobrenadante na última lavagem;
11. Adicionar 2 gotas de soro de Coombs, centrifugar a 1000rpm por 1 minuto, 
ressuspender o botão de hemácias, agitando suavemente cada tubo, ler contra 
fundo luminoso e interpretar o resultado (FASE DE COOMBS);
12. Controle da reatividade do soro Antiglobulina Humana (Coombs): se o teste for 
negativo, adicionar 1 gota do Controle de Coombs em ambos os tubos, cen‑
trifugar a 3400 rpm por 15 segundos ou 1000 rpm por 1 minuto. Esta etapa 
deverá ser POSITIVO (controle).
Tabela 9 – Interpretação
Leitura Prova Cruzada
Ausência de aglutinação ou hemólise em todas as fases Compatível
Presença de aglutinação em qualquer fase Incompatível
Pergunta
a) Qual o resultado obtido em seu experimento? O que isso significa?
b) Qual a importância da prova‑cruzada na prática transfusional?
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Material Complementar
Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade:
 Leitura
Imunohematologia 
https://bit.ly/3DIzcMN 
Pesquisa de Anticorpos Irregulares Anti-Eritrocitários pela Técnica de Coombs
https://bit.ly/3yKpHJp
Perfil de Anticorpos Irregulares Identificados em Pacientes do Hospital São Lucas Da Pucrs 
https://bit.ly/3yIujj9
Reveja Conceitos Básicos em Imuno-Hematologia Eritrocitária
https://bit.ly/38F6G0s
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