Reparo e recombinação de DNA

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REPARO E RECOMBINAÇÃO DO DNA. DNA FINGERPRINTING
REPARO DO DNA
A melhor maneira de ilustrar a importância do reparo do DNA é considerar os efeitos do dano no DNA não reparado (uma lesão). O resultado mais sério é uma mudança na sequência de bases do DNA, a qual, se replicada e transmitida a gerações de células futuras, se torna permanente. Uma alteração permanente na sequência de nucleotídeos de DNA é chamada de mutação. Mutações podem envolver a substituição de um par de bases por outro (mutação de substituição) ou a adição ou deleção de um ou mais pares de bases (mutações de inserção ou deleção). Se a mutação afeta um DNA não essencial ou se ela tem um efeito desprezível na função de um gene, ela é conhecida como mutação silenciosa. Em raras ocasiões, uma mutação confere alguma vantagem biológica. A maioria das mutações não silenciosas, entretanto, é neutra ou deletéria.
Os sistemas de reparo do DNA são essenciais à vida, pois há apenas uma ou duas cópias de DNA genômico por célula, e a informação contida nesta é responsável pela síntese de todo RNA e proteínas. O DNA pode ser danificado por vários processos espontâneos ou de causa ambiental, além de poder haver erros de replicação. A mudança permanente da sequência do DNA, ou mutação, pode envolver a troca, deleção ou soma de bases. Como resultado da importância funcional das mutações e da frequência de milhares de lesões do DNA por célula diariamente, os sistemas de reparo têm uma importância vital na manutenção da integridade da célula. Refletindo esta importância, existem muitos sistemas de reparo diferentes, com funções e mecanismos de funcionamento distintos. Estes sistemas também têm como característica a utilização de grande quantidade de energia na forma de ATP.
· DESPAREAMENTO/MALPAREAMENTO
O reparo ocorre quando há um pareamento errado. Nos procariotos, é direcionado pela submetilação transitória das sequencias (5’)GATC nas fitas recém sintetizadas depois da replicação. Malpareamentos de replicação nas proximidades de uma sequência GATC hemimetilada são, então, reparados de acordo com a informação na fita metilada (molde) parental. Testes in vitro demonstram que se ambas as fitas forem metiladas na sequência GATC, poucos malpareamentos são reparados; se nenhuma fita for metilada, o reparo ocorre, mas não favorece qualquer fita.
O sistema de reparação de mal pareamentos consiste de várias proteínas, codificadas pelos genes mut. Esse sistema percorre o DNA recentemente sintetizado a procura de pares de bases mal pareadas próximo as sequencias (5’)GATC da fita recém sintetizada (ainda não metilada) e remove os segmentos de fita simples contendo nucleotídeos incorretos, em um processo que envolve pelo menos quatro etapas. Isto permite que a DNA-polimerase insira a base correta na lacuna formada.
Todas as células eucariontes têm várias proteínas estruturalmente e funcionalmente análogas às proteínas bacterianas Mut, mas não apresentam o artifício engenhoso de E.coli de utilizar a hemimetilação para marcar a fita parental. Muitos detalhes dos eventos subsequentes no reparo de mal pareamento em eucariontes continuam a ser decifrados. Em particular, não se conhece o mecanismo pelo qual fitas de DNA recém-sintetizadas são identificadas, embora pesquisas tenham revelado que essa identificação da fita não envolve sequências GATC.
Em eucariotos, os sistemas de reparo de bases não pareadas são menos conhecidos, mas há proteínas semelhantes às bacterianas, e mutações nestas proteínas levam a alta propensão a câncer de causa genética, como o xeroderma pigmetoso. Nesta doença, há falha de reparo de dímeros de pirimidina, levando a alta susceptibilidade a tumores de pele promovidos por raios solares e também alterações neurológicas decorrentes do alto metabolismo oxidativo e geração de espécies reativas de oxigênio no cérebro.
· EXCISÃO DE BASES
Cada célula tem uma classe de enzimas denominadas DNA-glicosilases que reconhecem lesões particularmente comuns no DNA e removem a base afetada por meio da clivagem da ligação N-glicosil. Essa clivagem cria um sítio apurínico ou apirimidínico no DNA, comumente denominado sítio AP ou sítio abásico. Cada DNA-glicosilase é geralmente específica para um tipo de lesão.
As uracila DNA-glicosilases, por exemplo, encontradas na maioria das células, removem especificamente do DNA o uracila que é resultado da desaminação espontânea da citosina. A primeira ação da uracila-DNA-glicosilase é hidrolisar a ligação glicosídica entre a uracila e as moléculas de desoxirribose. Neste estágio, a cadeia de DNA está intacta, mas sua base é perdida. Esta fenda é chamada de sítio AP, porque se torna apurínico (perde A ou G) ou apirimidínico (perde C ou T). A enzima AP endonuclease reconhece este defeito e cliva a cadeia de DNA na posição 5' do sítio AP, deixando um 3'-OH; e a exonuclease cliva a posição 3' do sítio AP, deixando um fosfato 5'. A lacuna resultante é preenchida pela DNA-polimerase I, que insere a citosina, de acordo com a orientação fornecida pela fita complementar não danificada contendo uma guanina. Finalmente, a integridade da fita corrigida é restaurada pela DNA-ligase. 
Outras DNA-glicosilases reconhecem e removem várias bases danificadas, incluindo a formamidopirimidina e a 8-hidroxiguanina (ambas derivadas da oxidação da purina), hipoxantina (derivada da desaminação da adenina) e bases alquiladas, como a 3-metiladenina e a 7-metilguanina.
· EXCISÃO DE NUCLEOTIDEOS
Lesões no DNA que provocam grandes distorções na estrutura helicoidal do DNA geralmente são reparadas pelo sistema de excisão de nucleotídeos, uma via de reparo crítica para a sobrevivência de todos os organismos de vida livre. No reparo de excisão de nucleotídeos, uma enzima de multissubunidades (excinuclease) hidrolisa duas ligações fosfodiésteres, uma de cada lado da distorção provocada pela lesão. Em E. coli e outras bactérias, o sistema enzimático hidrolisa a quinta ligação fosfodiéster no lado 3’ e a oitava ligação fosfodiéster no lado 5’ para gerar um fragmento de 12 a 13 nucleotídeos (dependendo se a lesão envolve uma ou duas bases). Em humanos e outros eucariontes, o sistema enzimático hidrolisa a sexta ligação fosfodiéster no lado 3’ e a vigésima segunda ligação fosfodiéster no lado 5’, produzindo um fragmento de 27 a 29 nucleotídeos. Após a incisão dupla, os oligonucleotídeos retirados são liberados do duplex, e o espaço resultante é preenchido – pela DNA-polimerase I em E. coli e pela DNA-polimerase ε em humanos. A DNA-ligase fecha o corte.
Um complexo de proteínas Uvr (A, B, C, D) é que fazem o reconhecimento do sitio da lesão, a excisão do fragmento e remoção do mesmo. 
· REPARO DIRETO
Vários tipos de danos são reparados sem a remoção de uma base ou nucleotídeo. O exemplo mais bem caracterizado é a fotorreativação direta dos dímeros de ciclobutano pirimidina, reação promovida pelas DNA-fotoliases. Os dímeros de pirimidina resultam de uma reação induzida por UV, e as fotoliases utilizam energia derivada da luz absorvida para reverter o dano. As fotoliases possuem cofatores que agem como agentes de absorção de luz (cromóforos), um deles é sempre o FADH-FADH2. Em E.coli e leveduras, outro cromóforo é o folato.
Exemplos adicionais podem ser observados no reparo de nucleotídeos com dano por alquilação. O nucleotídeo modificado O6-metilguanina se forma na presença de agentes alquilantes e é uma lesão altamente mutagênica e comum. Ele tende a parear com timina em vez de citosina durante a replicação, provocando mutações. Reparo direto de O6-metilguanina é realizado por O6-metilguanina-DNA metiltransferase, proteína que catalisa a transferência do grupo metil da O6-metilguanina para um de seus próprios resíduos Cys, ficando inativada.
· REPARO POR RECOMBINAÇÃO DE DNA/ síntese de DNA translesão sujeita a erro (TLS)
O reparo de DNA com lesões que acometem ambas as fitas, como quebras ou ligações cruzadas é mais complexo. Estas lesões geralmente surgem por causa de lesões oxidativas, radiação ionizante ou lesões em uma fita seguidas de replicaçãodaquela porção. Neste caso, como não há molde local para providenciar a informação necessária ao reparo, é necessário haver recombinação gênica homóloga (vindo de um cromossomo separado) ou reparo sem molde (Quando essa via é ativa, o reparo do DNA se torna significativamente menos preciso e pode resultar em uma alta taxa de mutação). Em bactérias, a síntese de DNA translesão propensa a erro, é parte de uma reposta celular ao estresse de lesões extensas do DNA, chamada resposta SOS.
O fato de ser considerado um sistema que aumenta a taxa de mutações mesmo estando dentro do grupo de sistemas de reparo do DNA soa incoerente, mas deve ser levada em consideração que essa resposta é uma estratégia desesperada para a sobrevivência da célula, ela permite a continuidade da replicação, mesmo que seja com mutações.
RECOMBINAÇÃO
Em períodos de tempo mais longos, a sobrevivência dos organismos pode depender da variação genética, pela qual eles podem se adaptar às mudanças ambientais. Uma importante propriedade do DNA das células é a sua capacidade de sofrer rearranjos, que podem ocasionar desde novas combinações entre os genes presentes em qualquer genoma individual até alterações qualitativas e quantitativas na expressão desses genes. Esses rearranjos do DNA são realizados pela recombinação genética.
Os eventos de recombinação genética caem em pelo menos três grandes classes. A recombinação genética homóloga (também chamada recombinação geral) envolve alterações genéticas entre duas moléculas de DNA quaisquer (ou segmentos da mesma molécula) que compartilham uma região estendida de sequência praticamente idêntica. A sequência real de bases é irrelevante, desde que seja semelhante nos dois DNA. Na recombinação sítio-específica as trocas ocorrem apenas em uma sequência particular do DNA. A transposição de DNA é diferente das outras duas classes porque geralmente envolve um segmento curto de DNA com a capacidade marcante para se mover de uma localização no cromossomo para outra.
As funções dos sistemas de recombinação genética são tantas quanto os seus mecanismos. Elas incluem papéis em sistemas de reparo de DNA especializados, atividades especializadas na replicação do DNA, regulação da expressão de certos genes, facilitação da segregação adequada de cromossomos durante a divisão celular eucariótica, manutenção da diversidade genética e implementação de rearranjos genéticos programados durante o desenvolvimento embrionário.
RECOMBINAÇÃO GENÉTICA HOMÓLOGA
Em bactérias, a recombinação genética homóloga é principalmente um processo de reparo do DNA e, nesse contexto é denominado de reparo do DNA recombinante. Geralmente é direcionado para a reconstrução de forquilhas de replicação que colapsaram.
No processo de reparação da forquilha, uma das fitas do cromossomo quebrado é digerida para dar origem a uma extremidade 3'-OH de fita simples. Essa extremidade invade o dúplex homólogo, promovendo o deslocamento de uma das suas duas fitas e a formação de um intermediário ramificado, conhecido como alça-D (D-loop, de displacement). A extensão da região de heterodúplex entre a fita invasora e a sua parceira com o concomitante deslocamento da outra fita promove a migração de ramificação, criando uma junção de Holliday. A clivagem (ou resolução) apropriada das fitas das moléculas envolvidas, seja na região da alça-D ou na junção de Holliday, e a ligação das fitas restauram a estrutura da forquilha. Após a finalização do processo de reparação da forquilha de replicação, o replissomo deve ser restaurado para reiniciar a replicação.
As proteínas da família Rec (A, BCD, FOR) fazem parte das enzimas procarióticas envolvidas no sistema de reparo por recombinação homóloga. 
Nos eucariotos a recombinação homóloga é necessária para a segregação adequada dos cromossomos durante a meiose, além de ter várias funções na replicação e divisão celular.
O início da meiose é marcado pelo ponto no qual os cromossomos individuais tornam-se visíveis. Cada um desses cromossomos foi previamente replicado e consiste de duas cromátides-irmãs, cada uma delas contendo um DNA de fita dupla. Os cromossomos homólogos aproximam-se um do outro e começam a parear entre si em uma ou mais regiões, formando os bivalentes. O pareamento se estende até que cada cromossomo esteja unido com o seu homólogo em toda a sua extensão. Esse processo é chamado de sinapse ou pareamento cromossômico. A recombinação entre os cromossomos envolve a troca física de partes, geralmente representada por um evento de quebra seguido por um de religação, na qual duas cromátides não irmãs (cada uma contendo um dúplex de DNA) são quebradas e, depois, ligadas uma à outra (entrecruzamento). Quando os cromossomos começam a se separar eles podem ser mantidos unidos em sítios discretos, os quiasmas.
A recombinação necessita um mecanismo que permita a um dúplex de uma cromátide-irmã interagir com o outro dúplex da cromátide-irmã do outro cromossomo homólogo. O mecanismo utilizado provém da maneira pela qual os ácidos nucleicos reconhecem um ao outro, com base nas suas sequências de nucleotídeos, ou seja, a complementaridade entre as fitas simples.
Muitos dos genes que atuam nos processos de recombinação homóloga em eucariotos são denominados de genes Rad, uma vez que eles foram primeiramente isolados em buscas por mutantes com sensibilidade elevada à irradiação por raios X. Raios X causam quebras nas duas fitas do DNA e, dessa forma, mutantes rad, sensíveis a raios X, também tornam-se deficientes nos processos de recombinação mitóticos ou meióticos.
RECOMBINAÇÃO SÍTIO ESPECÍFICA
A recombinação é limitada a sequências específicas. Reações de recombinação desse tipo ocorrem praticamente em cada célula, ocupando funções especializadas que variam muito de uma espécie para outra. Exemplos incluem a regulação da expressão de alguns genes e a promoção de rearranjos de DNA programados no desenvolvimento embrionário ou nos ciclos de replicação de alguns DNAs virais e de plasmídeos. Cada sistema de recombinação sítio-específico consiste em uma enzima denominada recombinase e em uma sequência de DNA única e curta (20 a 200 pb), onde a recombinase age (o sítio de recombinação). Uma ou mais proteínas auxiliares podem regular o tempo ou o resultado da reação.
Há duas classes gerais de sistemas de recombinação sítio-específicos, que dependem ou de resíduos Tyr ou de resíduos Ser no sítio ativo da recombinase.
As subunidades de recombinase se ligam a uma sequência específica, o sítio de recombinação. Uma fita em cada DNA é clivada em pontos particulares na sequência. O nucleófilo é o grupo –OH de um sítio ativo do resíduo Tyr, e o produto é uma ligação de fosfotirosina covalente entre a proteína e o DNA. Depois da isomerização, as fitas clivadas se ligam a novos parceiros, produzindo um intermediário de Holliday. A sequência original do sítio de recombinação é regenerada depois de recombinar o DNA que flanqueia o sítio. 
Nos sistemas que empregam um resíduo Ser de sítio ativo, ambas as fitas de cada sítio de recombinação são cortadas concomitantemente e religadas aos novos parceiros sem o intermediário de Holliday. Em ambos os tipos de sistemas, a troca é sempre recíproca e precisa, regenerando os sítios de recombinação quando a reação está completa.
O resultado da recombinação sítio-específica depende da localização e orientação dos sítios de recombinação em uma molécula de fita dupla de DNA. A orientação aqui se refere à ordem dos nucleotídeos no sítio de recombinação, não à direção 5’-3’. Se os dois sítios estiverem na mesma molécula de DNA, a reação ou inverte ou exclui o DNA interveniente, determinada pelo fato de os sítios de recombinação apresentarem direção oposta ou a mesma direção, respectivamente.
TRANSPOSIÇÃO DE DNA
Elementos do DNA, chamados de transposons, encontrados praticamente em todas as células, se movem ou “pulam” (“jump”), de um local no cromossomo (o sítio doador) para outro no mesmo ou em um cromossomo diferente (o sítio-alvo). Não é necessária uma sequência de DNA homólogapara esse movimento, denominado transposição; a nova localização é determinada mais ou menos aleatoriamente. A inserção de um transposon em um gene essencial poderia matar a célula, assim a transposição é fortemente regulada e normalmente muito infrequente. Os transposons são, talvez, o mais simples dos parasitas moleculares, adaptados para replicar passivamente dentro de cromossomos de células hospedeiras. Em alguns casos eles transportam genes úteis para a célula hospedeira e, portanto, existem em um tipo de simbiose com o hospedeiro.
As bactérias têm duas classes de transposons. As sequências de inserção (transposons simples) contêm apenas as sequências necessárias para a transposição e os genes para as proteínas (transposases) que promovem o processo. Os transposons complexos contêm um ou mais genes além daqueles necessários para a transposição. Esses genes extras podem, por exemplo, conferir resistência a antibióticos e, portanto, aumentar as chances de sobrevivência da célula hospedeira.
Há duas vias gerais para a transposição em bactérias. Na direta, cortes de cada lado do transposon, o removem, e ele, então, se move para uma nova localização. Isso deixa uma quebra na fita dupla do DNA doador que deve ser reparada. No sítio-alvo, é feito um corte em degrau o transposon é inserido na quebra e a replicação do DNA preenche os espaços para duplicar a sequência do sítio-alvo.
Na replicativa, o transposon inteiro é replicado, deixando uma cópia para trás no local doador. Um cointegrado é um intermediário nesse processo, consistindo em uma região doadora covalentemente ligada ao DNA no sítio-alvo. Duas cópias completas do transposon estão presentes no cointegrado, ambas com a mesma orientação em relação ao DNA. O cointegrado intermediário é convertido em produtos pela recombinação sítio-específica, na qual recombinases especializadas promovem as reações de quebra e união das sequencias.
Os eucariontes também têm transposons, estruturalmente semelhantes aos transposons bacterianos, e alguns utilizam mecanismos de transposição semelhantes. Em outros casos, entretanto, o mecanismo de transposição parece envolver um RNA intermediário. A evolução desses transposons é interligada à evolução de algumas classes de vírus de RNA.
DNA FINGERPRINTING
Dentro de uma espécie, as sequências de nucleotídeos das unidades de repetição que compõem um arranjo em tandem de DNA de sequência simples são altamente conservadas entre os indivíduos. Em contraste, o número de repetições e, portanto, o comprimento dos arranjos em sequência simples que contêm a mesma unidade de repetição, é bastante variável entre os indivíduos. Acredita-se que essas diferenças de comprimento resultem do entrecruzamento desigual entre regiões do DNA de sequência simples durante a meiose. Como consequência dessa passagem desigual, os comprimentos de algumas matrizes em tandem são únicos em cada indivíduo.
Em humanos e outros mamíferos, existe um DNA de sequência simples em regiões relativamente curtas de 1-5 kb, compostas de 20 a 50 unidades de repetição, cada uma contendo 14 a 100 pb. Essas regiões são chamadas de minissatélites, em contraste com microssatélites compostos de repetições em tandem de 1 a 13 pb. Mesmo pequenas diferenças nos comprimentos totais de vários minissatélites de diferentes indivíduos podem ser detectadas por Southern blotting. Esta técnica foi explorada na primeira aplicação de fingerprinting de DNA, que foi desenvolvido para detectar polimorfismos de DNA (ou seja, diferenças no comprimento das repetições em tandem entre indivíduos da mesma espécie). 
Dependendo do tamanho da repetição, as regiões de repetição são classificadas em dois grupos: repetições curtas em tandem (STRs), com repetições de 2-5 pb e, número variável de repetições em tandem (VNTRs) com repetições de 9-80 pb.
O polimorfismo do comprimento de fragmento de restrição (RFLP) e a reação em cadeia da polimerase (PCR) de amplificação de repetições curtas em tandem (STRs) são dois testes principais de DNA amplamente utilizados para a DNA figerprinting. Outros métodos diagnósticos existem, mas faltam exatidão e precisão.
POLIMORFISMO DO COMPRIMENTO DE FRAGMENTO DE RESTRIÇÃO (RFLP)
O RFLP é considerado mais preciso do que o PCR, principalmente pelo tamanho da amostra usada, uso de uma amostra de DNA fresco e nenhuma contaminação de amplificação. O RFLP, no entanto, requer um período mais longo para concluir a análise e é caro. 
O primeiro passo neste processo é isolar o DNA do material de amostra a ser testado. O tamanho da amostra para o teste RFLP deve ser grande o suficiente para obter o resultado adequado. Uma vez que o tamanho requerido da amostra esteja disponível, o DNA é isolado da amostra e é submetido a digestão por restrição usando enzimas de restrição. A amostra de DNA digerido é então separada por eletroforese em gel de agarose, na qual o DNA é separado com base no tamanho. O passo seguinte é a transferência de DNA separado da placa de gel para a membrana de nitrocelulose para hibridar com uma sonda marcada que é específica para uma região VNTR (atividade radioativa marcada como sequência complementar para a sequência nucleotídica da região VNTR). Essa técnica de transferência e hibridização de DNA em membrana de nitrocelulose é conhecida como Southern Blot, uma técnica de detecção de DNA amplamente usada por biólogos moleculares. Após a hibridação com as sondas radioativas, o filme de raios X é desenvolvido a partir do Southern Blot e somente as áreas onde a sonda radioativa se liga aparecerão no filme. Agora essas bandas quando comparadas com as outras amostras conhecidas, vão dar o resultado final do DNA fingerprinting.
AMPLIFICAÇÃO POR PCR DAS REPETIÇÕES CURTAS EM TANDEM (STRs)
Atualmente é o método mais popular. Ao contrário da técnica anterior, essa utiliza a amplificação das STRs, introduzindo a filosofia “menos é mais” no mundo do DNA fingerprinting. Este foi um grande passo em frente na ciência forense desde que o comprimento do fragmento de DNA sendo analisado é curto o suficiente para ser amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) então agora somos capazes de analisar uma amostra muito pequena de DNA que é mais rápida e fácil do que qualquer método previamente conhecido.
Para a amplificação de STRs usando PCR, os iniciadore (primers) são especialmente projetado para se ligar a uma região altamente conservada de DNA que flanqueia o DNA-alvo. Comparando o tamanho da sequência STR amplificado por PCR com as outras amostras conhecidas, dará o resultado final da impressão digital do DNA.
Dentro das aplicações, o DNA fingerprinting pode ser usado na identificação de indivíduos (ciência forense), teste de paternidade/maternidade, diagnóstico de doenças hereditárias (fibrose cística, hemofilia, talassemia, etc.), determinar espécies de achados arqueológicos e etc.
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