Resumo do Artigo - 3 NPC

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Universidade Estadual do Ceará
Faculdade de Veterinária
Histologia e Embriologia Geral Veterinária
Docente: Professora Doutora Janaína Serra Azul Monteiro Evangelista
Resumo do artigo intitulado "Células-tronco neurais adultas da zona subventricular:
uma revisão das células-tronco neurais adultas do ensaio de neuroesfera".
Discentes: Giovanna Mazzini, Isadora Sales, Larissa Costa, Sannaly Clemente e
Vinicius de Morais.
Fortaleza - CE
2022
Introdução
A capacidade de obter um grande número de células capazes de se tornarem neurônios
funcionais representa um grande avanço na medicina regenerativa. A neuroimagem, método
de isolamento, manutenção e expansão dessas células, tem sido amplamente utilizada por
grupos de pesquisa para analisar as propriedades biológicas de célula-tronco neural adulta e
transplantar cérebros lesados a partir do modelo animal. O debate sobre a identidade e
"tronco" das células no mundo neural é revisitado. A fina morfologia dos neurônios, descrita
em detalhes, permite a caracterização fenotípica das células dentro dos neurônios e pode
revelar pequenas alterações que informam indiretamente a integridade geral, integridade das
células, dano celular ou transformação cancerígena.
As células tronco são células que têm a capacidade de se diferenciar em vários tipos celulares
maduros, de se regenerarem e de se multiplicam.
Muitos anos de controvérsia e pesquisa foram necessários para finalmente aceitar que há uma
geração de novos neurônios no cérebro adulto ao longo da vida em todas as espécies de
mamíferos estudadas, incluindo os humanos. Demoraram anos de controvérsia e pesquisa
para finalmente aceitar que há uma nova geração de neurônios no cérebro adulto durante a
vida em todos os mamíferos estudados, incluindo a espécie humana. Essa neurogênese ocorre
em duas regiões do cérebro: a zona subventricular (ZSV ou SVZ do inglês subventricular
zone) e a camada subgranular do giro dentado do hipocampo.
Para entender a regulação dos mecanismos de proliferação, diferenciação e morte celular de
células-tronco neurais adultas (aNSC), foi demonstrado que células progenitoras imaturas
com potencial multifenotípico podem ser isoladas do sistema nervoso central (SNC) de
camundongos adultos e propagadas em cultura. Essas células crescem in vitro como
agregados não aderentes chamados neuroesferas e são capazes de dar origem a neurônios,
astrócitos e oligodendrócitos após a remoção de fatores de crescimento. Desse modo, novas
fontes de células formadoras de neuroesferas foram investigadas e diferentes métodos de
cultura foram desenvolvidos para mantê-las, expandi-las e diferenciá-las.
Por causa de algumas discordâncias em relação ao desenvolvimento in vitro e natureza exata
dessas células, esse estudo irá abordar vantagens e desvantagens do ensaio de neuroesferas,
focando na identidade das células que formam as neuroesferas, na otimização das condições
de cultura e na comparação com células tumorais expandidas, fornecendo uma perspectiva
geral a ser considerada em caso de aplicação futura de células-tronco/ precursoras neurais em
medicina regenerativa.
ENSAIO DA NEUROESFERA COMO UMA FERRAMENTA REPRESENTATIVA
PARA A NEUROGÊNESE ADULTA: Neurogênese no bulbo olfativo e sua relação com
a zona subventricular.
O lobo olfatório se origina da vesícula telecenfálica e
esta pode ser dividida em duas regiões principais: uma
região posterior que compreende o lobo hipocampal
entre outras estruturas, e uma região anterior que
inclui o tubérculo, o pedúnculo e o bulbo olfatório
(BO).
Existem dois períodos de neurogênese no bulbo olfativo: a fase embrionária e a pós-natal
precoce, que é quando um grande número de interneurônios, com seu destino final sendo o
bulbo olfativo, produzidos. Assim, a geração contínua e integração de novos neurônios no
BO durante a vida adulta foi nomeado neurogênese adulta.
A neurogênese adulta ocorre na zona subventricular (SVZ) e o bulbo olfativo no cérebro
adulto. Baseada em características ultraestruturais e na duração do ciclo celular, quatro tipos
diferentes de células foram identificados: astrócitos (células tipo B), células amplificadoras
transitórias (células tipo C), neuroblastos migratórios (células tipo A) e células ependimárias.
As células do tipo B são os precursores primários (células tronco neurais genuínas) que
geram progenitores amplificadores transitórios altamente proliferativo, esses progenitores
irão dar origem a neuroblastos migratórios que finalmente alcançam o BO e se diferenciam
em interneurônios granulares e periglomerulares capazes de se integrar dentro dos circuitos
neuronais estabelecidos.
A neurogênese adulta no BO mamífero foi demonstrada primeiramente em cérebros de
roedores, mas já foi visto em outros animais como coelhos, cachorros, vacas e macacos. Em
humanos, a neurogênese no giro é relativamente aceito, já que ainda discutido até que ponto
os aNSCs residentes geram neuroblastos que migram para o bulbo olfativo. Estudos recentes,
que mediram os níveis de 14C derivado do teste de bomba nuclear no DNA genômico,
relataram que houve uma rotatividade contínua de células não neuronais ao longo da vida,
mas a adição de novos neurônios após o período perinatal em humanos foi mínima ou
inexistente. Isso concorda com os estudos que não detectaram cadeias de neuroblastos
migratórios no pedúnculo olfatório e, até o momento, ainda é desconhecido o destino das
células proliferativas de SVZ.
Células-tronco neurais adultas da zona subventricular: Uma revisão do ensaio de
neuroesfera
Descrição do ensaio da neuroesfera
Devido a sua capacidade de proliferação, autorrenovação e de geração de progênie
multipotencial, células-tronco neurais da zona subventricular (SVZ) adulta foram definidas in
vitro. Células tronco neurais adultas (aNSCs) se desenvolvem in vitro formando aglomerados
chamados de neuroesferas e, dessa forma, o ensaio in vitro foi denominado como "ensaio de
neuroesfera". Esse ensaio tem sido amplamente utilizado para medir e analisar o
comportamento de aNSCs derivados de
SVZ, uma vez que pode avaliar a
proliferação celular, a autorrenovação e o
potencial de diferenciação. O ensaio
consiste em cultivar aNSCs em meio isento
de soro com fatores de crescimento
mitogênico em um substrato não adesivo.
(Fig.2).
Sob condições ideais, uma única
célula-tronco receptiva ou célula
progenitora é capaz de gerar uma
neuroesfera após várias divisões celulares. As neuroesferas crescem como estruturas esféricas
tridimensionais flutuantes, consistindo de centenas a milhares de células. O número de
células se correlaciona com o tamanho das neuroesferas e com os dias de cultivo in vitro. No
caso do ensaio da neuroesfera, a autorrenovação é a capacidade de uma única célula formar
neuroesferas subclonadas. Por fim, ocorre a adesão ao substrato e a diferenciação em
neurônios, astrócitos e oligodendrócitos, ao remover os fatores de crescimento do meio na
presença de soro.
O ensaio de neuroesfera é uma excelente ferramenta para obter e expandir derivados de
aNSCs para testar suas propriedades em diferentes condições ou mesmo para fornecer uma
fonte de células para substituição e/ou neuroproteção após lesão.
Apenas neuroesferas cultivadas por curtos períodos de tempo devem ser usadas para pesquisa
ou aplicações clínicas, pois quando elas são recultivadas por mais de 10 passagens, suas
propriedades biológicas podem sofrer alterações
adquirindo, em alguns casos, fenótipos tumorais ou,
pelo menos, apresentando instabilidade
cromossômica progressiva. Assim,
Coles-Takabe et al. questionaram a clonalidade do
ensaio de neuroesfera cultivando misturas de
células neurais marcadas de forma diferente,
observando a proliferação de células neurais únicas
usando microscopia de vídeo e encapsulando NSCs
únicos e sua progênie. O clone possui uma
composição celular heterogênea, uma mistura de
células-tronco, progenitoras e células diferenciadas
em diferentes fases do ciclo celular dispostas em
um complexo tridimensional organizado pela matriz
extracelular (Fig. 3). Variáveis,incluindo idade, densidade de semeadura, condições de
cultura e número de passagens celulares, influenciam a homogeneidade ou heterogeneidade
na composição celular dentro da neuroesfera.
Potenciais aplicações clínicas para neuroesferas
As células derivadas do ensaio de neuroesferas têm aplicações potenciais na terapia celular
em várias doenças neurológicas que carecem de um tratamento médico eficaz.
Embora, o ensaio de neuroesferas não permita estudar a população de células-tronco de
boa-fé, tem sido muito útil para analisar o efeito global de moléculas terapêuticas no processo
neurogênico ou para entender a função de deletar/overex genes pressionados que poderiam
regular a proliferação e auto-renovação dessas populações mistas de
células-tronco/progenitoras. Células geneticamente modificadas poderiam ser usadas para
produzir proteínas específicas para melhorar a recuperação neuronal, como o fator
neurotrófico derivado do cérebro (BNDF), ou para bloquear proteínas específicas envolvidas
no dano neuronal. Os progenitores expandidos in vitro modificados também podem se
comportar como um “cavalo de Tróia” para fornecer drogas ou iRNA e prevenir a progressão
da neurodegeneração, como nas doenças de Alzheimer ou Parkinson.
Um grande número de células pode ser obtido após isolamento e expansão de células
derivadas de SVZ em meios enriquecidos com fatores de crescimento. As células podem ser
criopreservadas para uso posterior. Em termos de medicina regenerativa, poderíamos
acreditar que a natureza e a identidade das células obtidas após a expansão in vitro são
inconsequentes, desde que as células sejam capazes de se integrar, substituir a função do
tecido lesado e permanecer seguras para o receptor por muito tempo. No entanto, essa não é
uma abordagem correta, e esses e outros são problemas a serem superados para tornar a
medicina regenerativa uma realidade terapêutica:
● Para obter grandes quantidades de células para terapia humana, células de outros
indivíduos podem ser obtidas, mas a rejeição imunológica após o transplante de
enxertos alogênicos expandidos deve ser antecipada e tratada.
● Estudos de longo prazo em modelos animais devem ser realizados para prever o
potencial oncogênico de células tronco estimuladas artificialmente.
● As células transplantadas estão longe das aNSCs fisiológicas no nicho neurogênico:
as aNSCs são isoladas, expandidas com altos requisitos de fatores de crescimento e
selecionadas para um fenótipo progenitor altamente proliferativo.
● Heterogeneidade nas condições de cultura.
Meios de Cultura e Otimização do Ensaio de Neuroesfera
A cultura da neuroesfera é realizada em meio isento de soro em placas não tratadas.
Componentes desconhecidos do soro e o tratamento das placas favorecem irreversivelmente a
diferenciação das células-tronco neurais e impedem sua autorrenovação. Portanto, foram
desenvolvidas modificações na cultura celular na ausência de soro, e um meio definido foi
utilizado associando a adição de suplementos. É também crucial a disponibilidade de fatores
de crescimento recombinantes, particularmente fator de crescimento epidérmico (EGF) e
fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), separadamente ou em combinação,
permitindo a manutenção de um estado indiferenciado e a indução da proliferação celular
(Reynolds e Weiss, 1992). A remoção desses mitógenos induz a diferenciação. Cada fator
desempenha um papel diferente e significativo na formação das neuroesferas e isso deve ser
observado para a interpretação dos dados. Hormônios e outros micronutrientes são
necessários para a cultura da neuroesfera. A insulina tem propriedades neurotróficas e
aumenta a proliferação de células progenitoras (Aberg et al., 2000). A putrescina é uma
amina de baixo peso molecular que fornece neuroproteção ao estabilizar as membranas
celulares e o material nuclear e é necessária para o crescimento e a replicação. O selênio é um
antioxidante que atua como cofator na produção de glutationa. Em relação ao método de
desagregação, o método menos agressivo é a desagregação mecânica. Este método não é o
mais adequado para um estudo clonal porque não oferece a garantia de que as neuroesferas
foram completamente fragmentadas em células individuais. O método enzimático atinge
melhor esse objetivo. Existem várias enzimas que quebram as neuroesferas, mas as mais
comumente usadas são tripsina e AccutaseVR (Millipore, Billerica, MA). A manipulação da
concentração de O2 durante o ensaio da neuroesfera pode ser um método simples e método
barato para aumentar a proliferação celular e promover a diferenciação neuronal, como foi
proposto recentemente. Mudanças na concentração de O2 no ambiente para produziram um
aumento na proliferação de células-tronco neurais e menor suscetibilidade à apoptose (Chen
et al., 2007), resultando em um aumento no número de progenitores neuronais. Condições
hipóxicas moderadas também aumentaram o fenótipo neuronal de células-tronco neurais in
vivo, em modelos animais de AVC isquêmico (Felling et al., 2006). As células-tronco neurais
de cérebros em hipóxia perinatal proliferaram mais e exibiram com mais frequência divisões
simétricas com comportamento multipotencial. Essas neuroesferas derivadas de
células-tronco neurais expressaram marcadores de precursores multipotentes imaturos
(nestina), mas não marcadores de neuroblastos
Caracterização Fenotípica do Neuroesfera
Em uma neuroesfera, é fundamental analisar os marcadores moleculares disponíveis,
expressão gênica e/ou funções biológicas que caracterizam distintamente cada população
celular.
Marcadores moleculares: Células-tronco neurais são as células mais primordiais e menos
comprometidas do sistema nervoso. Eles dão origem a células mais especializadas em todo o
SNC. Essas células não expressam os marcadores moleculares de diferenciação de neurônios,
astrócitos e/ou oligodendrócitos. Tipos celulares que foram classificados em diferentes
estudos como progenitores (amplificadores de trânsito, neuroblastos,
precursores gliais) e NSCs não comprometidos podem, de fato, provir do mesmo tipo de
célula ou, em alguns casos, constituir um grupo heterogêneo de células em proliferação. Com
base em marcadores moleculares, podemos apenas distinguir os três tipos de células em
neuroesferas derivadas de SVZ de camundongos adultos que também estão presentes no
nicho neurogênico in vivo: (1) astrócitos ou células do tipo B (expressando GFAP, GLAST ,
CD133 entre outros;; (2) células do tipo C que são positivas para Dlx, positivas para Sox2 e
positivas para Olig2; (3) e células do tipo A bem caracterizadas pela expressão de
beta-III-tubulina (Tuj1).
Abordagens baseadas em expressão gênica: Vários grupos de pesquisa, na tentativa de
caracterizar o compartimento células-tronco neurais, têm realizado estudos de expressão
gênica. O ensaio de neuroesfera fornece uma grande quantidade de células para esses estudos,
mas, ao mesmo tempo, a identidade de células-tronco neurais é confusa. Nesse sentido, um
dos principais problemas dessas
abordagens é a obtenção de uma
pureza adequada das populações de
células estudadas, prejudicada dentro
de um “mesmo tipo de célula”, pela
variabilidade das condições de cultivo
ou pelo estado distinto de
diferenciação. No ensaio da
neuroesfera, células verdadeiramente
indiferenciadas (ou seja, células-tronco neurais que podem cumprir a definição operacional in
vitro e, mais importante, in vivo) representam apenas uma pequena porcentagem das células
dentro das neuroesferas.
Função biológica: Os padrões de expressão
gênica podem variar, mas uma lista de pré-
requisitos comuns (em termos de expressão de proteínas) deve ser cumprida: (1) A
capacidade de resposta a fatores de crescimento (expressão de receptores) como EGF, FGF-2,
EPO, G -CSF, VEGF, LIF, TGF-b, NGF, bem como a neurotransmissores como glutamato,
GABA ou óxido nítrico; (2) O uso de cascatas de sinalização de desenvolvimento, incluindo
Shh, Pax, Hox, Wnt, Notch/Delta, TGF-b, NF kappa B ou JAK/STAT; (3) A interação com a
matriz extracelularpor meio de proteínas de interação célula-célula, como integrinas e
caderinas; (4) A expressão de genes reguladores da transcrição e tradução responsáveis pela
mudança do fenótipo celular de sua forma indiferenciada para as novas exigências funcionais
de uma célula-tronco diferenciada; (5) Os mecanismos para controlar o número de células e
proteger contra o estresse celular. Uma vez que todos os pré-requisitos estão presentes, a
célula possui as ferramentas biológicas necessárias para proliferar, autorrenovar e diferenciar,
independentemente.
Morfologia de neuroesferas derivadas de SVZ
A seguir, descrevemos as principais características morfológicas das neuroesferas e, para
isso, apresentamos uma revisão da literatura. Seis camundongos machos CD1 de 2 meses de
idade foram sacrificados e SVZ foram dissecados.
Organização Histológica: Ao microscópio de contraste de fase, as neuroesferas saudáveis
aparecem brilhantes em todo o seu volume. No entanto, as neuroesferas com um tamanho
superior a 200 mm de diâmetro têm uma região escura central ou núcleo. Esta região se
correlaciona com uma área com alta taxa de morte celular. Assim, fica evidente que as
alterações morfológicas podem ser imperceptíveis no microscópio de sala de cultura. Nas
ampliações de 403 a 1003 no microscópio de luz os núcleos eram redondos com invaginações
ocasionais e cromatina dispersa. Esses núcleos continham 1 ou 2 nucléolos típicos. As células
não estavam completamente ligadas às suas vizinhas. Sinais evidentes de morte celular e
ruptura foram observados no núcleo das neuroesferas
relacionadas a núcleos apoptóticos. Núcleos mitóticos
foram frequentemente distribuídos na periferia da
neurosfera. Sob transmissão EM, observamos
neuroesferas compostas por células que não exibem as
características ultraestruturais típicas de neurônios,
células gliais ou ependimárias. Embora na literatura
relacionada alguns grupos de pesquisa classifiquem as
células nas neurosferas em células eletrolucentes ou
eletrodensas, pelo menos em camundongos, não
conseguimos diferenciar entre esses dois tipos de
células. Essas células podem corresponder a um mesmo
tipo celular em um estado de transição de constantes
mudanças morfológicas e moleculares.
O citoplasma dessas células continha cisternas de retículo endoplasmático (RE) que se
organizavam em paralelos, pequenos dictiossomos compostos por quatro a seis cisternas e
geralmente associados a vesículas revestidas por clatrina. Além disso, o citoplasma
apresentava contorno irregular, circundando células em contato nas proximidades através de
junções aderentes. Gotículas lipídicas foram observadas dentro do citosol, sendo
frequentemente encontradas dentro das figuras mitóticas indicando que as condições de
cultivo podem variar a atividade metabólica de células. Em geral, os núcleos eram irregulares
e apresentavam reentrâncias profundas, cromatina dispersa com alguns aglomerados de
cromatina densa e grandes nucléolos reticulados. Um achado surpreendente foi a presença de
cisternas dispersas de lamelas anulares, estruturas membranosas contendo de um a cinco
complexos de poros. Essas estruturas foram descritas especialmente em células tumorais e
nos astrócitos SVZ de aves, mas nunca em neuroesferas. As neuroesferas com um diâmetro
variando de 100 a 200 mm de diâmetro exibiram um núcleo central com células apoptóticas e
detritos. Mesmo em condições ideais, as neuroesferas mostram sinais de envelhecimento
celular e, finalmente, morte celular. Esses sinais aumentam à medida que nos afastamos das
condições ótimas de cultivo A presença e o tamanho do núcleo se correlacionam com o
tamanho da neuroesfera, ou seja, com a distância entre as células e o meio. Provavelmente, o
gatilho para a morte celular (apoptote ou necrose) pode ser a falta de difusão de nutrientes e
oxigênio. Uma descoberta interessante neste estudo foi que apenas sob condições
desfavoráveis, as células mais externas da neurosfera morreram antes das do núcleo, como
um sinal de condições externas não ideais.
Analisando neuroesfera transformadas
Quando isolamos aNSCs e as expandimos in vitro, estamos estimulando células com
propriedades de proliferação e autorrenovação, para que se dividam mais rapidamente e
mantenham o estado indiferenciado. Essa é uma das preocupações ao transplantar aNSCs e
progenitores expandidos in vitro, a possibilidade de transformação oncogênica, gerando
tumores neurais no receptor. Ademais, muitos estudos propuseram aNSCs como células de
origem do glioma. Um estudo do grupo que produziu o artigo mostrou que aNSCs na SVZ de
camundongos p532/2 apresentaram uma vantagem proliferativa, aumentaram a
autorrenovação e após um segundo insulto carcinogênico (neste caso, embriões expostos a N
etil-N-nitrosurea) adotaram um fenótipo imaturo incapaz de se diferenciar em células neurais
mais maduras.
Isso levou à formação de tumores semelhantes a gliomas na SVZ. Além disso, foi
demonstrado que NSCs e células tumorais cerebrais compartilham a expressão de certos
marcadores moleculares. É o caso do CD133 para isolar células precursoras formadoras de
neuroesferas do cerebelo fetal de camundongo e
prosencéfalo. Células no glioblastoma multiforme
(GBM) enriquecidas com CD133 expressaram
marcadores de células tronco neurais e foram capazes de
diferenciar multilinhagem in vitro e in vivo.
Notavelmente, a expressão de CD133 também pode ser
detectada em uma subpopulação relativamente pequena
de células de tumores cerebrais que se pensava serem as
células iniciadoras de tumores cerebrais humanos.
Portanto, uma breve revisão da morfologia das
tumoresferas derivadas de GBM em comparação com as
neuroesferas derivadas de SVZ fornecerá informações
adicionais para evitar que os pesquisadores transplantem
neuroesferas aberrantes/ atípicas. Dessa forma a análise ultraestrutural de espécimes de
glioblastos de dois pacientes adultos foi realizada. Uma vez analisadas, as tumoresferas
derivadas de GBM foram morfologicamente distinguíveis das neuroesferas derivadas de SVZ
adultas, permitindo sua identificação à “primeira vista”.
As tumoresferas de GBM foram densamente compactadas e misturadas através de longas
expansões citoplasmáticas. Nenhuma das células nas esferas tumorais tinha características
clássicas e distintas de tipos gliais maduros, neuronais ou ependimários. Estas células
apresentavam sinais de “fragmentação” a todos os níveis celulares (mitocôndrias,
membranas, vesículas...). Consideramos que a maioria dessas células pode corresponder a
células em processo de morte, e não a um tipo celular diferente. Apesar da evidência de morte
celular, as esferas de GBM não tinham um núcleo, em comparação com as neuroesferas não
tumorais. Podemos concluir que houve diferenças suficientes entre esferas de GBM e
neuroesferas derivadas de SVZ que nos permitiriam distinguir a transformação in vitro de
aNSCs expandida.
Discussão e considerações finais
O ensaio de neuroesfera é uma ferramenta potencial para expandir aNSCs e progenitores para
obter grandes quantidades de células para usá-los em pesquisa básica ou terapia de
substituição. A este respeito, esta é uma técnica inestimável. No entanto, é muito importante
ter em mente as limitações deste procedimento para evitar interpretações errôneas e,
simultaneamente, melhorar a técnica para alcançar os resultados mais otimizados e
reprodutíveis.
Esse ensaio tem sido amplamente utilizado em pesquisas nas últimas décadas, mas
ultimamente, têm sido descritos nichos neurogênicos emergentes que são, ao mesmo tempo,
novas fontes potenciais de neuroesferas para fins de pesquisa. Embora essas regiões tenham
células-tronco com requisitos únicos de ativação in vitro, foi demonstrado que essas células
também se auto-renovam e geram progênie diferenciada de oligodendrócitos, astrócitos e
neurônios. Uma dessas regiões é o hipotálamo, envolvido na regulação do sistema
neuroendócrino. Está localizado próximo ao terceiro ventrículo, revestido por tanicócitos e
células ependimárias multiciliadas. Seu papel na neurogêneseainda permanece controverso,
mas evidências recentes revelam a produção de novos neurônios durante a idade adulta. Os
tanicócitos são considerados os principais candidatos a serem responsáveis pela geração de
novos neurônios no hipotálamo. Essas células mantêm características da glia radial ao longo
da idade adulta e exibem um cílio primário semelhante ao SVZ-aNSC. Após a lesão, os
tanicócitos proliferam e novos neurônios se integram na área danificada. Neuroesferas
multipotenciais, capazes de autorrenovação, foram isoladas com baixa taxa de crescimento
basal, talvez devido a uma natureza quiescente.
Já outra região onde residem as células-tronco é o giro denteado do hipocampo, mas há uma
controvérsia se as células-tronco multipotentes no SGZ são capazes de autorrenovação e
diferenciação em progenitores gliais e neuronais ou apenas dão origem a colónias pequenas,
unipotentes e não autorrenováveis que SGZ contém clones gliais e neuronais separados,
sendo os progenitores gliais os mais proliferativos em cultura. Neste caso, uma explicação
para trabalhos anteriores em que foram obtidas células auto-renováveis e multipotenciais
pode ser a falta de uma técnica de dissecação refinada ou a ausência de uma análise clonal
rigorosa.
Outra fonte interessante de aNSCs para medicina regenerativa é o OB. Precursores
neurais/células-tronco foram isolados em camundongos e OB humana. Devido à sua
capacidade de autorrenovação e de diferenciação em relação ao fenótipo neuronal, as NSCs
de bulbo olfativo humano adulto fornecem uma ferramenta atraente para terapias baseadas
em transplante em doenças neurogenerativas que evitam as questões éticas levantadas pelo
uso de embriões humanos. A possibilidade de obtenção de aNSCs do próprio paciente com
cirurgia mínima também supera a questão da disponibilidade e rejeição imunológica,
indicando uma direção a seguir para futuras aplicações clínicas.
No entanto, independente da fonte, as células a serem transplantadas devem ser cultivadas em
condições ideais para melhorar os resultados neurológicos. Existem muitos aspectos a serem
levados em consideração para otimizar a cultura da neuroesfera e a adesão a protocolos
padronizados é necessária,portanto, para comparar resultados de diferentes grupos.
Por fim, poderíamos então descrever o fenótipo da neurosfera basicamente na morfologia?
Embora os critérios ultraestruturais tenham sido muito úteis na caracterização in vivo das
populações SVZ, ao analisar as neuroesferas, esses critérios não são tão operativos. Isso se
deve em parte ao estado indiferenciado das células, hiperestimuladas com fatores de
crescimento, mas também a uma seleção clonal em direção a uma população única em
proliferação ativa. No entanto, a EM pode ser uma abordagem útil para caracterizar o estado
fisiológico da célula, espelhado na observação grosseira da morte celular, ou mesmo em
pequenas alterações morfológicas em diversas organelas celulares todos sensíveis a condições
de cultura.
Nesse viés, medindo a quantidade de vacúolos, lisossomos e assim por diante, podemos
avaliar a saúde da célula a ser transplantada que provavelmente influenciará na enxertia.
Além disso, um achado interessante foi a presença de lamelas anulares, estruturas idênticas às
membranas celulares no citoplasma celular relacionadas à membrana nuclear e ao RE.
Exemplos bem desenvolvidos de lamelas anulares são vistos com mais frequência em células
de crescimento rápido ou em diferenciação e raramente são vistos ou não são vistos em
neoplasias benignas e células normais. Sua função ainda é desconhecida, mas pode estar
relacionada à alta atividade proliferativa. Assim, as organelas podem desempenhar um papel
como biossensores e, finalmente, essas características morfológicas podem ser relevantes no
transplante de células, prevendo a sobrevivência do enxerto, funcionalidade ou detecção de
transformação oncogênica.